一種裸眼和熒光增強檢測含巰基氨基酸熒光分子探針的合成及應用的制作方法【專利摘要】本發明涉及一種裸眼識別熒光增強型含巰基氨基酸熒光探針的制備方法和應用，具體為一種基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的制備和檢測巰基氨基酸的應用。本發明的熒光探針是以二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物和硝基甲烷直接反應而合成，經過柱層析分析得到探針純品。合成簡便、反應條件溫和、易于純化、合成收率高。本發明所述的探針分子最大吸收波長在519nm，在50％乙腈水溶液中溶解性較好，光學性能穩定；探針分子隨含巰基氨基酸的加入，吸收波長由519nm藍移到506nm，熒光光譜在520nm處強度不斷增強，最大增強150倍，同時相應的溶液顏色由粉色變為黃色。本發明克服了現有熒光探針對含巰基氨基酸的響應僅基于熒光強度變化的不足。本發明所述的探針分子靈敏度較高，，對含巰基氨基酸識別能力強，響應速度快，響應范圍為0-1000μM，對Cys，GSH和Hcy巰基氨基酸的檢測限分別為0.45μM，0.21μM和0.12μM，檢測范圍寬，檢測下限低，使得該類型探針在生物化學、環境科學等領域具有重要的實際應用價值。【專利說明】一種裸眼和熒光增強檢測含巰基氨基酸熒光分子探針的合成及應用【
技術領域：
】[0001]本發明涉及的是化學分析檢測【
技術領域：
】，具體涉及一種裸眼及熒光增強檢測含巰基氨基酸熒光分子探針的制備方法以及該熒光分子探針在檢測含巰基氨基酸方面的應用。【
背景技術：
】[0002]含有巰基的氨基酸和多肽在許多生理過程中扮演著重要的角色。例如，半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)被認為與一些疾病緊密相關，如腎功能衰竭，老年癡呆癥和帕金森氏病，動脈粥樣硬化性血管疾病，以及冠狀動脈心臟疾病。還原性谷胱甘肽(GSH)是主要的內源性抗氧化劑，被視為氧化應激能力的指示劑，生物體內巰基含量也可能受到一些氧化應激反應的影響。同時，利用巰基探針識別生物體釋放出的硫醇可以用于間接檢測相關生物酶以及評價相應抑制劑的活性。因此，尋求快速，靈敏選擇性檢測生物巰基越來越受到人們的重視(GilesNM.,WattsAB，GilesGI,FryFH，LittlechildJA，JacobC.Metalandredoxmodulationofcysteineproteinfunction.[J]Chemistry&biology2003；10(8):677-693.WangW,Rusin0,XuX,KimKK，EscobedoJO,FakayodeSO,FletcherKA,LowryM，SchowalterCM，LawrenceCM,FronczekFR,WarnerIM，StronginRM.Detectionofhomocysteineandcysteine.[J]JournaloftheAmericanChemicalSociety2005；127(45):15949-15958.SeshadriS，BeiserA，SelhubJ，JacquesPF,RosenbergIH，D’AgostinoRB,WilsonPW,WolfPA.PlasmahomocysteineasariskfactorfordementiaandAlzheimerfsdisease.[J]NewEnglandJournalofMedicine2002；346(7):476-483.)0[0003]目前，已報道了一些分析方法來檢測含巰基氨基酸，主要包括高效液相色譜，毛細管電泳，電化學檢測，光分析和質譜鑒定技術。但這些方法都是限用于體外實驗，不可以應用于在活體細胞中檢測含`巰基氨基酸。熒光探針可以有效的，專一的在活體細胞里成像，具有較好的靈敏性。因此，一些基于化學反應型的熒光探針已被報道，主要是利用邁克爾加成反應，與醛的環化反應，裂解反應等完成化學轉化實現熒光檢測含巰基氨基酸。(ZhuJ，DhimitrukaI，PeiD.5-(2-Aminoethyl)dithio-2-nitrobenzoateasamorebase-stablealternativetoEllman!sreagent.[J]OrganicLetters2004:6(21):3809-3812.HuM，FanJ，LiH，SongK，WangS，ChengG，PengX.FluorescentchemodosimeterforCys/Hcywithalargeabsorptionshiftandimaginginlivingcells.[J]OrganicBiomolecularChemistry2011；9(4):980-983.LongL,LinW,ChenB,GaoWiYuanL.ConstructionofaFRET—basedratiometricfluorescentthiolprobe.[J]ChemicalCommunications2011；47(3):893-895.)。[0004]大多數已報道的熒光探針對含巰基氨基酸的響應只體現在熒光強度的改變。因此，研發一種兼具顏色變化和熒光增強的熒光探針對探討含巰基氨基酸的生物學作用具有十分重要的意義。【
發明內容】[0005]對于上述情況，本發明的目的之一提供一種合成簡便、反應條件溫和、成本較低的熒光探針合成方法；目的之二是提供一種選擇性好，靈敏度高，能夠裸眼及熒光增強檢測含巰基氨基酸的熒光探針。[0006]本發明使用的裸眼檢測和熒光增強檢測含巰基氨基酸熒光分子探針，采用二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物和硝基甲烷在堿的作用下合成，硝基甲烷部分作為識別基團。[0007]本發明解決問題采取的技術方案為，一種裸眼檢測和熒光增強檢測含巰基氨基酸熒光分子探針，具有下列結構通式:[0008]【權利要求】1.本發明涉及一種裸眼及熒光增強檢測含巰基氨基酸熒光分子探針的制備方法以及該熒光分子探針在檢測含巰基氨基酸方面的應用，其特征是具有下列化學分子結構通式:2.根據權利要求1所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼識別和熒光增強檢測含巰基氨基酸的熒光分子探針，其特征是=R1,R2,R3，R4為甲基，R5為H。3.權利要求1或2所述的熒光分子探針的合成方法，其制備方法是:1)將吡咯和芳香醛溶解在二氯甲烷中，加入三氟乙酸做催化劑，室溫攪拌。將二氯二氰基苯醌溶于二氯甲烷中加入到上述反應體系中，之后將堿和三氟化硼乙醚一起加入到反應體系中，反應完成后，將反應液倒入水中二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離。得到產物即為二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物。2)將N，N-二甲基甲酰胺和三氯氧磷在冰浴下混合，恢復到室溫后，向反應液中滴加溶于1，2_二氯乙烷中的二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物，升溫攪拌。反應完畢后，降至室溫，倒入到碳酸氫鈉溶液中進行中和，繼續攪拌后用二氯甲烷進行萃取，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到產品即為二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物。3)將二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物和硝基甲烷溶于甲苯中，加入哌啶和醋酸，回流。反應完成后，降至室溫，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到產品即為探針化合物。4.根據權利要求3所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼識別和熒光增強檢測含巰基氨基酸的熒光分子探針合成方法，其特征在于:所述反應步驟I)中采用的吡咯包括2，4_二甲基吡咯，2，5_二甲基吡咯，1-甲基吡咯等。采用的芳香醛包括苯甲醛，對羥基苯甲醛，對氰基苯甲醛，對碘苯甲醛，對溴苯甲醛等芳香醛。5.根據權利要求3所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼識別和熒光增強檢測含巰基氨基酸的熒光分子探針合成方法，其特征在于所述反應步驟2)中采用的無機堿中和可以為碳酸鈉，碳酸氫鈉，氫氧化鈉，碳酸鉀等無機堿。6.根據權利要求3所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼識別和熒光增強檢測含巰基氨基酸的熒光分子探針合成方法，其特征在于所述反應步驟3)中采用溶劑可以為甲苯，二甲苯，鄰二甲苯，鄰二氯苯的有機溶劑。7.權利要求1或2所述的熒光分子探針的應用，用于裸眼或熒光增強檢測巰基氨基酸。【文檔編號】C07F5/02GK103804401SQ201210460219【公開日】2014年5月21日申請日期:2012年11月12日優先權日:2012年11月12日【發明者】宋相志,陳頌申請人:蘇州羅蘭生物科技有限公司