專利名稱：挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法。
背景技術：
隨著人類基因組測序工作的基本完成，功能基因組學的研究更顯重要，而基因表達調控是功能基因組學的一個重要研究領域。(郭曉強，郭爭亮.真核生物轉錄機理的結構基礎.生物學通報，2006,41(11) :60-61)細胞基因的表達，即由DNA轉錄成RNA再翻譯成蛋白質的過程，是受到嚴格的調節控制的。在細胞的生長、發育和分化過程中，遺傳信息的表達可按一定時間程序發生變化，而且隨著細胞內外環境條件的改變而加以調整，這就是時序調控和適應調控。其中，轉錄水平的調控是關鍵的環節，因為遺傳信息的表達首先涉及到的是轉錄過程。·轉錄調控主要發生在起始和終止階段。啟動子是轉錄起始的控制部位，它是指RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。RNA聚合酶起始轉錄需要的輔助因子(蛋白質)稱為轉錄因子，它的作用或是識別DNA的順式作用位點，或是識別其他因子，或是識別RNA聚合酶。實際上，基因表達調控是細胞對外部或內部刺激發生應答的方式，涉及基因組DNA和一系列結合蛋白的相互作用。不同生理條件下特異性的基因轉錄調控依賴于不同的反式作用因子與順式作用元件的特異性結合。因此，深入研究基因表達調控的分子機制，必須要研究DNA-蛋白質的相互作用，即需要明確哪些轉錄因子與哪些基因的轉錄調控區域發生了特異性結合° (BrivanlouA H, Damell J E Jr. Signaltransduction and the controlof gene expression. Science, 2002, 295 (5556) :813-818)建立有效的研究方法可以大大促進該領域的研究。蛋白分子與啟動子DNA的結合具有特異性，這是研究啟動子DNA結合蛋白的前提。目前研究DNA與蛋白相互作用的常見方法有DNaseI足紋法(DNaseI footpriting)、酵母單雜交系統(Yeast One-Hybrid System)、凝膠阻滯試驗(gel retardation assay)等。但上述方法都有一定的局限性。DNaseI法只是針對某一特定蛋白與核酸互作，或是某一特定短核酸序列與蛋白互作的研究，因此獲得的只是某個單一的核酸片段或單一的蛋白；而酵母單雜交系統同樣是研究細胞內蛋白質與DNA的特定序列間的相互作用，但一次只能研究特定基因的一個啟動因子；而凝膠阻滯試驗則是一種定性研究蛋白與基因互作的方法，但無法確定具體的蛋白。因此，亟待開發出新的工具和技術手段來研究DNA與蛋白的相互作用。從而從轉錄水平上研究基因表達的調節，尋找新的蛋白并了解其對轉錄調節的作用，為闡明某些疾病的發病機制及基因治療奠定了基礎
發明內容
本發明旨在針對現有研究DNA與蛋白相互作用的方法中存在的不足，提供一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的新方法。為了實現本發明目的，本發明的一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法，包括以下步驟I)將5’或3’端帶有生物素的啟動子序列或其片段與表面吸附有鏈親和素的磁珠結合，形成磁珠-啟動子二元復合物；2)分別從處于不同生長、發育或分化階段的細胞或組織中提取核蛋白，然后分別將這些特定時期的核蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合，從而形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物；3)對步驟2)中得到的三元復合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，找出差異條帶，以確定所要候選目的蛋白的片段長度，然后進行二維電泳分離提純目的蛋白，并對純化的目的蛋白進行質譜分析或氨基酸測序，從而確定所含蛋白。·優選地，所述步驟2)為分別從處于不同生長、發育或分化階段的細胞或組織中提取核蛋白，并分別將這些特定時期的核蛋白與能夠競爭性封閉所述啟動子序列或其片段上非特異性蛋白結合位點的蛋白混合，然后分別將這些混合好的蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合，從而形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物。其中，能夠封閉所述啟動子序列或其片段上非特異性蛋白結合位點的蛋白為BSA蛋白或脫脂奶粉。此外聚核苷酸競爭物、鮭精DNA等也可以提高雜交的特異性。本發明是基于DNA-蛋白質相互作用的原理，結合生物素-鏈親和素系統、磁珠分離技術開發出一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法。生物素-鏈親和素系統是近幾年來應用廣泛的一門生物學技術，二者以超強的非共價鍵特異性結合，且這種結合高度穩定；二者都可以耦聯蛋白質、核酸、糖和酶等生物活性物質，一個蛋白質(或核酸等)分子上可結合多個生物素分子，而一個親和素又可結合4個生物素，因而兩者的結合具有多級放大作用。(張曉春，陸燕蓉.生物素-親和素技術的研究進展.現代預防醫學，2001，28 (4) =485-486,494)1979年，John Ugelstad等人開發出一種生產大小一致的多聚體微球的技術。通過此項技術,可生產出直徑為I. 5 100 μ m、結構對稱的多聚體微球。現在將這種采用復合順磁物質制成的小球命名為Dynabead。它具有以下特點(I) Dynabead是由Y Fe2O3和Fe3O4磁性材料合成的均一、超順磁、單發散性多聚微球。每個微球體包被一層多聚材料，作為吸附和結合各種分子的載體。(2)Dynabead形狀和大小的均一性保證了微球表面物理化學性質的一致，而高質量結果的獲得和結果的可重現性是建立于它的這些特性上的。(3)Dynabead形狀和大小的均一性為其本身與靶物質之間提供最佳的反應動力學,這就大大方便了它們之間快速、高效的結合。在許多情況下，僅需10分鐘就可完成結合過程。(4)它的球形、確定的表面減少了化學粘附和非特異性結合。(5)均一的微球表面保證了目標探針的有效使用和最佳結合。(6)Dynabead的多聚外殼可保證祀物質免遭鐵離子的破壞。Dynabead是超順磁，它們能夠在磁場中表現出磁性而在無磁場時無磁性。(7)不同的Dynabeads類型特殊的親水和疏水特性能促進分子結合到它們的表面上。本發明的方法中使用的磁珠優選為Dynabead，或由其它具有吸附生物素特性的且不會影響到祀物質結構的材料制成。
本發明根據DNA-蛋白質相互作用的原理，將生物素-鏈親和素系統與磁珠分離技術相結合，提供一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的新方法。新基因、新蛋白質的發現和鑒定以及它們之間相互作用的研究將賦予分子生物學以永不衰竭的生命力，為從轉錄水平上研究基因表達的調節，尋找新的蛋白并了解其對轉錄調節的作用提供了新思路，并為進一步闡明某些疾病的發病機制及基因治療奠定了基礎。采用本發明的方法不僅能夠將與核酸片段互作的蛋白分離出來，更為重要的是能夠一次性獲得生長、發育或分化等某一特定狀態下調控特定基因表達的蛋白群，并且最終通過質譜顯示出在該條件下調控該基因表達的圖譜。
圖I為構建得到的Myog啟動子熒光素酶表達載體的結構示意圖。圖2PCR反應擴增Myog啟動子后的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中，I為含生物素的目的片段，3為不含生物素的目的片段，2和4為陰性對照，M為DNAMarker。圖3為本發明三元復合物的SDS-PAGE結果，其中I為蛋白Marker，2為分化前總 蛋白，3為分化前核蛋白+磁珠+含生物素的啟動子，4為分化前核蛋白+磁珠+不含生物素的啟動子(陰性對照)，5為分化后總蛋白，6為分化后核蛋白+磁珠+含生物素的啟動子，7為分化后核蛋白+磁珠+不含生物素的啟動子(陰性對照)。圖4為本發明的實施例挖掘C2C12細胞分化過程中myog基因的轉錄調控蛋白的流程示意圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例挖掘C2C12細胞分化過程中myog基因的轉錄調控蛋白包括以下步驟I.模板的構建參照NCBI公布的Myog序列，提取長白豬基因組作為模板，擴增并構建了 Myog啟動子熒光素酶表達載體。引物序列F:5，-TAGGGTAAGTGGGATTGAGTC-3，R:5，-CAGGTCGGAAAAGGCTTG-3’PCR 體系緩沖液2.5μ1
dNTP2.5 μ
引物F0.5μ1
引物R0.5μ1
模板Ιμ
Taq_0.5μ1 (50U)
CidH2O 17.75μ!
PCR 條件945min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 2min 30s, 30 個循環；72°C 7min ；4°C存放15min。采用PCR方法得到Myog基因翻譯起始位點上游約2. 4kb的基因片段，構建T載體并進行酶切和測序；然后用限制性內切酶Nhe I和Xho I雙酶切上述片段，并克隆至PGL3-Basic熒光素酶報告基因載體上。獲得的Myog啟動子熒光素酶表達載體的結構如圖I所示。2.以步驟I構建得到的表達載體為模板進行PCR反應，特異性擴增Myog啟動子，所使用的下游引物5’端帶有生物素。擴增后回收2400bp左右的片段(圖2)。引物序列F:5，-TAGGGTAAGTGGGATTGAGTC-3，R:5，-CAGGTCGGAAAAGGCTTG-3’PCR 體系
緩沖液 2.5μ1 dNTP 2.5μ1 引物F 0.5μ1 引物R 0.5μ1 模板Ιμ
TaqSI 0.5μ1 (50U)
CldH2O17.75μΙPCR 條件945min ；94°C 30s,60°C 30s, 77 L min 30s, 30 個循環；72°C 7min ；4°C存放15min。3.將下游含有生物素的啟動子序列與表面結合有鏈親合素的磁珠Dynabead(Dynabeads kilobaseBINDER Kit, Invitrogen) 40 μ I (400 μ g)與 IOpmol 啟動子序列結合，形成磁珠-啟動子二元復合物。4.分別提取分化前和分化后的小鼠C2C12細胞中的核蛋白。采用Nuclear-Cytosol Extraction Kit (北京普利萊基因技術有限公司)提取核蛋白。5.將3%牛血清白蛋白(BSA)6 μ g分別與分化前的細胞核蛋白和分化后的細胞核蛋白210 μ g混合，然后與上述二元復合物結合。BSA蛋白起到封閉啟動子上非特異性蛋白結合位點的作用。6.分別將步驟4混合好的蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合(相當于核蛋白210 μ g和IOpmol磁珠-啟動子二元復合物的比例),形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物。7.將步驟5的兩組(即分化前和分化后)三元復合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，找出差異條帶(圖3)。確定所要候選目的蛋白的片段長度。然后進行二維電泳分離提純目的蛋白。8.對差異條帶進行質譜，確定其中的蛋白成分，并進一步通過與小鼠基因對比，分析出可能的基因和mRNA序列。圖4為本發明的實施例挖掘C2C12細胞分化過程中myog基因的轉錄調控蛋白的·流程示意圖。目前對轉錄水平的研究，是通過對某特定細胞(如肝臟細胞)的某一特定狀態下(如生長期)全部表達的蛋白或mRNA水平(稱為轉錄組)的研究。而本發明是針對在特定細胞(如肌肉細胞)的某一特定狀態下(如生長期)，某個特定基因(如本例中的MyoG)具體受到哪些蛋白因子調控的研究。換言之，該基因之所以表達(或關閉)，是因為某些蛋白(核蛋白)與啟動子的特定部分結合(或解離)而導致了該基因的啟動(或關閉)表達。由于與該基因啟動子結合的蛋白因子是調控該基因轉錄的一組蛋白核因子，因此稱之為轉錄調控組。通過改變某個基因在多種狀態下的調控組進行比較，即可以知從A狀態(生長/發育狀態)到B狀態(分化狀態)，控制該基因轉錄水平的調控組的變化，最終闡述基因的調控機制。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將5’或3’端帶有生物素的啟動子序列或其片段與表面吸附有鏈親和素的磁珠結合，形成磁珠-啟動子二元復合物； 2)分別從處于不同生長、發育或分化階段的細胞或組織中提取核蛋白，然后分別將這些特定時期的核蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合，從而形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物； 3)對步驟2)中得到的三元復合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，找出差異條帶，以確定所要候選目的蛋白的片段長度，然后進行二維電泳分離提純目的蛋白，并對分離純化的目的蛋白進行質譜分析或氨基酸測序，從而確定所含蛋白。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)為分別從處于不同生長、發育或分化階段的細胞或組織中提取核蛋白，并分別將這些特定時期的核蛋白與能夠封閉所述啟動子序列或其片段上非特異性蛋白結合位點的蛋白混合，然后分別將這些混合好的蛋白與磁珠-啟動子二元復合物結合，從而形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，能夠封閉所述啟動子序列或其片段上非特異性蛋白結合位點的蛋白為BSA蛋白或脫脂奶粉。
全文摘要
本發明提供了一種挖掘真核生物基因轉錄調控組差異蛋白的方法，首先將5’或3’端帶有生物素的啟動子序列或其片段與表面吸附有鏈親和素的磁珠結合，形成磁珠-啟動子二元復合物，然后從組織或細胞中提取特定時期的核蛋白，與磁珠-啟動子二元復合物結合形成磁珠-啟動子-核蛋白三元復合物，對該三元復合物進行SDS-PAGE分析，找出差異條帶，以確定所要候選目的蛋白的片段長度，然后進行二維電泳分離提純目的蛋白，并對純化的目的蛋白進行質譜分析，從而確定所含蛋白。為從轉錄水平上研究基因表達的調節，尋找新蛋白并了解其對轉錄調節的作用提供了新思路，并為進一步闡明某些疾病的發病機制及基因治療奠定了基礎。
文檔編號C07K1/00GK102887938SQ20121034828
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年2月28日
發明者孟慶勇, 王萌, 高婧, 李寧 申請人:中國農業大學