生產l-氨基酸的微生物及使用所述微生物生產l-氨基酸的方法
【專利摘要】公開了具有增強的L?氨基酸生產能力的重組微生物，其中所述重組微生物被轉化而具有失活的其噬菌體受體，和使用所述重組微生物生產L?氨基酸的方法。重組微生物的使用可以使L?氨基酸能夠以高度有效的方式生產。KCCM11501P20131213
【專利說明】
生產L-氨基酸的微生物及使用所述微生物生產L-氨基酸的 方法
技術領域
[0001]本發明涉及生產L-氨基酸的重組微生物和使用重組微生物生產L-氨基酸的方法。
【背景技術】
[0002] 已經使用各種使用微生物來大量生產有用代謝物，例如氨基酸的發酵方法，并且 此外，為了使用微生物進行成功的發酵，已經開發出許多技術，包括菌株開發、發酵條件的 建立，等等。特別地，為了開發用于大量生產有用的代謝物的宿主菌株，已經進行了許多嘗 試以誘導特定基因的過表達或低表達。
[0003] 然而，在使用細菌的發酵生產中，有用的代謝物的生產可以由于噬菌體的污染而 降低。噬菌體的污染主要由能夠使噬菌體附著于細菌表面的噬菌體受體引起，所述噬菌體 受體是蛋白質、脂質多糖，等等。在大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)的情況中，大腸桿 菌受到多種噬菌體攻擊，因而，用于每種噬菌體的受體的研究已經獲得相對成功。然而，噬 菌體受體和L-氨基酸生產之間的關系的研究仍然沒有得到充分實施。
[0004]在這點上，本發明的發明人選擇作為公知的噬菌體受體的基因，然后使基因中的 每種失活，以降低L-氨基酸生產降低的風險，該風險被認為是大腸桿菌的弱點。此后，確認 了對L-氨基酸生產的影響，并且對產L-氨基酸的菌株應用此類選擇和基因的失活，從而完 成本發明。
[0005] 發明詳述
[0006] 技術問題
[0007] 本發明提供了具有L-氨基酸生產能力和失活的噬菌體受體的重組微生物。
[0008] 本發明提供了使用微生物生產L-氨基酸的方法。
[0009] 技術方案
[0010]在一個方面中，本發明提供了生產L-氨基酸的重組微生物，其中NfrA和NfrB中的 至少一種是失活的。
[0011] 如本文中使用，術語"NrfA"指形成用于噬菌體N4的受體的蛋白質，并且可以是細 菌的膜蛋白。例如，NrfA可以是外膜蛋白的亞基。例如，NfrA可以包括SEQ ID N0:40的氨基 酸序列。例如，NfrA可以包括SEQ ID N0:40的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:40的氨基酸具有 約80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。編碼 NfrA的基因的序列可以包括編碼SEQ ID N0:40的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，編碼 NfrA的基因的序列可以包括nfrA基因的序列(NCBI基因 ID: 12930896)。例如，編碼NfrA的基 因的序列可以包括SEQ ID N0:39的多核苷酸序列，或與SEQ ID N0:39的多核苷酸序列具有 約80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的多核苷酸序列。
[0012] 如本文中使用，術語"NfrB"指形成用于噬菌體N4的受體的蛋白質，并且可以是細 菌的膜蛋白。例如，NfrB可以是內膜蛋白的亞基。例如，NfrB可以包括SEQ ID N0:42的氨基 酸序列。例如，NfrB可以包括SEQ ID N0:42的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:42的氨基酸具有 約80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。編碼 NfrB的基因的序列可以包括編碼SEQ ID NO:42的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，編碼 NfrB的基因的序列可以包括nfrB基因的序列（NCBI基因10:12933943)。例如，編碼財池蛋白 的基因的序列可以包括SEQ ID N0:41的多核苷酸序列，或與SEQ ID N0:41的多核苷酸序列 具有約80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的多核苷酸序 列。
[0013]另外，在生產L-氨基酸的重組微生物中，Tsx和FhuA中的至少一種可以是進一步失 活的。
[0014]如本文中使用，術語"Tsx"指形成核苷通道的蛋白質，即對核苷特異性的通道，并 且可以是形成用于噬菌體T6和大腸菌素 K的受體的組分。例如，Tsx可以包括SEQ ID N0:45 的氨基酸序列，或者與SEQ ID N0:45的氨基酸序列具有約80%或更多、85%或更多、90%或 更多、或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。編碼基因 Tsx的基因的序列可以包含編碼 SEQ ID N0:45的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，編碼Tsx的基因的序列可以包括tsx基 因的序列（NCBI基因 ID: 12934188)。例如，編碼Tsx的基因的序列可以包括SEQ ID N0:44的 多核苷酸序列，或與SEQ ID N0:44的多核苷酸序列具有約80%或更多、85%或更多、90%或 更多、或95%或更多的序列同一性的多核苷酸序列。
[0015] 如本文中使用，術語"FhuA"指轉運(Fe3+)鐵色素(ferrichrome)或抗生素，諸如阿 波霉素(albomycin)和利福霉素(rifamycin)的細菌外膜中的多功能蛋白，并且可以是菌 體T1、T5和phi80的受體。例如，FhuA可以包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列，或與SEQ ID N0: 47的氨基酸序列具有約80 %或更多、85 %或更多、90 %或更多、或95 %或更多的序列同一性 的氨基酸序列。編碼FhuA的基因的序列可以包括編碼SEQ ID N0:47的氨基酸序列的多核苷 酸序列。例如，編碼FhuA蛋白的基因的序列可以包括fhuA基因的序列（NCBI基因 ID : 12930751)。例如，編碼FhuA的基因的序列可以包括SEQ ID N0:47的多核苷酸序列，或與SEQ ID N0:47的多核苷酸序列具有約80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序 列同一性的多核苷酸序列。
[0016] 如本文中使用，術語"同一性"指兩種氨基酸序列之間的相同性，其可以通過本領 域中公知的方法，例如BLAST 2.0算法測定，所述BLAST 2.0算法限定參數，諸如兩種氨基酸 序列之間的得分、同一性、和相似性。
[0017] 如本文中使用，術語"重組微生物"指遺傳修飾的微生物。重組微生物可以是遺傳 工程化的微生物，并且例如，可以根據遺傳工程方法將外源核酸導入微生物，或者可以轉化 微生物中的內源基因的序列或位置。
[0018] 如本文中使用，術語"L-氨基酸"指構成生物體的機體并且具有與相同碳原子附著 的氨基基團和羧酸基團兩者的蛋白質的基本結構單位。例如，L-氨基酸可以選自：L-亮氨 酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例 如，L-氨基酸可以是L-色氨酸或L-蘇氨酸。
[0019]如本文中使用，術語"酶或蛋白質是失活的"或"酶或蛋白質的失活"指上文描述的 蛋白質根本不在微生物中表達的情況、上文描述的蛋白質得到表達，但是沒有任何活性的 情況、或上文描述的蛋白質得到表達，但是其活性與內在活性相比較弱的情況。如本文中使 用，術語"內在活性"指天然狀態的微生物的活性，即最初存在于微生物中的活性，或者尚未 遺傳修飾的蛋白質的活性。
[0020] 可以通過分別編碼NfrA蛋白、NfrB蛋白、Tsx蛋白、和FhuA蛋白的基因的突變、缺失 或破壞引起NfrA蛋白、NfrB蛋白、Tsx蛋白、和FhuA蛋白的失活。如本文中使用，術語"基因的 突變、缺失或破壞"指突變、取代、缺失或用至少一個堿基插入部分或整個的基因或基因的 啟動子或終止子區域上的調節因子，使得不表達基因或少量表達基因，或者在不顯示酶促 活性的情況下或者在降低的酶促活性的情況下表達基因的情況。可以通過遺傳操作，諸如 同源重組、誘變或分子進化實現基因的突變、缺失或破壞。當細胞包含多個相同基因或至少 兩個同源基因時，可以在細胞中缺失或破壞一個或多個基因。為了失活本發明的一個實施 方案中提供的基因，可以實施使用lambda Red重組酶制備突變體的方法。
[0021] 重組微生物除去或降低本文中提供的每種蛋白質或組合的蛋白質的活性。因而， 與蛋白質活性沒被失活的情況相比，重組微生物可以具有增強的L-氨基酸生產能力 (producibility)，并且因此，可以為了生產L-氨基酸的目的適當使用重組微生物。
[0022] 重組微生物可以是埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterbacter)、歐文氏 菌屬（Erwinia)、沙雷菌屬（Serratia)、普羅威登斯菌屬（Providencia)、棒桿菌屬 (Corynebacterium)、和短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物。例如，重組微生物可以是埃 希氏菌屬的微生物。埃希氏菌屬的微生物可以是大腸桿菌，例如大腸桿菌KCCM11501P。大腸 桿菌KCCM11501P是通過使用產蘇氨酸的菌株(KCCM10910P)作為母本菌株，并且實施nfrA和 nfrB基因兩者的缺失制備的KCCM10910PAnfrAB菌株。這里，發現了大腸桿菌KCCM11501P中 的糖消耗能力高于母本(KCCM10910P)中的。大腸桿菌KCCM11501P命名為"大腸桿菌CA03-8253P"，然后在布達佩斯條約下在2013年12月13日保藏于韓國微生物保藏中心(在下文，稱 為 "KCCM"）。
[0023] 根據本發明的另一個方面，公開了生產L-氨基酸的方法，所述方法包括:培養生產 L-氨基酸的重組微生物;并且從培養產物中收集L-氨基酸。
[0024]生產L-氨基酸的重組微生物與上文的描述相同定義。
[0025] L-氨基酸可以選自：L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異 亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例如，L-氨基酸可以是L-蘇氨酸或L-色氨酸。可以使用適 當的培養基和根據本領域中公知的培養條件實現重組微生物的培養。另外，本領域普通技 術人員可以根據選定的微生物適當調節培養基和培養條件。培養方法可以包括分批培養、 連續培養、補料-分批培養、或其組合。
[0026] 培養基可以包含多種碳源、氮源和微量元素成分。
[0027] 例如，碳源可以包含碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，淀粉和纖維 素;脂肪，如大豆油，向日葵油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸，亞油酸;醇，例 如甘油和乙醇；和有機酸，如乙酸，或其組合。重組微生物的培養可以通過使用葡萄糖作為 碳源進行。例如，氮源可以包括有機氮源，如蛋白胨，酵母提取物，肉汁，麥芽提取物，玉米漿 (CSL)和大豆粉;和無機氮源，如尿素，硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨;或其組合。 培養基可以包括磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀作為磷源。另外，培養基可包括對應于磷源的含鈉 鹽，和金屬鹽，如硫酸鎂或硫酸鐵。另外，培養基可包括氨基酸，維生素和適當的前體。培養 基或培養基的個別成分可以以分批或連續的方式加入到培養基中。
[0028] 另外，化合物，如氫氧化銨，氫氧化鉀，氨水，磷酸和硫酸可以以適當的方式在重組 微生物的培養過程中加入到培養基中，以便調節培養基的pH值。此外，防沫劑，如脂肪酸聚 乙二醇酯，可在重組微生物的培養過程中使用的，以便抑制氣泡的產生。為了維持培養基的 需氧條件，氧氣或含氧氣體的需氧條件(例如，空氣)可以被注入到培養基中。這里，培養基 的溫度通常可以在約20°C至約45°C的范圍內。培養重組微生物的時段可以持續到獲得L-氨 基酸的期望量，并且例如，培養重組微生物可以持續約10小時至約160小時。
[0029] 如本文中使用，術語"培養產物"指含有重組微生物的肉湯培養物、除去微生物細 胞的培養上清液、或培養產物的稀釋溶液。培養基可以進一步包含用于提高L-氨基酸的生 產能力的成分。例如，組成可以進一步包含碳源、氮源或微量元素成分。
[0030] 可以通過本領域中已知的適當培養條件，如分批培養、連續培養、或補料-分批培 養實施從培養產物收集L-氨基酸，從而收集或回收培養產物中產生的L-氨基酸。
[0031] 本發明的有益效果
[0032] 根據一個方面，可以使用具有至少一種蛋白質的除去或降低的活性的微生物生產 L-氨基酸，所述蛋白質選自：NfrA蛋白、NfrB蛋白、Tsx蛋白和FhuA蛋白。
[0033]根據另一個方面，可以使用生產L-氨基酸的方法以高效的方式生產L-氨基酸。 實施例
[0034]在下文中，將參考以下實施例更為詳細描述本發明。這些實施例僅為了例示的目 的，而并不意圖限制本發明的范圍。
[0035]實施例1:通過使用KCCM10910P制備具有失活的噬菌體受體的產蘇氨酸的菌株 [0036]為了制備具有失活的噬菌體受體的產蘇氨酸的菌株，使用KCCM10910P菌株(韓國 專利公開文本No: 10-0966324)作為母本菌株。然后，制備用于失活用于每種噬菌體受體的 基因的盒，然后用于允許遺傳轉化。
[0037] l-ι.制備具有失活的nfrA基因的產蘇氨酸的菌株
[0038] 為了制備具有失活的nfrA基因的產蘇氨酸的菌株，制備用于失活nfrA基因的盒。 所述盒使用一步失活的方法，該方法是由Datsenko KA等人(Proc Natl Acad Sci USA·， (2000)97:6640-6645)開發的使用lambda Red重組酶構建突變體的技術。為了確認盒對基 因的插入，使用pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因作為標志物(韓國專利N0:2009-007554)。
[0039] 通過使用SEQIDN0:2和3的引物組獲得l.lkbDNA片段，該DNA片段包含nfrA基因 的序列（SEQ ID NO:39)的一部分和pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因的堿基序列的一部分。 這里，通過在下述條件下使用PCR預混合物試劑盒（即BI0NEER公司的產品，在下文中，使用 相同的產品）實施聚合酶鏈式反應(在下文中，稱為"PCR"）：于95°C變性30秒，于56°C退火30 秒，和于72°C延長1分鐘的27個循環。在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳PCR產物，然后洗脫。此后， 通過在上文描述的相同條件下使用洗脫的產物作為模板和SEQ ID NO: 1和4的引物組再次 實施PCR，產生約1.2kb的DNA片段。在0.8 %瓊脂糖凝膠上電泳DNA片段，然后洗脫，最終用于 制備用于失活nrf A基因的盒。
[0040] 為了制備具有失活的nfrA基因的產蘇氨酸的菌株，將產蘇氨酸的菌株 (KCCM10910P)(其依照Datsenko KA等人（Proc Natl Acad Sci USA. ,(2000)97:6640-6645)開發的方法轉化有pKD46質粒)制備為感受態菌株。然后，將為了失活nfrA基因而制備 的盒的DNA導入菌株以允許轉化。
[0041 ]在具有氯霉素抗性的LB板上選擇獲得的菌株。也就是說，使用SEQ ID NO: 5和6的 引物組(其具有位于用于基因組失活的盒的nfrA同源序列的兩個末端外部的DNA序列），從 而選擇所得的PCR產物的大小從2.8kb降低到1.5kb的菌落。
[0042]對具有氯霉素抗性的原代重組菌株除去pKD46質粒，然后導入pJW168質粒以從微 生物細胞除去氯霉素標志物基因 （Gene ,(2000)247,255-264)。然后，使用SEQ ID N0:5和6 的引物組實施PCR以獲得0.4kb DNA產物，其指示最終獲得的菌株具有降低的DNA大小。因 而，制備好具有失活的nfrA基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P Δ nfrA)。
[0043] 1-2.制備具有失活的nfrB基因的產蘇氨酸的菌株
[0044]為了制備具有失活的nfrB基因 （SEQ ID N0:41)的產蘇氨酸的菌株，以與實施例1-1制備用于失活nfrA基因的盒中相同的方式制備用于失活nfrB基因的盒。通過使用SEQ ID N0:8和9的引物組獲得l.lkb DNA片段，然后通過使用SEQ ID N0:7和10的引物組制備1.2kb DNA片段。
[0045]通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備具有失活的nfrB基因的產蘇氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID NO: 11和12的引物組來確認所得的PCR產物的大小。因而，最終 制備具有失活的nfrB基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P Δ nfrB)。
[0046] 1-3.制備具有失活的nfrAB基因的產蘇氨酸的菌株
[0047]為了制備具有失活的nfrAB基因 （SEQ ID N0:43)的產蘇氨酸的菌株，以與實施例 1-1制備用于失活nfrA基因的盒中相同的方式制備用于失活nfrAB基因的盒。通過使用SEQ ID N0:2和9的引物組獲得l.lkb DNA片段，然后通過使用SEQ ID NO: 1和10的引物組制備 1.2kb DNA片段。
[0048]通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備具有失活的nfrAB基因的產蘇氨酸的 菌株的方法，其中使用SEQ ID N0:5和12的引物組來確認所得的PCR產物的大小。因而，最終 制備具有失活的nfrAB基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P Δ nfrAB)。
[0049] 1-4.制備具有失活的tsx基因的產蘇氨酸的菌株
[0050] 為了制備具有失活的tsx基因 （SEQ ID N0:44)的產蘇氨酸的菌株，以與實施例1-1 制備用于失活nfrA基因的盒中相同的方式制備用于失活tsx基因的盒。通過使用SEQ ID NO: 13和14的引物組獲得l.lkb DNA片段，然后通過使用SEQ ID NO: 15和16的引物組制備 1.2kb DNA片段。
[0051] 通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備具有失活的tsx基因的產蘇氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID N0:17和18的引物組來確認所得的PCR產物的大小。因而，最終 制備具有失活的tsx基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P Δ tsx)。
[0052] 1-5.制備具有失活的fhuA基因的產蘇氨酸的菌株
[0053]為了制備具有失活的fhuA基因 （SEQ ID N0:46)的產蘇氨酸的菌株，根據上文描述 的一步失活的方法制備用于失活fhuA基因的盒。為了獲得與fhuA基因的序列具有同源性的 堿基序列的DNA片段，使用SEQ ID N0:19和20的引物組和SEQ ID N0:21和22的引物組，導致 產生PCR產物。另外，為了獲得含具有氯霉素抗性的堿基序列的DNA片段，使用SEQ ID N0:23 和24的引物組，導致產生PCR產物。因而，在0.8 %瓊脂糖凝膠上電泳這三種所得的PCR產物， 然后洗脫。通過使用這三種洗脫的PCR產物作為模板和SEQ ID N0:19和22的引物盒實施PCR 以制備用于失活fhuA基因的盒。
[0054] 為了制備具有失活的fhuA基因的產蘇氨酸的菌株，通過實施例1-1中描述的相同 方法實施制備用于失活fhuA基因的盒，其中使用SEQ ID N0:25和26的引物組來確認所得的 PCR產物的大小。因而，最終制備具有失活的fhuA基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910PA fhuA) 〇
[0055] 1-6.制備具有失活的lamB基因的產蘇氨酸的菌株
[0056]為了制備具有失活的lamB基因 （SEQ ID N0:48)的產蘇氨酸的菌株，通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備用于失活lamB基因的盒。通過使用SEQ ID N0:27和28的引物 組獲得l.lkb DNA片段，然后通過使用SEQ ID N0:29和30的引物組制備1.2kb DNA片段。 [0057]通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備具有失活的lamB基因的產蘇氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID N0: 31和32的引物組來確認所得的PCR產物的大小。因而，最終 制備具有失活的lamB基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P Δ lamB)。
[0058] 1-7.制備具有失活的btuB基因的產蘇氨酸的菌株
[0059]為了制備具有失活的btuB基因 （SEQ ID N0:50)的產蘇氨酸的菌株，通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備用于失活btuB基因的盒。通過使用SEQ ID N0:33和34的引物 組獲得l.lkb DNA片段，然后通過使用SEQ ID N0:35和36的引物組制備1.2kb DNA片段。 [0060]通過實施例1-1中描述的相同方法實施制備具有失活的btuB基因的產蘇氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID N0: 37和38的引物組來確認所得的PCR產物的大小。因而，最終 制備具有失活的btuB基因的產L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P Δ btuB)。
[0061 ]實施例2:重組微生物間的L-蘇氨酸生產能力的比較
[0062] 在錐形瓶中在含有下文表1中顯示的組成的蘇氨酸滴定培養基中培養根據實施例 1制備的重組微生物。然后，確認重組微生物是否具有L-蘇氨酸的生產能力。
[0063] 【表1】
[0065]在25ml含有上文表1中顯示的組成的滴度培養基中接種1鉑環的在33°C的培養箱 中在LB固體培養基中培養過夜的實施例1的7類大腸桿菌菌株之每種和KCCM10910P菌株，然 后在培養箱中在33°C并且以200rpm培養48小時。
[0066]【表2】
[0069] 如上文表2中顯示，確認分別具有失活的11；1^\、11；^13、11；1^413、七81和;〇11^基因的菌株 的糖消耗率高于母本菌株(KCCM10910P)的糖消耗率。還確認了菌株的生產速率在48小時時 段期間不降低。同時，確認分別具有失活的lamB和btuB基因的菌株的糖消耗率類似于母本 菌株的糖消耗率，或略低于母本菌株的糖消耗率。還確認了 48小時后的培養物菌株中顯示 的L-蘇氨酸濃度都是類似的。分別具有失活的nfrA、nfrB和nfrAB基因的菌株產生相同的培 養結果。也就是說，兩種基因之一被缺失的情況和兩種都被缺失的情況產生相同的結果。
[0070] 實施例3:制備具有有效突變組合的菌株和其L-蘇氨酸生產能力的比較
[0071] 3-1.制備具有同時失活的nfrAB和fhuA基因、同時失活的nfrAB和tsx基因、和同時 失活的nfrAB、tsx和fhuA基因的菌株
[0072 ]為了確認具有增加的糖消耗能力的nfrAB、fhuA和tsx基因的組合失活的情況是否 在產L-蘇氨酸的菌株中具有進一步的糖消耗能力，制備KCCM10910P Δ nfrAB Δ fhuA菌株、 KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株和KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株。為了制備這些菌 株，以與實施例1中的描述相同的方式根據實施例1-3的KCCM10910PAnfrAB菌株制備分別 具有失活的fhuA和tsx基因的菌株(產生KCCM10910P Δ nfrAB Δ fhuA和KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株）。另外，根據KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株制備具有失活的fhuA基因的菌株，從 而最終制備KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株。
[0073] 如表2中顯示，確定具有失活的nfrA、nfrB和nfrAB基因的菌株彼此具有相同的效 果。在這點上，在制備具有有效突變組合的菌株中，通過使用具有失活的nfrAB基因的菌株 制備具有失活的tsx和fhuA基因的菌株。然而，確定具有失活的tsx和fhuA基因的菌株的效 果與具有僅失活的nfrA基因、僅失活的nfrB基因、或同時失活的nfrA和nfrB基因的菌株的 效果相冋。
[0074] 3-2.具有有效的突變組合的菌株的L-蘇氨酸生產能力的比較
[0075]為了比較上文制備的具有有效突變組合的菌株的L-蘇氨酸生產能力，使用含有上 文表1中顯示的組成的培養基以與上文描述的相同方式培養菌株。
[0076] 下文表3中顯示了結果。
[0077] 【表3】
[0078]
[0079 ]作為具有增加的糖消耗能力的分別根據nf r AB、f huA、和t s X基因的組合失活制備 的KCCM10910P Δ nfrAB Δ fhuA菌株、KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株和KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株上的效力測試的結果，確認除了僅通過nfrAB基因的突變外進一步失活fhuA 基因或tsx基因的菌株增加糖消耗能力。因而，顯示增加的糖消耗能力的經轉化的大腸桿菌 KCCM10910P Δ nfrAB菌株命名為"CA03-8253P"，并且在2013年12月13日保藏于韓國微生物 保藏中心(KCCM)(保藏號:KCCM 11501P)。
[0080]實施例4:通過使用KCCM-10132制備具有失活的噬菌體受體的菌株和其蘇氨酸生 產能力的比較
[0081 ] 4-1.通過使用KCCM-10132制備具有失活的噬菌體受體的菌株
[0082]根據實施例1的7類失活盒，以與實施例1和3中描述的相同方式，通過使用KCCM-10132菌株制備各自具有失活的噬菌體受體的10類菌株(參見下文表4) ICCM-10132菌株在 韓國專利申請No: 10-0270510中以從大腸桿菌衍生的具有蘇氨酸生產能力的菌株公開。 [0083] 4-2.通過使用KCCM-10132制備具有失活的噬菌體受體的菌株及其蘇氨酸生產能 力的比較。
[0084]通過與實施例2中描述的相同方法在含有表1中顯不的組成的培養基中培養通過 使用實施例4-1的KCCM-10132菌株制備的具有失活的噬菌體受體的10類菌株和母本菌株 (KCCM-10132)。然后，通過比較其蘇氨酸的生長能力評估培養的菌株。
[0085]【表4】
[0087] 如上文表4中顯示，確認了分別具有失活的11；1^4、11；^13、11；1^\13、七81和;〇11^基因的菌 株的糖消耗率高于母本菌株(KCCM-10132)的糖消耗率。還確認了菌株的生產速率在48小時 時段中沒有降低。同時，確認了分別具有失活的lamB和btuB基因的菌株的糖消耗率類似于 母本菌株的糖消耗率，或者略低于母本菌株的糖消耗率。還確認了48小時后培養物的菌株 中顯示的L-蘇氨酸濃度都是相似的。還確認了分別具有同時失活的nfrAB、fhuA、nfrAB和 tsx基因和同時失活的nfrAB、tsx和fhuA基因的菌株與僅具有失活的nfrAB基因的菌株的糖 消耗率相比具有改善的糖消耗率。
[0088]實施例5:通過使用KCCM11166P制備具有失活的噬菌體受體的菌株及其蘇氨酸生 產能力的比較
[0089] 5-1.通過使用KCCM11166P制備具有失活的噬菌體受體的菌株 [0090]根據實施例1的7類失活盒，通過以與實施例1中描述的相同方式（韓國專利申請 No: 10-1261147)使用KCCM11166P(韓國專利申請N0:10-1261147)制備分別具有失活的噬菌 體受體的7類產色氨酸的菌株。
[0091] 5-2.通過使用KCCM11166P制備具有失活的噬菌體受體的菌株及其蘇氨酸生產能 力的比較
[0092]為了評估通過使用實施例5-1的KCCM11166P菌株制備的分別具有失活的噬菌體受 體的7類產色氨酸的菌株的生產能力，使用含有下文表5中顯示的組成的培養基。也就是說， 通過鉑環接種微生物細胞，然后在LB固體培養基中培養過夜。此后，將1鉑環的每種微生物 在25ml含有下文表5中顯示的組成的滴度培養基中接種，然后在培養箱中在37°C和以 200r Pm培養48小時。從其獲得的結果顯示于下文表6中。
[0098] 如上文表6中顯示，在11；1^4、11；1^13、11；1^413、七81和;1^111^基因中的每種的缺失的情況 中，確認了分別具有失活的1^^、11；^13、11；^413、七81和;^11^基因的菌株中生成的色氨酸的量 是類似的，而分別具有失活的11；^4、11；^8、11；^48、丨81和;〇11^基因的菌株的糖消耗率略高于 其它菌株。同時，在lamB和btuB基因中的每種的缺失的情況中，確認了由分別具有失活的 lamB和btuB基因的菌株生成的色氨酸的量或分別具有lamB和btuB基因失活的菌株的糖消 耗率沒有變化。
[0099]實施例6:制備具有有效突變組合的菌株及其L-色氨酸生產能力的比較
[0100] 6-1.制備具有同時失活的nfrAB和fhuA基因、同時失活的nfrAB和tsx基因、和同時 失活的nfrAB、tsx和fhuA基因的產L_色氨酉愛的菌株
[0101] 為了確認具有增加的糖消耗能力的nfrAB、fhuA和tsx基因的組合失活的情況在產 色氨酸的菌株中是否具有進一步的糖消耗能力，制備KCCM11166P Δ nfrAB Δ fhuA菌株、 KCCM11166P Δ nfrAB Δ tsx菌株、和KCCM11166P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株。
[0102] 6-2.具有有效突變組合的菌株的L-色氨酸生產能力的比較
[0103] 為了比較根據實施例6-1制備的三類菌株的L-色氨酸生產能力，使用含有上文表5 中顯不的組成的培養基以與實施例5中描述相同的方式培養菌株。下文表7中顯不了結果。
[0104] 【表7】
[0107] 作為具有有效突變組合的產色氨酸的菌株上的效力測試的結果，確認了在僅通過 nfrAB基因的突變外進一步失活fhuA基因或/和tsx基因的菌株增加糖消耗能力。
[0108] 應當理解，本文中描述的示例性的實施方案應當僅在描述的意義上而不出于限制 目的考慮。每個實施方案內的特征或方面的描述通常應當視為可用于其它實施方案中的其 它類似的特征或方面。雖然已經參考附圖描述了本發明的一個或多個實施方案，但是本領 域普通技術人員應當理解，可以在不偏離以所附權利要求書限定的本發明的精神和范圍的 前提下對其進行形式和細節上的各種變化。
[0109] [保藏號]
[0110] 保藏機構:韓國微生物保藏中心（國際）
[0111] 保藏號:KCCM11501P
[0112] 保藏日：2013年12月13日
【主權項】
1. 生產L-氨基酸的埃希氏菌屬的重組微生物，其中NfrA和NfrB中的至少一種是失活 的。2. 權利要求1的重組微生物，其中所述NfrA包含SEQ ID N0:40的氨基酸序列，并且所述 NfrB包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。3. 權利要求1的重組微生物，其中Tsx和FhuA的至少一種是進一步失活的。4. 權利要求3的重組微生物，其中所述Tsx包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，并且所述 FhuA包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。5. 權利要求1的重組微生物，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸或L-色氨酸。6. 權利要求1的重組微生物，其中所述重組微生物是大腸桿菌。7. 生產L-氨基酸的方法，所述方法包括： 培養權利要求1至6中任一項的重組微生物;并 從培養物中收集L-氨基酸。8. 權利要求7的方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸或L-色氨酸。
【文檔編號】C12P13/04GK105980544SQ201580006219
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年3月17日
【發明人】李知宣, 徐昌, 徐昌一, 丁起龍, 高恩圣, 權刀顯, 李光鎬
【申請人】Cj第制糖株式會社, Cj第一制糖株式會社