專利名稱：基于蛋白a親和模型構建免疫球蛋白g的新型親和配基多肽庫及設計方法的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用分子模擬仿生設計目標蛋白質的親和配基技術，以及利用親和色譜技術純化目標蛋白質，屬于生物技術中的計算機模擬和蛋白質分離純化技術領域。
背景技術：
抗體(免疫球蛋白，Ig)是位于動物血液和組織液中，由B淋巴細胞在對抗原的免疫應答中產生的一類糖蛋白。抗體與抗原具有的高親和性使其廣泛應用于生物學研究和臨床治療領域。特別是隨著基因技術和克隆技術的逐漸成熟，單克隆抗體已成為治療炎癥、腫瘤和傳染類疾病的有效藥物。目前，已有大約20種單克隆抗體藥物被FDA批準上市，至少 300個還在研發之中，2006年單克隆抗體類藥物的產值達到了 206億美元。抗體在醫療領域中日益顯現的重要性亟需高效、穩定和低廉的生產工藝。由于抗體表達的復雜性以及對醫用抗體的高質量要求，抗體純化已成為整個生產過程的關鍵步驟。其中IgG是血清中主要的抗體成分，約占血清Ig的75%，也是需求量最大的一類抗體。抗體純化通常采用鹽析、凝膠過濾色譜、疏水作用色譜、離子交換色譜和親和色譜等分離手段進行多步純化。其中親和色譜因能對目標分子進行高效特異性純化已成為抗體純化后期最常用的色譜方法之一。親和色譜是利用親和配基能與目標分子特異且可逆結合的特性，從復雜的生物樣品中分離純化目標分子，具有選擇性強，純化效率高的優點。親和色譜法的純化效果取決于目標分子與配基之間的親和性。因此，針對特定的目標分子，開發合適的親和配基是構建一個親和色譜體系所首要解決的問題。金黃色葡萄球菌蛋白A(SpA)、蛋白G和蛋白L作為親和配基已廣泛用于制備高純度抗體。這類配基的優點在于特異性高，而缺陷是過高的親和力需要較苛刻的洗脫條件，容易導致目標蛋白變性和配基脫落，吸附容量較低；此外這類配基的制備也比較困難，價格昂貴，蛋白經固定化后一般會失去部分活性。這些弱點使得上述蛋白類配基的應用受到限制。親和肽配基的研究始于1986年Geysen對合成肽庫的研究,他提出含有關鍵殘基的短肽能夠模擬蛋白質上的決定簇。而且在多數情況下，幾個關鍵殘基與對應目標分子間的非共價作用構成了復合物結合的主要作用力。這兩個觀點奠定了親和肽配基的理論基礎。肽配基通常僅由很少的氨基酸組成，不會在產品使用時引起免疫中毒反應。而且其分子量小，即使從固定相上脫落、摻入產品中也很容易從終產物中除去。此外肽配基與蛋白質的作用條件溫和，有利于控制分離條件，避免目標蛋白的變性。和蛋白類等具有高親和力的配基相比，親和肽配基也具有足夠高的親和力結合目標蛋白。肽配基的構象和理化性質更穩定，能承受分離操作中較強的酸堿洗脫和再生條件，可實現在GMP條件下大規模無菌生產。近些年來涌現出的一批肽配基都對抗體具有較好的分離純化效果，如TG19318、PeptideH,AlP、A2P、8/7、線性肽配基(HWRGWV 等)。盡管多肽作為親和配基具有如此多的優越性，但自然界中與目標蛋白有親和力的多肽數量十分有限。上述所討論的小分子配基雖然在抗體純化研究中顯現出了很大優勢，但與SpA親和介質相比，也存在著不足，如特異性和親和力較差等。因此在親和色譜的實際應用中，配基的篩選和設計至關重要。如何選擇合適的多肽序列作為親和配基，以及如何提高多肽的親和力和選擇性的問題，已成為影響多肽親和色譜應用的關鍵。現有的篩選和設計方法主要分為實驗篩選和理性設計兩類方法。實驗篩選是基于組合庫技術進行高通量實驗篩選，根據構建多肽文庫方法的不同，親和配基的篩選技術主要分為組合化學合成肽庫篩選，如上述提到的 TG19318/D-TG19318、P印tide H、MAbSorbentAlP、A2P 和 8/7 ;噬菌體展示肽庫篩選，如HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL ;核糖體展示肽庫篩選這三類。理性設計主要是基于目標蛋白或已有配基的結構和性質設計新配基。隨著計算機技術、計算化學和藥物化學的發展，親和配基的設計已進入以計算機輔助設計為主導的理性設計階段。計算機輔助配基設計的各種虛擬設計方法包括分子對接，3D-QSAR,藥效團模型,分子動力學(moleculardynamics, MD)模擬和從頭設計等。分子對接是兩個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別的過程。分子對接計算是把配基分子放在目標蛋白結合位點的位置，然后按照幾何互補、能量互補和化學環 境互補的原則來實時評價配基與目標蛋白結合的好壞，并找到兩個分子之間最佳的結合構象。由于分子對接考慮了目標蛋白與配基相互作用的信息，因此從原理上講，分子對接是一種基于受體的直接設計方法。近年來隨著蛋白晶體結構信息的快速增長以及小分子數據庫的不斷更新，分子對接已經成為基于結構設計中的最為重要的方法。常用軟件有DOCK，Autodock 和 FlexX 等。分子動力學是建立在牛頓力學基礎上的一種分子模擬方法，用于研究多粒子體系中各粒子的運動過程。MD模擬的基本步驟可以分為如下四步(1)初始化；(2)計算原子受力；(3)更新原子坐標和速度。根據上一步的原子坐標、速度和受力，即可得到原子在下一時刻的坐標和速度。不斷循環進行(2)和(3)步得到體系狀態隨模擬時間的變化情況；(4)分析軌跡。常用的分子動力學模擬軟件主要有GROMACS、NAMD、AMBER和CHARMM等。通過分析MD模擬軌跡可以獲得模擬體系的各種性質，包括構象、能量、動力學性質以及配基-目標蛋白質之間的相互作用力等。采用多種理性設計方法，通過設計合理的組合策略可以實現降低成本和更高精度的配基設計。在前期采用一些計算速度快但精度有限的方法以富集可能的候選分子，如分子對接法。隨后再采用MD模擬等計算量大但更精確的方法進一步挑選最佳的配基分子。在后期階段則采用比較耗時和高成本的實驗方法做最后驗證。
發明內容
本發明的目的在于提出一種基于蛋白A親和模型構建免疫球蛋白G的新型親和配基多肽庫及設計方法的應用。本發明所述的抗體親和短肽配基的仿生設計方法是首次建立的，并經驗證是有效的。本發明基于蛋白A親和模型構建免疫球蛋白G的新型親和配基多肽庫，其依據為6個SpA關鍵殘基F132、Y133、H137、E143、R146和K154。為了配基的固定，在多肽序列中間位置添加一個半胱氨酸。該肽庫共有以下8種序列FYCHXXXE、FYXHCXXE、FYCHXXR、FYXHCXR、FYXCRXE、YFXCRXE、HXYFCXR 和 HXYFCXK ；其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸。
本發明的新型的親和多肽設計方法的應用，是在上述肽庫的基礎上，進一步利用氨基酸定位方法，確定X所代表的氨基酸種類。X所代表的氨基酸種類如下表所示
權利要求
1.基于蛋白A親和模型構建免疫球蛋白G的新型親和配基多肽庫，在多肽序列中間位置添加一個半胱氨酸Cys的方法，其特征是一共有以下8種序列FYCHXXXE、FYXHCXXE、FYCHXXR、FYXHCXR、FYXCRXE、YFXCRXE、HXYFCXR 和 HXYFCXK ；其中X代表除去半胱氨酸以外的19種氨基酸。
2.如權利要求1所述的多肽庫，其特征是構建依據為6個SpA關鍵殘基F132、Y133、 H137、E143、R146 和 K154。
3.以權利要求1和2所述的構建多肽庫的設計方法的應用，其特征是在肽庫的范圍內，利用氨基酸定位法構建候選多肽分子庫。
4.如權利要求3所述的設計方法的應用，其特征是根據方法應用得到如下的候選多肽分子庫
5.如權利要求4所述的設計方法的應用，其特征是將候選多肽庫包含的多肽分子進行分子對接篩選、均方根偏差比較以及分子動力學模擬復篩，獲得有可能與hlgG具有較高親和性的多肽配基FYffHCLDE、FYFCRffE、FYIHCLPE、FYYHCKKE、FYCHWALE、FYCHWQDE、FYCHTIDE、 FYRHCQRE、FYCHHKTE、FYCHLQKE、FYCHRKAE、FYCHNQDE、FYCHRQEE 和 FYNHCASE。
全文摘要
本發明公開了一種基于蛋白A親和模型構建免疫球蛋白G的新型親和配基多肽庫及設計方法的應用。根據分子力學/泊松-波爾茲曼溶劑可及表面積方法，在已有的人IgG-蛋白A復合物結構的基礎上解析獲得與人IgG具有較高親和作用的蛋白A的關鍵殘基，并構建了蛋白A簡化親和模型，在此基礎上構建了IgG的親和多肽分子庫。在肽庫的基礎上，進一步利用氨基酸定位方法，確定X所代表的氨基酸種類。然后，應用分子對接和分子動力學模擬手段逐步篩選候選多肽。最后，通過親和色譜實驗方法，確定能有效分離純化IgG的多肽親和配基。
文檔編號C07K7/06GK103014880SQ20121056181
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者孫彥, 趙韋韋, 劉夫鋒, 史清洪 申請人:天津大學