專利名稱：生產l-氨基酸的微生物和生產l-氨基酸的方法
技術領域：
本發明涉及通過使用微生物進行發酵來生產L-氨基酸的方法。特別地，本發明涉及生產L-氨基酸，例如L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸的方法。這些是工業上有用的L-氨基酸。換句話說，L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸作為動物飼料添加劑、健康食品的成分和氨基酸注射液是有用的。L-精氨酸和L-鳥氨酸作為肝功能促進劑、氨基酸輸注液和全面氨基酸制品的成分是有用的。L-組氨酸作為肝功能促進劑和作為組胺的前體是有用的。L-苯丙氨酸作為甜味劑的前體是有用的。
背景技術：
L-氨基酸通過使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)等的微生物進行發酵來工業化生產。已經在EP 0857784A、JP 11-192088A、W000/53726 和 TO96/17930 中報道了生產L-賴氨酸的方法。已經在EP 0999267A, EP 1170358A和JP 2002-017342A中報道了生產L-精氨酸的方法。在這些報道的方法中，使用了產生堿性L-氨基酸的細菌菌株，包括從其天然或人工突變的菌株、和具有堿性L-氨基酸生物合成酶的增強活性的重組菌株分離的菌株。此外，也已經報道了使用屬于嗜甲基菌屬(Methylophilus)或甲基菌屬(Methylobacillus)的突變的或遺傳修飾的微生物菌株來從甲醇生產L-氨基酸的方法(W000/61723和JP 2001-120269A)，甲醇用于發酵是可以低成本大量地獲得的。修飾細菌細胞中L-氨基酸的攝取和輸出的方法是公知的，用來改善所述細菌的L-氨基酸生產能力。修飾L-氨基酸攝取的方法包括消除或降低L-氨基酸攝取進入細胞來增強L-氨基酸生產能力。特別地，這些方法包括刪除gluAB⑶操縱子或其部分以消除或減弱L-谷氨酸攝取的方法(EP 1038970A)。修飾輸出體的方法包括消除或降低L-氨基酸生物合成的中間體或底物的輸出，和增強生產的L-氨基酸的輸出的方法。對于消除或降低L-谷氨酸生物合成的中間體輸出的方法，突變或破壞α-酮基戊二酸通透酶基因以減少α-酮基戊二酸的輸出的方法是已知的(TOO 1/005959)。對于增強L-氨 基酸輸出的方法，增強棒桿菌屬細菌的菌株中IysE (堿性L-氨基酸輸出體的基因；J.Mol.Microbiol.Biotechnol., 1999Nov ；1 (2):327-36)的方法是已知的，用于生產L-賴氨酸(W097/23597)或L-精氨酸(美國專利公開2003-0113899)。在埃希氏桿菌屬細菌的細胞中增強rhtA、B、C基因(JP 2000-189177A)和yfiK、yahN基因(EP1016710A)的表達的方法也是已知的，已經提示了這些基因涉及L-氨基酸的輸出。對于用于堿性L-氨基酸的輸出的基因，上述的IysE基因是已知的。然而，當IysE基因在同化甲醇的細菌例如嗜甲基菌屬細菌中擴增，并且產生的菌株被用于L-賴氨酸或L-精氨酸的生產時，來源于Coryneform(棒狀桿菌)細菌的野生型IysE基因對于嗜甲基菌屬細菌是致命的，因而必須導入容許宿主微生物生長的突變IysE基因(EP1266966A)。因此，當被導入到異體微生物中時，IysE基因不總是能在L-賴氨酸或L-精氨酸的輸出方面起作用。因此，期望獲得在各種異體宿主微生物中展現出分泌足夠量的L-氨基酸、包括L-賴氨酸和L-精氨酸的能力的，用于L-氨基酸輸出體和生產的基因。ybjE基因位于大腸桿菌的基因組上，已經被預測編碼推定的表面蛋白(Science，277(5331):1453-74,1997)。然而，還沒有報道該基因的克隆和通過在細菌細胞中表達進行分析，因而它的生理功能仍然是未知的。發明概述本發明的目的是提供能有效地生產L-氨基酸的菌株。本發明的另一個目的是提供使用這樣的菌株有效地生產L-氨基酸的方法。本發明的發明 人勤勉地研究以實現上述的目的，結果，根據對高濃度L-賴氨酸的抗性，獲得了 ybjE基因，一種新型的L-氨基酸輸出體基因。此外，他們還發現，L-氨基酸，包括堿性L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-組氨酸；脂肪族的L-氨基酸例如L-異亮氨酸；羥基L-氨基酸例如L-蘇氨酸；環狀L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸；含硫的L-氨基酸例如L-半胱氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸，可以使用在其中ybjE基因的表達被增強的微生物來有效地生產。本發明的目的是提供具有L-氨基酸生產能力的微生物，其中所述微生物被修飾從而ybjE基因的表達被增強。本發明的進一步的目的是提供如上所述的微生物，其中通過提高所述ybjE基因的拷貝數目，或通過修飾所述ybjE基因的表達調節序列來增強所述ybjE基因的表達。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中由所述ybjE編碼的蛋白質的氨基酸序列選自SEQ 2、9和10，其中所述蛋白質具有L-氨基酸輸出能力。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述ybjE基因選自:(a)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA ;和(b)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸序列、或與可從SEQ ID NO:1的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA，并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述ybjE基因選自:(a)具有SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列的DNA ;和(b)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列、或與可從SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA，并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質。本發明的進一步的目的是提供如上所述的微生物，其中所述微生物的所述L-氨基酸輸出能力通過所述增強所述ybjE基因的表達來提高。本發明的進一步的目的是提供如上所述的微生物，其中微生物對L-氨基酸或L-氨基酸類似物的抗性通過所述增強所述ybjE基因的表達來提高。
本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述微生物屬于腸細菌家族。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述屬于腸細菌家族的微生物是屬于埃希氏桿菌屬的微生物。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述微生物是Coryneform細菌。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述微生物是同化甲醇的微生物。本發明的進一步的目的是提供如上所述微生物，其中所述同化甲醇的微生物屬于嗜甲基菌屬或甲基菌屬。本發明的進一步的目的是提供生產L-氨基酸的方法，包括在培養基中培養如上所述的微生物來產生和引起所述L-氨基酸的積累，并從培養基或微生物收集所述L-氨基酸。本發明的進一步的目的是提供生產L-氨基酸的方法，包括在含有甲醇作為主要碳源的液體培養基中培養如上所述的微生物來產生和引起所述L-氨基酸的積累，并從所述培養基或所述微生物收集所述L-氨基酸。本發明的進一步的目的是提供如上所述方法，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。附圖的簡要說明附
圖1顯示了用于在埃希氏菌屬細菌中擴增ybjE基因的質粒的構建方案。附圖2顯示了在存在高濃度L-賴氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)菌株的生長曲線。附圖3顯示了在存在高濃度L-賴氨酸的情況下對照菌株和破壞了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖4顯示了用于在同化甲醇的細菌中擴增ybjE基因的質粒的構建方案。附圖5顯示了用于使用同化甲醇的細菌生產L-賴氨酸的質粒的構建方案。附圖6顯示了在存在L-賴氨酸類似物的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)菌株的生長曲線。附圖7顯示了在存在高濃度L-異亮氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖8顯示了在存在高濃度L-谷氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖9顯示了在存在高濃度L-蘇氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖10顯示了在存在高濃度L-組氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖11顯示了在存在高濃度L-脯氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖12顯示了在存在高濃度L-鳥氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖13顯示了在存在高濃度L-苯丙氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖14顯示了在存在高濃度L-半胱氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖15顯示了在存在高濃度L-精氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。附圖16顯示了在存在高濃度L-賴氨酸的情況下對照菌株和擴增了 ybjE(948bp或900bp)基因的大腸埃希氏菌菌株的生長曲線。優選實施方式的詳細說明以下，將詳細解釋本發明。<1>本發明的微生物本發明的微生物具有生產L-氨基酸的能力，并已經被修飾從而ybjE基因的表達被增強。在此使用的用語“生產L-氨基酸的能力(L-氨基酸生產能力)”意思是，當本發明的微生物在培養基中培養時，引起 L-氨基酸在培養基中或在微生物的細胞中積累的能力。本發明的微生物可以具有生產多種類型的L-氨基酸的能力。具有L-氨基酸生產能力的微生物可以是原本具有L-氨基酸生產能力的微生物，或可以是通過使用誘變技術或重組DNA技術修飾以下提及的微生物的親本菌株使得微生物具有L-氨基酸生產能力的微生物。本發明的微生物也可以是已經通過增強ybjE基因表達獲得了 L-氨基酸生產能力的微生物。在本發明中要生產的L-氨基酸沒有特別的限制，包括堿性L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族的L-氨基酸例如L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羥基L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-絲氨酸；環狀的L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫的L-氨基酸例如L-半胱氨酸、胱氨酸和L-甲硫氨酸；和酸性L-氨基酸和它們的酰胺例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。本發明的微生物可以具有生產兩種或多種類型的這些L-氨基酸的能力。<賦予L-氨基酸生產能力>以下將描述在本發明中使用的具有L-氨基酸生產能力的微生物的實例。然而，微生物不局限于所述實例，而包括具有L-氨基酸生產能力的任何微生物。對于本發明的微生物的親本菌株，可以使用腸細菌家族例如埃希氏菌屬細菌、泛菌屬(Pantoea)細菌或Coryneform細菌等等。此外，也可以使用同化甲醇的細菌,例如嗜甲基菌屬細菌和甲基菌屬細菌，其能從甲醇生產L-氨基酸。此外，親本菌株的實例包括屬于Y-蛋白細菌的腸細菌家族，包括屬于埃希氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和摩根氏菌屬(Morganella)的細菌，和其他細菌，包括脂環酸桿菌屬(Alicyclobacillus)細菌和芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌，和酵母，包括屬于酵母菌屬(Saccharomyces)、假絲酵母菌屬(Candida)屬的那些，等等。這些親本菌株可以天生具有ybjE基因，或可以不是天生地具有ybjE基因并且當導入ybjE基因時展現出改善的L-氨基酸輸出能力。可以使用在Neidhardt 等(Neidhardt，F.C.等人，大腸埃希氏菌 and SalmonellaTyphimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.，1208，表 I)中 艮道的埃希氏菌屬細菌，例如大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌野生型菌株的實例包括，但不限于，Κ12菌株和其衍生物、大腸埃希氏菌MG1655菌株(ATCC N0.47076)和W3110菌株(ATCCN0.27325) ο這些菌株可從美國典型培養物保藏所(ATCC，地址:P.0.Box 1549，Manassas，VA 20108，United Statesof America)獲得。腸桿菌屬細菌的實例包括成團腸桿菌(Enterobacteragglomerans)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌屬細菌的實例包括菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)等。盡管最初被分類為產氣腸桿菌的某些細菌現在根據16S rRNA分析被分類為成團泛菌(Pantoea agglomerans)、菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)，在本發明中使用的屬于腸桿菌家族的微生物可以是腸桿菌屬細菌或者泛菌屬細菌。菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)的具體實例包括Pantoea ananatisAJ13355 (FERM BP-6614)、Pantoeaananatis AJ13356 (FERM BP-6615)、Pantoea ananatisAJ13601 (FERMBP-7207)，和它們的衍生物。這些菌株最初作為成團腸桿菌被鑒定和保藏，現在被分類為菠蘿泛菌(Pantoea ananatis) □嗜甲基菌屬細菌的實例包括，但不限于，食甲基嗜甲基菌，食甲基嗜甲基菌的典型實例包括ASl菌株(NCMB10515)等。食甲基嗜甲基菌ASl菌株(NCMB 10515)可以從國家工業和海洋細菌保藏所(地址:NCIMB Lts., Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)獲得。甲基菌屬細菌的實例包括，但`不限于，糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes), Methylobacillus fIagellatum,等等。糖原甲基菌的實例包括 T-1l 菌株(NCIMB 11375) ^ ATCC 21276 菌株、ATCC 21371 菌株、ATR80 菌株(App1.Biotechnol.Biotechnol.，vol.42，pp.67-72 (1994))、A513 菌株(App1.Microbiol.Biotechnol.，νο1.42，ρρ.67-72(1994))，等等。甲基菌屬 glycogenes NCIMB 11375 菌株可以從國家工業和海洋細菌保藏所(地址:NCIMB Lts.，Torry ResearchStation, 135, AbbeyRoad，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)獲得。Methylobacillus flagellatum 的實例包括 KT 菌株(Arch.Microbiol., vol.149, pp.441-446 (1988))等等。Coryneform 細菌是在 Bergey，s Manual of DeterminativeBacteriology, 8thEd.，p.599 (1974)中定義的一組微生物，可被用于本發明。這些微生物被分類為需氧的、格蘭氏陽性的和不能形成孢子的非抗酸性桿菌。COTynefOTm細菌還包括那些迄今已經被分類到短桿菌屬中、但是當前合并到棒桿菌屬的那些細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及屬于短桿菌屬或微桿菌屬(Microbacterium)、與棒桿菌屬近相關的細菌。這種Coryneform細菌的實例如下所列。嗜乙酸乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
Corynebacterium alkanoIyticum美棒桿菌(Corynebacteriumcallunae)谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)百合花棒桿菌(CorynebacteriumIilium)Corynebacterium melassecolaCorynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)乳發酵短桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)Brevibacterium immariophilum乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)玫瑰色短桿菌(Brevibacteriumroseum)解糖短桿菌(BrevibacteriumsaccharoIyticum)生硫短桿菌(Br evibacteriumthiogenitalis)產氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagens)白色短桿菌(Brevibacteriumalbum)錯狀短桿菌(Brevibacteriumcerinum)嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)特別地，可以例舉以下菌株。嗜乙酰乙酸桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC 15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒桿菌ATCCl599I谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060百合花棒桿菌ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC 17965Corynebacterium efficiens AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868乳發酵短桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418 (FERM BP-2205)Brevibacterium immariophilum ATCC 14068乳發酵短桿菌ATCC13869 (谷氨酸棒桿菌ATCC13869)玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871，ATCC6872白色短桿菌ATCCl5111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氛微桿菌ATCC15354
這些菌株可以從例如美國典型培養物保藏所獲得。每個菌株被給予了一個唯一的登記號，其被列在美國典型培養物保藏所的目錄中。使用這個登記號可以訂購菌株。此外，AJ12340菌株根據布達佩斯條約的規定作為國際保藏于1987年10月27日保藏在國家生物科學和人類技術學會，工業科技機構，通產省(the National Institute ofBioscienceand Human-Techno1gy, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry ofInternational Trade and Industry)(目前,獨立的管理機構，國家高級工業科技學會，國際專利保藏機構(TsukubaCentral 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken,Japan, postal code:305-5466))，收到的登記號是 FERM BP-1539。AJ12418 菌株根據根據布達佩斯條約的規定作為國際保藏于1989年I月5日保藏在國家高級工業科技學會，國際專利保藏機構，收到的登記號是FERM BP-2205。在下文中，將說明賦予如上所述的親本菌株L-氨基酸生產能力的方法。為了賦予L-氨基酸生產能力，可以使用通常用來培育屬于埃希氏菌屬或Coryneform細菌屬的L-氨基酸生產細菌的方法。例如，可以使用用于獲得具有L-氨基酸生產能力的營養突變菌株、類似物抗性菌株或代謝調節突變菌株的方法，和用于產生具有增強的L-氨基酸生物合成酶活性的重組菌株的方法("Amino Acid Fermentation",thejapan Scientific Societies Press[Gakkai Shuppan Center],IstEdition,published on May 30，1986，pp.77-100)。當使用這些方法培育L-氨基酸生產細菌時，可以賦予一種或多種性質，包括營養缺陷型、類似物抗性和代謝調節突變。當產生重組菌株時，可以增強單個或多個L-氨基酸生物合成酶的活性。此外，賦予營養缺陷型、類似物抗性和代謝調節突變性質的方法可以與增強L-氨基酸生物合成酶活性的方法組合。具有L-氨基酸生產能力的營養突變菌株、L-氨基酸類似物抗性菌株或代謝調節突變菌株，可以通過使親本或野生型菌株經歷典型的誘變處理，例如X射線或紫外線照射、用例如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)的誘變試劑處理來獲得。然后，可以從突變的菌株中挑選具有L-氨基酸 生產能力的營養缺陷菌株、類似物抗性菌株或代謝調節突變菌株。L-賴氨酸類似物的實例包括溶菌素、賴氨酸異羥廂酸鹽S- (2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-甲基賴氨酸、α-氯己內酰胺、正亮氨酸，等等。L-精氨酸類似物的實例包括精氨酸異羥肟酸鹽、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽。具有L-賴氨酸生產能力的L-賴氨酸類似物抗性菌株或代謝調節突變菌株的具體實例包括大腸埃希氏菌AJl 1442菌株(FERMBP-1543，NRRL B_12185、JP 56-18596A和美國專利4，346，170)，大腸埃希氏菌VL611菌株(JP 2000-189180A)，等等。此外，WC196菌株(W096/17930)也可以被用作L-賴氨酸生產大腸埃希氏菌。WC196菌株最初是通過給W3110菌株賦予AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而培育的，W3110菌株來源于大腸埃希氏菌K-12。WC196菌株被命名為大腸埃希氏菌AJ13069菌株(Escherichia coliAJ13069)，于1994年12月6日保藏在獨立的管理機構，國際專利保藏機構通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(TsukubaCentral 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi,Ibarak1-ken, Japan, postal code:305-8566)),收到的登記號是 FERM P-14690。之后，于1995年9月29日根據布達佩斯條約的規定轉為國際保藏，收到的登記號是FERM BP-5252。
具有L-賴氨酸生產能力的Coryneform細菌的實例包括S-(2-氨乙基)半胱氨酸(在下文中“AEC”)-抗性突變菌株，包括乳發酵短桿菌(乳發酵短桿菌)AJl 1082 (NRRLB-11470)(在 JP56-1914B、JP56-1915B、JP57-14157B、JP57-14158B、JP57-30474B、JP58-10075B、JP59-4993B、JP61-35840B、JP62-24074B、JP62-36673B、JP5-11958B、JP7-112437B和JP7-112438B中描述了 )，對氨基酸例如L-高絲氨酸有營養缺陷的突變菌株(JP48-28078B和JP56-6499B)，對AEC有抗性和對氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸有營養缺陷的突變菌株(美國專利3，708, 395和3，825，472)，對DL-α -氨基-ε -己內酰胺、α -氨基-月桂基內酰胺、天冬氨酸類似物、磺胺藥、醌型化合物、和N-月桂酰亮氨酸有抗性的L-賴氨酸生產突變菌株，對草酰乙酸酯脫羧酶抑制物或呼吸道酶抑制物有抗性的L-賴氨酸生產突變菌株(JP50-53588A、JP50-31093A、JP52-102498A、JP53-9394A、JP53-86089A、JP55-9783A、JP55-9759A、JP56-32995A、JP56-39778A、JP53-43591B 和 JP53-1833B)，對環己六醇或乙酸有營養缺陷的L-賴氨酸生產突變菌株(JP55-9784A和JP56-8692A)，對氟丙酮酸或34°C或更高溫度敏感的L-賴氨酸生產突變菌株(JP55-9783A和JP53-86090A)，對乙二醇有抗性的短桿菌屬或棒桿菌屬細菌的L-賴氨酸生產突變菌株(美國專利4，411，997)，等等。L-氨基酸生產能力也可以通過增強編碼L-氨基酸生物合成酶的基因的表達來賦予。例如，L-賴氨酸生產能力可以通過增強編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因和編碼天冬氨酸激酶的基因的表達來賦予。也就是說，通過將編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因片段和編碼天冬氨酸激酶的基因片段連接到載體、優選的多拷貝載體中來制備重組DNA，所述載體在用于L-賴氨酸生產的宿主微生物中是可操作的。作為轉化的結果，在宿主細胞中編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因和編碼天冬氨酸激酶的基因的拷貝數增加，從而這些酶的活性增強。在下文中，二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III也按它們各自的縮寫DDPS、AK和AKIII來稱謂。編碼DDPS和AK的基因沒有特別的限制，只要它們編碼分別具有DDPS或AK活性的蛋白質。這種基因的實例包括大腸埃希氏菌、食甲基嗜甲基菌、谷氨酸棒桿菌等的基因。由于 DDPS 基因(dapA, Richaud, F.等人，J.Bacteriol., (1986))和 AKIII 基因(IysC,Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N.and Patte, J.C., J.Biol.Chem., 261,1052 (1986))的核苷酸序列是已知的，這些基因可以通過使用根據它們的核苷酸序列序列設計的引物進行PCR、從微生物例如E.coliK-12菌株的染色體DNA獲得。在下文中，通過來源于E.coli的dapA和IysC來例示編碼DDPS的基因和編碼AK的基因，但是編碼DDPS的基因和編碼AK的基因不限于dapA和lysC。已知的是，來源于大腸埃希氏菌的野生型DDPS受L-賴氨酸的反饋抑制，來源于大腸埃希氏菌的野生型AKIII受L-賴氨酸的抑制和反饋抑制。因此，當使用dapA和IysC時，優選的使用對L-賴氨酸的反饋抑制有抗性的編碼DDPS和AK的突變基因。在下文中，具有免受L-賴氨酸的反饋抑制的突變的DDPS也可以被稱為“突變DDPS”，編碼突變DDPS的DNA也可被稱為“突變dapA”或“dapA *”。來源于大腸埃希氏菌具有消除L-賴氨酸的反饋抑制的突變的AKIII也可以被 稱為“突變AKIII ”，編碼突變AKIII的DNA也可被稱為“突變lysC”。來源于Corynebacterium細菌的DDPS原本就對L-賴氨酸的反饋抑制有抗性，因而用于本發明的DDPS和AK不必是突變的。編碼對L-賴氨酸的反饋抑制有抗性的突變DDPS的DNA的實例包括編碼具有一氨基酸序列的DDPS的DNA，所述氨基酸序列包括用酪氨酸取代118-組氨酸殘基。(U.S.專利5，661，012和6，040, 160)。此外，編碼對L-賴氨酸的反饋抑制有抗性的突變AKIII的DNA的實例包括編碼具有一氨基酸序列的AKIII的DNA，所述氨基酸序列包括用異亮氨酸取代352-蘇氨酸殘基。(U.S.專利5，661，012和6，040，160)。突變DNA可以通過使用PCR的定點誘變技術等來獲得。用于基因克隆的質粒可以是任何質粒，只要它可以在微生物中復制，其具體實例包括 pBR322、pTWV228 (Takara Bio)、pMWl 19 (Nippon Gene)、pUC19，等等。用于轉化的、在宿主微生物中可操作的載體是可在每種微生物的細胞中自主復制的質粒。大腸埃希氏菌載體的具體實例包括PSTV29 (Takara Bio)、RSF1010 (Gene,vol.75(2)，pp.271-288,1989)、pUC19、pBR322、pMW119，等等。也可以使用噬菌體 DNA 載體。嗜甲基菌屬細菌的載體，例如，是在嗜甲基菌屬細菌的細胞中可自主復制的質粒。嗜甲基菌屬細菌的載體的具體實例包括RSF1010和其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov, Y.D.Plasmid, 16，161-167 (1986))、pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990))、pRP301和pTB70 (Nature，287，396，(1980))。在Coryneform細菌中可操作的的載體的實例包括pAM330 (JP58-67699A)、pHM1519 (JP58-77895A)和 pSFK6 (JP2000-262288A)。此外，通過切除允許質粒在Coryneform細菌中自主復制的DNA片段,并將該片段插入到大腸埃希氏菌載體中所獲得的質粒，可被用作所謂的穿梭載體，其在大腸埃希氏菌和Coryneform細菌中都是可自主復制的。 為了通過將dapA和IysC與任何上述載體連接制備重組DNA，可以使用限制性內切酶來消化含dapA和IysC的DNA片段以及所述載體。通常使用連接酶例如T4DNA連接酶來進行連接。dapA和IysC可以被摻入到獨立的載體中或單個載體中。可用于限制性內切酶消化、DNA連接、染色體D NA制備、PCR、質粒DNA制備、轉化、寡核苷酸引物設計等等的方法，可以是本領域技術人員公知的常規方法。在Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis,T., " MolecularCloning A Laboratory Manual,Second Edition" ,Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)等等中描述了這樣的方法。為了將如上所述制備的重組DNA導入到微生物中，只要達到足夠的轉化效率，可以使用任何方法。例如，可以應用電穿孔(Canadian Journal ofMicrobiology,43,197(1997))。可以使用廣宿主范圍的質粒RSFD80(美國專利6，040，160)作為含有編碼突變DDPS的突變dapA和編碼突變AKIII的突變IysC的質粒。用RSFD80轉化的大腸埃希氏菌JM109菌株被稱為AJ12396(美國專利6，040, 160)，這個菌株于1993年10月28日被保藏在獨立的管理機構，國家高級工業科技學會，國際專利保藏機構，收到的登記號是FERMP-13936。之后，于1995年11月I日根據布達佩斯條約的規定轉為國際保藏，收到的登記號是FERM BP-4859。RSFD80可以通過已知的方法從AJ12396菌株獲得。DDPS基因和AK基因的表達也可以通過將多個拷貝的dapA和IysC整合到微生物的染色體DNA中來增強。為了將多拷貝的dapA和IysC導入到微生物的染色體DNA中，可以通過靶向多拷貝存在于染色體DNA上的序列來進行同源重組。存在于轉座元件末端的重復DNA或反向重復可被用作多拷貝存在于染色體DNA上的序列。做為選擇，如在JP2-109985A中公開的，多拷貝的dapA和/或IysC可通過使用轉座子導入到染色體DNA中。在這兩種方法中，作為在轉化的菌株中提高的dapA和IysC拷貝數的結果，DDPS和AK的活性增強了。
除了上述基因擴增方法之外，DDPS基因和AK基因的表達也可以通過用更強的序列替換表達調節序列，例如dapA和IysC的啟動子來增強(JP1-215280A)。這種強啟動子的實例包括Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、lambda曬菌體的Pk啟動子和Pl啟動子、tet啟動子、amyE啟動子、spac啟動子,等等。插入這些啟動子代替天然啟動子增強了 dapA和IysC的表達，引起DDPS和AK活性的增強。增強表達調節序列可以與擴大dapA和IysC的拷貝數相組合。L-氨基酸生產能力也可以通過增強編碼除DDPS和AK之外的L-氨基酸生物合成酶的基因的表達來賦予。這種酶的實例包括二氨基庚二酸酯合成途徑的酶，例如二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶(W096/40934)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(JP60-87788A)、天冬氨酸轉氨酶(JP6-102028B)、二氨基庚二酸表異構酶(JP2003-135066A)和天冬氨酸半醛脫氫酶(W000/61723)。這種酶的進一步的實例包括氨基己二酸途徑酶，例如同型烏頭酸水合酶(JP2000-157276A)等等。增強這些酶的基因表達可以與增強DDPS和AK基因的表達相組合。此外，具有L-賴氨酸生產能力的微生物也可以通過降低或消除催化一反應的酶的細胞內活性來獲得，所述反應用于合成除L-賴氨酸之外的化合物，并且是L-賴氨酸生物合成途徑的分支。這種酶的實例包括高絲氨酸脫氫酶和賴氨酸脫羧酶。在W095/23864和W096/17930中描述了在其中這些酶的活性被降低的菌株。降低或消除酶的細胞內活性的方法的實例包括突變或刪除微生物的細胞內編碼所述酶的基因，使得與非突變菌株相比細胞內活性被降低或消除。突變或刪除基因的方法的實例包括修飾表達調節序列，例如啟動子和Shine-Dalgarno(SD)序列，向開發閱讀框中導入錯義突變、非有義突變、或框架平移突變，和刪除基因的部分(J Biol Chem.1997272(13):8611-7)。可以通過使用同源重組技術或通過使用轉座子或IS因子將突變的基因導入到微生物中，在所述同源重組技術中染色體上的野生型基因被替換為所述突變的基因。同源重組技術包括使用線性DNA、溫度敏感質粒和非可復制質粒的方法。在ProcNatlAcad Sci U S A.2000Jun 6 ；97(12):6640-5.、美國專利 6303383、JP05-007491A 等中描述了這些方法。增強和降低L-賴氨酸生物合成酶活性的方法適合于賦予另一種L-氨基酸生產能力。具有生產L-精氨酸能力的大腸埃希氏菌的具體實例包括對α-甲基甲硫氨酸、P-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽、S- (2-氨乙基)半胱氨酸、α -甲基絲氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、或磺胺胍有抗性的突變菌株(JP N0.56-106598Α)，等等。此外，也可以使用大腸埃希氏菌237菌株(Escherichia coli 237)，其是L-精氨酸生產細菌，具有賦予L-精氨酸反饋抑制抗性的突變，并展現出高的N-乙酰谷氨酸合酶活性(俄國專利申請N0.2000117677)。這個菌株于2000年4月10日保藏在俄國工業微生物國家保藏所(VKPM)，GNII Genetika，保藏號VKPM B-7925，于2001年5月18日根據布達佩斯條約的規定轉成國際保藏。也可以使用來源于237菌株、并具有增強的醋酸鹽同化能力的大腸埃希氏菌382菌株(JP2002-017342A)。大腸埃希氏菌382菌株于2000年4月10日保藏在俄國工業微生物國家保藏所(VKPM)，保藏號VKPM B-7926。
具有L-精氨酸生產能力的Coryneform細菌的實例包括不僅對2_噻唑丙氨酸有抗性、而且對于L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸也是營養缺陷的Coryneform細菌的菌株(JP54-44096A)，對酮丙二酸、氟丙二酸或單氟乙酸有抗性的Coryneform細菌的菌株(JP57-18989A)，對精氨醇有抗性的Coryneform細菌的菌株(JP62-24075A)，對X-胍有抗性的Coryneform細菌的菌株(X代表脂肪酸或脂肪鏈的衍生物，JP2-186995A)，對精氨酸異羥肟酸鹽和6-氮尿嘧啶有抗性的Coryneform細菌的菌株(JP57-150381A)，ArgR(精氨酸生物合成酶的阻抑蛋白)有缺陷的Coryneform細菌的菌株(JP2002-51790A)，等等。可以通過類似于用于L-賴氨酸生物合成酶的上述方法來增強L-精氨酸、L-組氨酸、L-鳥氨酸和其他L-氨基酸的生物合成酶的活性。L-精氨酸生物合成酶的實例包括一種或多種選自以下的酶:N-乙酰谷氨酸合酶(argA) > N-乙酰谷氨磷酸酯還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶(argj)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸轉氨酶(argD)、乙酰鳥氨酸脫乙酰基酶(argE)、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(argF)、精氨基琥珀酸合酶(argG)、精氨基琥珀酸裂解酶(argH)和氨甲酰基磷酸酯合酶(carAB) 0編碼這些酶的基因的名稱分別在酶的名字后的括號中給出。在其中這些酶的活性增強了的菌株的實例包括,例如，在JP2000-287693A、JP2000-197490A、JP07-028749B等等中描述的菌株。也可以通過增強編碼谷氨酸脫氫酶的基因的表達(EP1057893A)或增強谷氨酸合成酶活性(US2005-00142236)來賦予L-精氨酸生產能力。已知的是，L-精氨酸生物合成酶受L-精氨酸的抑制，因此L-精氨酸生產能力也可以通過刪除精氨酸阻遏物或通過向N-乙酰谷氨酰胺合酶中導入賦予反饋抑制抗性的突變來(EP1154020A和EP1170361A)有效地增強。此外，對組氨酸類似物或色氨酸類似物有抗性的Bacillus細菌(JP52_114092A)，對L-甲硫氨酸、L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、腺嘌呤、鳥嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前體)的至少一個是營養缺陷的芽孢桿菌屬細菌(JP52-99289A)，對精氨酸異羥肟酸鹽有抗性的芽孢桿菌屬細菌，對丁二酸是營養缺陷的或對核苷酸類似物有抗性的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens) (JP58-9692A),在代謝精氨酸的能力方面有缺陷的、對精氨酸拮抗物和刀豆氨酸有抗性的、對賴氨酸是營養缺陷的粘質沙雷氏菌(JP52-8729A)，對精氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸異羥月虧酸鹽和6_氮尿卩密唳有抗性的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) (JP53-143288A),對刀豆氨酸有抗性的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) (JP53-3586A)等等，也可被用作L-精氨酸生產菌株。L-組氨酸生物合成酶的實例包括ATP磷酸核糖轉移酶(hisG)、磷酸核糖AMP環水解酶(hisl)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖亞胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖酸異構酶(hisA)、氨基轉移酶(hisH)、磷酸組氨醇轉氨酶(hisC)組氨醇磷酸酶(hiSB)、組氨醇脫氫酶(hisD)，等等。
已知的是，編碼L-組氨酸生物合成酶(hisG，hisBHAFI)的基因受L-組氨酸抑制，因此L-組氨酸生產能力也可以通過向ATP磷酸核糖轉移酶(hisG)中導入賦予反饋抑制抗性的突變來有效地增強(俄國專利2003677和2119536)。
具有L-組氨酸L-組氨酸能力的微生物的具體實例包括E.coli菌株FERM-P5038和5048，其已經導入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的載體(JP56-005099A)，導入了 rht，一種用于氨基酸輸出的基因的菌株(EP1016710A)，賦予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性的E.coli 80菌株(VKPM B-7270，俄國專利2119536)，等等。L-鳥氨酸生物合成途徑包括與L-精氨酸生物合成途徑共有的幾個酶。L-鳥氨酸生物合成酶的實例包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨磷酸酯還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶(argj)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸轉氨酶(argD)乙酰鳥氨酸脫乙酰基酶(argE),等等。具有生產L-鳥氨酸的能力的細菌的實例包括已經導入了 L-瓜氨酸或L-精氨酸營養缺陷突變的Coryneform細菌和節桿菌屬(Arthrobacter)細菌(JP02-283290A)，對維生素P樣活性物質有抗性的Coryneform細菌AJl 1589菌株(FERM-P5644，JP57-016696A)，
坐坐寸寸ο具有L-蘇氨酸生產能力的微生物的實例包括具有L-蘇氨酸生產能力的6- 二甲基氨基嘌呤-抗性突變株(JP5-304969A)，在其中具有增強酶活性的突變的蘇氨酸生物合成酶基因用質粒來擴增的菌株(JP1-29559B，JP05-227977A)，在其中蘇氨酸操縱子用質粒來擴增的菌株(JP2-109985A)，在其中擴增了編碼丙酮酸羧化酶的基因和編碼煙酰胺核苷酸轉氫酶的基因的菌株(JP2002-51787A)，等等。大腸埃希氏菌VKPM B-3996菌株(美國專利5，175，107)也可以被用作L-蘇氨酸生產菌株。VKPM B-3996于1987年11月19日保藏在俄國工業微生物國家保藏所(VKPM)，GNII Genetika，登記 號為VKPM B-39960VKPM B-3996菌株攜帶質粒pVIC40 (國際專利公開W090/04636)，該質粒是通過向具有鏈霉素抗性標記基因的質粒pAYC32中插入蘇氨酸操縱子(thrABC)獲得的(Chistorerdov, A.Y.，Tsygankov, Y.D.，Plasmid, 1986,16,161-167)。由包含在PVIC40中的突變thrA基因編碼的天冬氨酸激酶1-高絲氨酸脫氫酶I不受L-蘇氨酸的反饋抑制。大腸埃希氏菌VKPM B-5318 菌株(Escherichia coliTDH7\pPRT614)(EP0593792B)也可被用作L-蘇氨酸生產菌株。VKPMB-5318于1990年5月3日保藏在俄國工業微生物國家保藏所(VKPM), GNII Genetika (VKPM GNII Genetika 地址:Dorozhnyproezd
I,Moscow 113545，Russia)，登記號為 VKPM B-5318。VKPMB-5318 菌株對于 L-異亮氨酸是自養的，編碼蘇氨酸生物合成酶的蘇氨酸操縱子位于Cl溫度敏感阻遏物、PR-啟動子和來源于λ曬菌體的Cro蛋白質N末端的下游,此外,該菌株攜帶構建的質粒DNA,使得蘇氨酸生物合成基因的表達受到來源于λ噬菌體的啟動子和阻遏物的調節。此外，大腸埃希氏菌MG442菌株(US4，278，765)也可以用作L-蘇氨酸生產菌株。MG442菌株作為CMMB-1628保藏在俄國工業微生物國家保藏所(VKPM)。具有生產L-蘇氨酸的能力的細菌也可以通過增強L-蘇氨酸生物合成酶的活性來獲得。編碼L-蘇氨酸生物合成酶的基因的實例包括天冬氨酸激酶III基因、天冬氨酸半醛脫氫酶基因，等等。L-蘇氨酸生物合成酶的活性可以在細菌中被增強，在所述細菌中蘇氨酸降解酶的活性被抑制。在其中蘇氨酸降解酶的活性被抑制的細菌的實例包括TDH6菌株，其是在蘇氨酸脫氨酶活性方面有缺陷的(JP2001-346578A)。具有生產L-谷氨酸的能力的細菌也可以通過增強L-谷氨酸生物合成酶的活性來獲得。L-谷氨酸生物合成酶的實例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、二磷酸果糖酶、果糖磷酸激酶、磷酸葡糖異構酶，等等。特別地，具有這些L-谷氨酸生物合成酶的增強的活性的細菌包括在W000/18935和 JP2000-232890A 中公開的 Coryneform 細菌的菌株，和在 JP2001-333769A、JP2000-106869A、JP2000-189169A 和 JP2000-333769A 中公開的腸桿菌家族的菌株。具有生產L-谷氨酸的能力的細菌也可以通過降低或消除催化一反應的一種或多種酶的活性來獲得，所述反應使得從L-谷氨酸的合成產生分支并產生L-谷氨酸以外的化合物。這種酶包括異檸檬酸裂解酶、α-酮戊二醛脫氫酶、磷酸酯轉乙酰酶、乙酰激酶、乙酰醇酸合酶、乙酸乳酸合酶、甲酸酯轉乙酰酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-焦磷酸酯脫氫
酶，等等。
特別地，在其中α-酮戊二醛脫氫酶活性被降低的細菌包括在W095/34672中公開的乳發酵短桿菌As菌株、在JP6-237779A中公開的乳發酵短桿菌AJ12821菌株(FERM ΒΡ-4172)、在JP5-244970A或JP7-203980A中公開的大腸埃希氏菌菌株，和在JP2001-333769A中公開的成團腸桿菌菌株。具有生產L-半胱氨酸的能力的細菌的實例包括在其中胱硫醚β-裂解酶活性被降低的大腸埃希氏菌菌株(JP2003-169668A)和在其中絲氨酸乙酰基轉移酶受L-半胱氨酸的反饋抑制被釋放的大腸埃希氏菌的菌株(JP11-155571A)或Coryneformbacterium (JP2002-233384A)。具有生產L-脯氨酸的能力的埃希氏菌屬細菌的實例包括大腸埃希氏菌702菌株(VKPM B-8011)，其式對 3,4_ 二輕基腦氨酸和 azathidin-2-carboxylate 有抗性的，和702ilvA菌株(VKPM B-8012)其是通過在702菌株中刪除ilvA基因獲得的(JP2002-300874A)。具有生產L-苯丙氨酸的能力的埃希氏菌屬細菌的實例包括在其中刪除了 tyrA和tyrR基因大腸埃希氏菌AJ12739菌株(tyrA::TnlO, TyrR ;VKPM Β-8197)，在其中導入了突變的PheA的大腸埃希氏菌HW1089菌株(美國專利5，354, 672)和在其中擴增了yddG和yedA基因的大腸埃希氏菌菌株(W0 03/044192)。具有生產L-苯丙氨酸的能力的Coryneform細菌的實例包括對于酪氨酸是營養缺陷的和對L-苯丙氨酰-L-酪氨酸有抗性的菌株(JP5-49489A)。具有生產L-色氨酸的能力的細菌可以通過增強L-色氨酸生物合成酶，包括磷酸甘油酸脫氫酶和鄰氨基苯甲酸酯合酶的活性來獲得。這些酶可以是對L-色氨酸或L-絲氨酸的反饋抑制有抗性的。例如，具有這些反饋抗性酶的細菌可以通過將質粒PGH5導入大腸埃希氏菌SV164菌株來獲得，所述質粒pGH5含有編碼L-色氨酸抗性磷酸甘油酸脫氫酶的突變serA基因，所述大腸埃希氏菌SV164菌株帶有編碼L-絲氨酸抗性鄰氨基苯甲酸酯合酶的基因(W094/08031)。具有生產L-色氨酸的能力的細菌也可以通過增強由色氨酸操縱子編碼的L-色氨酸生物合成酶的活性來獲得。這種酶包括L-色氨酸操縱子色氨酸合酶和鄰氨基苯甲酸酯合酶。這些細菌的實例包括在其中導入了色氨酸操縱子的大腸埃希氏菌菌株，所述色氨酸操縱子含有編碼L-絲氨酸抗性鄰氨基苯甲酸酯合酶的基因(JP57-71397A、JP62-244382A和美國專利4，371,614)。此外，具有生產L-色氨酸的能力的細菌的實例包括對L-苯丙氨酸和L-酪氨酸是營養缺陷的大腸埃希氏菌AGX17AGX17(pGX44) [NRRL B-12263]菌株，和攜帶含有色氨酸操縱子的質粒 PGX50 的 AGX6 (pGX50) aroP [NRRL B-12264]菌株(美國專利 4，371，614)。具有生產L-異亮氨酸的能力的埃希氏菌屬細菌的實例包括對6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突變菌株((JP5-304969A)，對L-異亮氨酸異羥肟酸鹽、硫代異亮氨酸、DL-乙硫氨酸或精氨酸異羥肟酸鹽有抗性的突變菌株((JP5-130882A)，和在其中編碼蘇氨酸脫氨酶和乙酰羥酸合酶的基因用質粒擴增了的重組菌株(JP2-458A、JP2-42988A和JP8-47397A)。具有生產L-纈氨酸的能力的細菌可以通過增強L-纈氨酸生物合成酶的活性來獲得，所述L-纈氨酸生物合成酶包括由ilvGMEDA操縱子編碼的那些，特別是由ilvG基因編碼的乙酰羥酸合酶(JP02-748418B)。這些酶可以是對L-纈氨酸的反饋抑制有抗性的。具有生產L-纈氨酸的能力的細菌可以是在其中乙酸乳酸合酶III基因(ilvIH基因)的表達被降低的細菌。具有生產L-纈氨酸的能力的細菌可以是對氨基酸類似物有抗性的。這種細菌的實例包括對L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸是營養缺陷的并且對D-核糖、嘌呤核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的突變菌株(FERMP-1841，P 5556 ; JP53-025034A)，和對聚酮(polyketonoid)有抗性的突變菌株(FERM P-9325 ；JP04-045314B)。具有生產L-丙氨酸的能力的細菌的實例包括在H+-ATPase活性方面有缺陷的Coryneform 細菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001Nov ；57 (4):534-40),或在其中擴增了天冬氨酸脫羧酶基因的Coryneform細菌菌株(JP07-163383A)。
〈增強ybjE基因的表達〉本發明的微生物可以通過修飾如上所述的具有L-氨基酸生產能力的微生物、使得ybjE基因的表達增強來獲得。做為選擇，可以先增強ybjE基因的表達，隨后賦予L-氨基酸生廣能力。可以通過經由修飾表達調節序列，例如啟動子來增強內源性ybjE基因的表達，或通過使用質粒等外源地導入ybjE基因，來增強ybjE基因的表達。可以組合這些技術。可以通過northern 雜交或 RT-PCR(Molecular cloning:Coldspring HarborLaboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)測量本發明的細菌中由 ybjE 基因表達出的RNA的數量，并于野生型或未修飾的菌株相比較，來確認ybjE基因表達的增強。在本發明的微生物中ybjE基因的表達被增強超過野生型或未修飾的菌株，優選的是野生型或未修飾的菌株的不少于1.5倍，更優選的不少于2倍，和最優選的不少于3倍。ybjE基因可以來自大腸埃希氏菌或其同源物。來自大腸埃希氏菌的ybjE基因的實例包括編碼具有SEQ ID NO:2中氨基酸編號17到315的氨基酸序列的蛋白質的基因，優選的是具有SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列的基因。盡管在SEQ IDNO:2的氨基酸序列中的位置I上Val的密碼子是gtg，它可以被轉化為Met，ybjE基因編碼的蛋白質可以是具有SEQ ID NO:2的氣基酸序列(I到315)的蛋白質。在這種情況下，優選的是使用含有SEQ ID NO:1的核苷酸編號I到948的核苷酸序列的DNA。然而，從實施例可以清楚地了解到，可用于本發明的生產方法的微生物可以通過使用含有核苷酸序列SEQ ID NO:1(49到948)的DNA來獲得，不管哪個氨基酸殘基是翻譯起始密碼子。大腸埃希氏菌ybjE基因的同源物是指展現出與大腸埃希氏菌ybjE基因高度的結構相似性、并增強L-氨基酸輸出能力或L-氨基酸抗性，和宿主微生物的L-氨基酸生產能力的基因。ybjE基因同源物的實例包括編碼具有SEQ ID NO:9或NO: 10的氨基酸序列的蛋白質的基因。SEQ ID NO:9的氨基酸序列是在大腸埃希氏菌的YbjE蛋白質(SEQ IDNO:2)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)LT2菌株的YbjE蛋白質之間保守的序列。SEQ ID NO:10的氨基酸序列是在大腸埃希氏菌的YbjE蛋白質和Yersinia pestisC092YP01361菌株的YbjE蛋白質之間保守的序列。ybjE基因同源物可以是編碼與SEQ ID NO:2的全部氨基酸序列或SEQ ID NO:2中氨基酸編號17到315的氨基酸序列具有70%或更高、優選的80%或更高、更優選的90%或更高、更優選的95%或更高、特別優選的98%或更高的同源性的蛋白質，并且具有L-氨基酸輸出能力的基因。ybjE基因同源物的實例還包括具有SEQ ID N0:9或N0:10的氨基酸序列并具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質。氨基酸序列和DNA序列的同源性可以使用 Karlin 和 Altschul 的 BLAST (Pr0.Natl.Acad.Sc1.USA, 90, and 5873(1993))和FASTA (MethodsEnzymol., 183, and 63 (1990))算法來確定。根據這個算法 BLAST 開發了稱為 BLASTN 和 BLASTX 的程序。(參考 http://www.ncb1.nlm.nih.gov)。來源于除大腸埃希氏菌以外的微生物的ybjE基因可以使用，包括來源于Shigella flexneri 2a str.2457T 菌株的基因，其具有與 GenBank 登記入冊 N0.AE016980的核苷酸編號275793到276692或275793到276740互補的序列，來源于鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株的基因，其具有與GenBank登記入冊N0.AE008740的核苷酸編號97到996互補的序列，和來源于Yersinia pestis C092菌株的基因，其具有與GenBank登記入冊N0.AJ414147的核苷酸編號197812到198708互補的序列。此外，可以根據與以上例舉的基因的同源性，從Coryneform細菌例如谷氨酸棒桿菌和乳發酵短桿菌,假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌例如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),分枝桿菌屬(Mycobacterium)細菌例如結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)等等克隆 ybjE 基因。
`
此外，本發明的ybjE基因不局限于野生型基因，而可以是突變或人工修飾的基因，所述基因編碼具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2中氨基酸編號17到315的氨基酸序列、或SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列的蛋白質。編碼的蛋白質可以包括在一個或多個位置替換、刪除或插入一個或幾個氨基酸殘基，只要維持了編碼的YbjE蛋白質的功能，即L-賴氨酸輸出能力。盡管取決于三維結構中的位置或氨基酸殘基的類型的不同而“幾個”氨基酸殘基的數目不同，其可以是2到20個，優選的2到10個，更優選的2到5個。氨基酸的替換優選的是保守替換，包括ser或thr對ala的替換，gln、his或Iys對arg的替換，glu、gin、lys、his 或 asp 對 asn 的替換，asn、glu 或 gin 對 asp 的替換，ser 或 ala對 cys 的替換，asn、glu、lys、his、asp 或 arg 對 gin 的替換，gly> asn、gin、lys 或 asp 對glu 的替換，pro 對 gly 的替換，asn、lys、gin、arg 或 tyr 對 his 的替換，leu、met、val 或phe對ile的替換，ile、met、val或phe對Ieu的替換, asn、glu、gin、his 或 arg 對 lys 的替換，ile、leu、val 或 phe 對 met 的替換，trp、tyr、met、ile 或 leu 對 phe 的替換，thr 或ala對ser的替換，ser或ala對于thr的替換，phe或tyr對trp的替換，his、phe或trp對tyr的替換，met、ile或Ieu對val的替換。如上所述替換、刪除或插入一個或幾個核苷酸還包括起因于攜帶ybjE基因的微生物(突變體或變體)的個體差異和物種差異的天然發生的突變。可以通過例如，位點特異性誘變來修飾SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或SEQ IDNO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列獲得這樣的基因，從而將一個或多個替換、刪除或插入導入到由該基因編碼的蛋白質的特定位點上。在SEQ ID NO:1的序列中具有突變的ybjE基因的實例包括，具有SEQ ID NO:1的序列、其中第三位置上的核苷酸(鳥嘌呤)被腺嘌呤替代的ybjE基因。此外，這種基因也可以通過常規的誘變處理，例如以下所述的那些來獲得。誘變處理的實例包括在體外用羥胺處理具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID N0:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列的基因，和用紫外線照射或用于典型的突變處理的誘變試劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)或EMS (甲磺酸乙酯)處理帶有該基因的微生物，例如埃希氏菌屬細菌。可以通過例如在適合的細胞中表達所述基因并確定輸出到培養基中的L-氨基酸的數量是否升高，來確認這些基因編碼的蛋白質是否具有L-氨基酸輸出能力。可以通過將所述基因導入到宿主微生物中，在存在高濃度L-氨基酸的情況下培養該宿主，并與對照菌株比較微生物的生長情況，來確認這些基因是否給宿主微生物賦予L-氨基酸抗性。ybjE基因還包括能在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸序列、SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列、或從這些序列制備的探針雜交，并且編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質的DNA。如在此使用的“嚴格條件”是這樣的條件，在這些條件下形成所謂的特異性雜交， 而不形成非特異性雜交。很難通過使用任何數值來清楚地表述這種條件。然而，嚴格條件的實例包括這樣的條件，在該條件之下，相互具有高同源性的DNA，例如，具有不低于50%的同源性的DNA相互雜交，具有低于50%的同源性的DNA不相互雜交，和這樣的條件，在該條件下，在運用典型Southern雜交洗漆的一定鹽濃度下,例如在1XSSC、0.1% SDS 在 60°C，優選的 0.1 X SSC,0.1% SDS 在 60°C，更優選的 0.1 X SSC,0.1 % SDS 在68°C下洗滌一次或優選的2-3次，DNA相互雜交。可以通過例如使用遺傳重組技術提高ybjE基因在細胞中的拷貝數來增強ybjE基因的表達。例如，可以通過將含有ybjE基因的基因片段連接到能在宿主微生物中復制的載體，優選的多拷貝載體，并將產生的載體導入到宿主微生物中來制備重組DNA。當使用大腸埃希氏菌的ybjE基因時，可以，例如使用根據SEQ IDNO:1的核苷酸序列設計的引物，例如具有SEQ ID NO:5或6的序列的引物，并使用大腸埃希氏菌的染色體DNA作為模板，通過PCR方法(聚合酶鏈式反應，參見White，T.J.等人，Trends Genet.,5,185(1989))來獲得。也可以使用來自其他微生物的ybjE基因，可以通過使用根據它們的ybjE基因或其同源序列、或來自不同物種微生物的YbjE蛋白質設計的寡核苷酸引物進行PCR，或通過使用根據這樣的序列信息制備的寡核苷酸探針進行雜交，從它們的染色體DNA或染色體DNA文庫獲得ybjE基因。可以通過例如Saito和Miura的方法(參見H.Saito and K.Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963), Text for BioengineeringExperiments, Edited by the Societyfor Bioscience and Bioengineering, Japan,pp.97-98，Baifukan, 1992))從作為DNA供體的微生物制備染色體DNA。然后，將ybjE基因連接到可在宿主微生物中操作的載體DNA來制備重組DNA。優選的，使用可在宿主微生物中自主復制的載體。可在大腸埃希氏菌中自主復制的載體的實例包括PUC19、PUC18、pHSG299、PHSG399、pHSG398、pACYC184 (pHSG 和 pACYC 可從 Takara Bio 獲得)、RSFlO 10、pBR322、pMW219 (pMW 可從 Nippon Gene 獲得)，等等。可在Coryneform細菌中自主復制的載體的實例包括pAM330 (JP58-67699A)、PHM1519 (JP58-77895A)、pVK7 (US2003-0175912)和 pSFK6 (JP2000-262288A)。此外，也可以使用在大腸埃希氏菌和Coryneform細菌中都可自主復制的所謂的穿梭載體。可在嗜甲基菌屬細菌中自主復制的載體的實例包括RSFIOIO和其衍生物，例如 pAYC32(Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D.Plasmid,16, pp.161-167 (1986))、pMFY42(Gene, 44, p.53(1990))、pRP301和 pTB70(Nature, 287，396，(1980))。為了通過連接ybjE基因和任何上述載體來制備重組DNA，用限制性內切酶消化所述載體和含有所述ybjE基因的片段，并且通常通過使用連接酶，例如T4DNA連接酶進行連接。為了將如上所述制備的重組DNA導入微生物中，可以采用迄今為止報道的任何已知轉化方法。可以采用例如，用氯化鈣處理受體細胞以提高DNA的透過性，針對大腸埃希氏菌已經報道了 (Mandel, M.and Higa, A., J.Mol.Biol.，53，159 (1970))，并使用從生長細胞制備的感受態細胞來導入DNA,對于Bacillus subtilis已經報道了(Duncan, C.H.,Wilson, G.A.and Young, F.E.，Gene, 1,153 (1977))。除這些方法之外，可以采用已經被報道適合于 Bacillus subtilis、放線菌和酵母的方法(Chang, S.and Choen, S.N.，Molec.Gen.Genet.,168，111 (1979) ；Bibb, M.J., Ward, J.M.and Hopwood, 0.A., Nature,274，398 (1978) ;Hinnen,A.，Hicks,J.B.and Fink,G.R.，Proc.Natl.Sc1.，USA,75，1929(1978))將重組DNA導入原生質體或原生質體樣受體細胞。此外,Coryneform細菌的轉化也可以通過電脈沖方法(Sugimoto等人，JP2-207791A)進行。ybjE基因的拷貝數也可以通過將多拷貝的基因整合到微生物的染色體DNA上來增加。為了將多拷貝的ybjE基因整合到微生物的染色體DNA上，可以通過靶向多拷貝存在于染色體DNA上的序列來進行同源重組。轉座子末端的重復DNA和反向重復可被用作多拷貝存在于染色體DNA上的序列。做為選擇，如在JP2-109985A中公開的，也有可能將ybjE基因摻入到轉座子中，并容許其被轉染，從而將多拷貝的基因整合到染色體DNA中。可以通過使用具有ybjE基因的部分序列的探針進行southern雜交來確認ybjE基因整合到染色體中。也可以如W000/18935中描述的通過用更強的表達調節序列替換染色體DNA或質粒上的表達調節序列，包括ybjE基因的啟動子，通過擴增提高ybjE基因表達的調節因子，或刪除或削弱降低ybjE基因表達的調節因子，來實現ybjE基因表達的增強。例如，Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子等等是已知的強啟動子。此外,還有可能的是向ybjE基因的啟動子區域導入幾個核苷酸替換使得所述啟動子更為強力。在Goldstein等人(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev., 1995,1,105-128)中公開了評估啟動子效力的方法和強力啟動子的實例。此外，已知的是，在核糖體結合位點(RBS)和翻譯起始密碼子之間的間隔區序列，特別是緊靠起始密碼子上游的幾個核苷酸，對翻譯效率有很大的影響。因此，可以修飾這種序列。 ybjE基因的表達調節序列可以使用用于啟動子鑒定的載體或基因分析軟件例如GENETYX來鑒定。通過這樣的啟動子替換或修飾來增強ybjE基因的表達。表達調節序列的替換也可以通過例如使用溫度敏感質粒來實現。Coryneform細菌的溫度敏感質粒的實例包括 p48K 和 pSFKT2 (JP2000-262288A)、pHSC4(參見法國專利 Laid-open PublicationN0.2667875，1992和JP5-7491A)，等等。在Coryneform細菌中這些質粒至少可以在25°C的溫度下自主復制，但在37°C的溫度下不能自主復制。表達調節序列的修飾可以與提高ybjE基因的拷貝數相組合。為了增強ybjE基因編碼的蛋白質的活性，可以向ybjE基因中導入增強L-氨基酸輸出能力的突變。提高ybjE基因編碼的蛋白質(YbjE蛋白質)的活性的突變的實例包括，啟動子序列中提高ybjE基因轉錄的突變和ybjE基因編碼區中提高YbjE蛋白質的比活性的突變。本發明的微生物優選的是在其中L-氨基酸輸出能力由于引起ybjE基因表達增加的修飾而被增強的微生物。在此使用的用語“L-氨基酸生產能力被增強”意思是，當培養被修飾以增強ybjE基因表達的微生物時，由所述微生物輸出到培養基中的L-氨基酸的數量超過從未修飾的菌株，例如親本菌株或相應的野生型菌株輸出的L-氨基酸的數量。通過測定培養基中L-氨基酸濃度的增加來觀察L-氨基酸輸出能力的增加。此外，也通過測定在ybjE基因導入微生物中時L-氨基酸的細胞內濃度的下降來觀察L-氨基酸輸出能力的增力口。與從未修飾的菌株輸出的L-氨基酸的數量相比較，從本發明的微生物輸出的L-氨基酸的數量優選的增加10 %或更多，更優選的30 %或更多，特別優選的50 %或更多。此外，也根據在ybjE基因導入微生物中時L-氨基酸的細胞內濃度的下降來觀察L-氨基酸輸出能力的增加。例如，可以如下測量L-氨基酸的細胞內濃度:向含有微生物細胞的培養基中添加具有1.07的比重的硅油，通過離心從培養基中收集細胞，優選的是在12，OOOrpm離心2分鐘。然后用 22%高氯酸處理細胞(A.1shizaki et al,Biotech.Teqniq.(1995)Vol9,N0.6,p409)。使用這樣制備的細胞,可以測量L-氨基酸的細胞內濃度。此外,可以通過使用反轉的(everted)膜囊測量放射性標記的L-氨基酸的細胞攝取來間接地檢查“L_氨基酸輸出能力” (J.Biol.Chem.，Vol.277, Issue 51,49841-49849)。例如，從在其中導入了 ybjE 基因的細胞制備反轉的膜囊。然后，向所述囊添加提供驅動能量的ATP或其他底物，測量放射性標記的L-氨基酸的細胞攝取。做為選擇，通過測量活性細胞中非標記氨基酸和標記氨基酸之間的轉換反應速率來檢測“L-氨基酸輸出能力”。此外，本發明的微生物優選的是由于引起ybjE基因表達增強的修飾而變得對L-氨基酸或L-氨基酸類似物更有抗性的微生物。也就是說，優選的本發明的微生物是在存在一定濃度的L-氨基酸或L-氨基酸類似物的情況下能夠生長的微生物，在所述濃度下未修飾的菌株不能生長。可以在含有高濃度的L-氨基酸或L-氨基酸類似物，例如，0.3g/L或更高的基本培養基中，來證實在存在L-氨基酸或L-氨基酸類似物的情況下的細胞生長。可以通過測量含有高濃度L-氨基酸或L-氨基酸類似物的基本培養基中所述菌株的生長，并與親本菌株或未修飾的菌株的生長進行比較來確認ybjE基因增強菌株的L-氨基酸或L-氨基酸類似物抗性。比較生長的方法包括比較每種菌株生長的培養基的580-660nm處光密度的方法。只要能抑制未修飾菌 株的生長，添加到培養基中的L-氨基酸或L-氨基酸類似物的濃度沒有特別的限制，優選的不少于0.3g/L。例如，以80g/L添加L-賴氨酸氫氯化物，以90g/L添加L-精氨酸氫氯化物，以45g/L添加L-鳥氨酸氫氯化物，以30g/L添加L-組氨酸氫氯化物，以12g/L添加L-異亮氨酸，以40g/L添加L-蘇氨酸，以15g/L添加L-谷氨酸單鈉，以8g/L添加L-苯丙氨酸，以85g/L添加L-脯氨酸，和以0.3g/L添加L-半胱氨酸。此外，本發明的微生物可以是由于引起ybjE基因表達增強的修飾而變得對L-賴氨酸或L-賴氨酸類似物更有抗性的微生物。L-賴氨酸類似物的實例包括溶菌素、賴氨酸異羥肟酸鹽、S- (2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y -甲基賴氨酸、α -氯己內酰胺，等等，但不限于這些。可以按照與上述的L-氨基酸或L-氨基酸類似物抗性相同的方法確認L-賴氨酸抗性。此外，本發明的微生物可以是由于引起ybjE基因表達增強的修飾而變得對L-精氨酸或L-精氨酸類似物更有抗性的微生物。L-精氨酸類似物的實例包括精氨酸異羥肟酸鹽、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽，等等。可以按照與上述的L-氨基酸或L-氨基酸類似物抗性相同的方法確認L-精氨酸或L-精氨酸類似物抗性。<2>生產L-氨基酸的方法本發明的生產方法包括在培養基中培養本發明的微生物以生產和促使L-氨基酸在培養基或所述微生物的細胞中的積累，并從所述培養基或細胞收集L-氨基酸。用于本發明的培養基可以選自通常用于利用微生物發酵的L-氨基酸發酵生產的公知的培養基。也就是說，可以使用含有碳源、氮源、無機離子，和如果有必要含有其他有機成分的普通培養基。對于碳源，可以使用糖類例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解產物，醇類例如甘油或山梨醇，或有機酸例如反丁烯二酸、檸檬酸或丁二酸。對于氮源，可以使用無機銨鹽例如硫酸銨、氯化銨或磷酸銨，有機氮例如大豆蛋白水解產物，氨氣，氨水，等等。期望的是以合適的數量向培養基中添加物質例如維生素BI和L-高絲氨酸、酵母提取物等作為有機痕量營養物。除了上述的，如有必要，少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。本發明使用的培養基可以是天然培養基或合成培養基，只要它含有碳源、氮源、無機離子，和如有必要含有 其他有機成分。優選的在有氧條件下進行培養I到7天。在培養期間，培養溫度優選的控制在24°C到37°C，pH值優選的控制在5到9。無機的或有機的酸性或堿性物質，以及氨氣等，可被用于調整PH值。通常可以通過公知技術的組合，例如通過利用離子交換樹脂、沉淀和其他技術從發酵肉湯收集L-氨基酸。當L-氨基酸在細胞中積累時，例如，可以通過超聲破碎來破壞細胞，可以通過離心除去破壞的細胞，可以使用離子交換樹脂等等從獲得的上清液收集L-氨基酸。如果在本發明的生產方法中使用甲醇作為主要碳源，降低了成本，因此具有同化甲醇的能力的微生物例如嗜甲基菌屬和甲基菌屬細菌是優選的。在這種情況下，可以根據典型的用于普通甲醇同化微生物的培養方法進行培養(參見，例如，W000/61723,JP2001-120269A等等)。當使用甲醇作為主要碳源進行培養時，優選的以0.001到30%的濃度向培養基添加甲醇。對于甲醇同化微生物的培養，優選的向培養基中添加硫酸銨等等，并用作氮源。此外，優選的以少量添加痕量成分，例如磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫Ife猛。甲醇同化微生物的培養優選的在伴隨著用于通風的搖動或攪動的有氧條件下，在5到9的pH值范圍，和在20到45°C的溫度下，通常進行24到120小時。通常可以通過公知技術的組合，例如通過利用離子交換樹脂、沉淀和其他技術從培養物收集L-氨基酸。從細胞收集L-氨基酸可以按照與如上所述相同的方法進行。
實施例在下文中，將參考以下非限制性實施例更具體地說明本發明。除非另有說明，用于以下實施例的試劑是從Wako Pure Chemicals或Nakarai Tesque獲得的。用于每個實施例的培養基的組成如下所示。對于所有的培養基用NaOH或HCl調整pH值。L培養基:Bacto trypton (Difco)10g/L酵母提取物(Difco)5g/L氯化鈉10g/LpH 7.0在120°C對這些培養基進行蒸氣滅菌20分鐘。L瓊脂培養基:L培養基Bacto 瓊脂15g/L
在120°C對這些培養基進行蒸氣滅菌20分鐘。基本培養基:(按照Molecular cloning Vol.3)
5*M9 鹽200 ml
20%葡萄糖20 ml
IM硫酸鎂2 ml
IMt 氣化鈣0.1 ml加至1L，調整 pH 7.0。5 * M9 鹽
鱗酸氬二鈉64 g
磷酸鉀15 g
氯化鈉2.5 g
氯化銨5.0 g加至IL在加至IL以后，在115°C對這些培養基進行蒸氣滅菌10分鐘，在合適的時間添加L-賴氨酸。基本瓊脂培養基:基本培養基Bacto 瓊脂15g/L
在115°C對這些培養基進行蒸氣滅菌10分鐘。用于埃希氏菌屬細菌的L-賴氨酸生產培養基:
葡萄糖40g/L
硫酸銨24 g/L
磷酸二氫鉀1.0 g/L
硫酸鎂七水化物1.0 g/L
硫酸鐵(IV >七水化物0.01 g/L
硫酸錳(IV)七水化物0.01 g/L
酵母提取物2.0 g/L
藥典碳酸鈣30 g/L用氫氧化鉀調節pH值到7.0，在115°C使成分進行蒸氣滅菌10分鐘，除了葡萄糖和MgSO4.7H20之外，這些單獨地滅菌。對于抗生素，添加50mg/L氯霉素。用于埃希氏菌屬細菌的L-精氨酸生產培養基:
葡萄糖60 g/L
(單獨地滅菌)
硫酸鎂七水化物I g/L
(單獨地滅菌)
硫酸銨25 g/L
磷酸二氬鉀2 g/L酵母提取物(Difco)5 g/L
維生素BI0.1 mg/L
pH 7.2
藥典碳酸鈣25 g/L
(單獨地滅菌)
用氫氧化鉀調節pH值到7.2，在115°C使成分進行蒸氣滅菌10分鐘，除了葡萄糖和MgSO4.7H20之外，這些單獨地滅菌。對于抗生素，添加50mg/L的氯霉素。用于嗜甲基菌屬細菌的L-賴氨酸生產培養基(SEII培養基):
權利要求
1.具有L-氨基酸生產能力的微生物，其中所述微生物被修飾從而ybjE基因的表達被增強。
2.根據權利要求1的微生物，其中通過提高所述基因的拷貝數目，或通過修飾所述ybjE基因的表達調節序列增強了所述ybjE基因的表達。
3.根據權利要求1的微生物，其中由所述基因編碼的蛋白質的氨基酸序列選自SEQ ID N0:2、9和10，其中所述蛋白質具有L-氨基酸輸出能力。
4.根據權利要求1的微生物，其中所述基因選自: Ca)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA ;和 (b)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸序列或與可從SEQ ID NO:1的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA，并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質。
5.根據權利要求1的微生物，其中所述基因選自: Ca)具有SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列的DNA ;和 (b)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列或與可從SEQID NO:1中核苷酸編號49到948的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA，并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質。
6.根據權利要求1的微生物，其中所述微生物的所述L-氨基酸輸出能力通過所述增強所述基因的表達來提高。
7.根據權利要求1的微生物`，其中所述微生物對L-氨基酸或L-氨基酸類似物的抗性通過所述增強所述基因的表達來提高。
8.根據權利要求1到7任一項的微生物，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。
9.根據權利要求1到7任一項的微生物，其中所述微生物屬于腸桿菌家族。
10.根據權利要求9的微生物，其中所述屬于腸桿菌科家族的微生物是屬于包括大腸桿菌iEscheri chi a co7i )的埃希氏菌屬的微生物。
11.根據權利要求1到7任一項的微生物，其中所述微生物是包括谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum')的 Coryneform 細菌。
12.根據權利要求1到7任一項的微生物，其中所述微生物是甲醇同化細菌。
13.根據權利要求12的微生物，其中所述甲醇同化細菌是屬于包括食甲基嗜甲基菌(Me thylophi Ius me thy I o trophus )的嗜甲基菌屬，或包括糖原甲基菌(Me thylobaci Ilusglycogenes')取 Methylobacillus flagel la turn 的甲基菌屬的微生物。
14.生產L-氨基酸的方法，包括在培養基中培養根據權利要求1到13任一項的微生物來產生和引起所述L-氨基酸的積累，并從所述培養基或所述微生物收集所述L-氨基酸。
15.生產L-氨基酸的方法，包括在含有甲醇作為主要碳源的液體培養基中培養根據權利要求12或13的微生物來產生和引起所述L-氨基酸的積累，并從所述培養基或所述微生物收集所述L-氨基酸。
16.根據權利要求14或15的方法，其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸。
全文摘要
通過培養具有生產L-氨基酸的能力、但被修飾以使ybjE基因的表達被增強的微生物，來生產L-氨基酸。從培養基或從微生物收集L-氨基酸。
文檔編號C07K14/245GK103146593SQ20121038565
公開日2013年6月12日 申請日期2005年1月28日 優先權日2004年1月30日
發明者植田拓嗣, 中井勇太, 郡司義哉, 瀧川里繪, 城永祐志 申請人:味之素株式會社