針對pcsk9的抗體及其用途
【專利摘要】本發明涉及針對9型前蛋白轉變酶枯草芽孢桿菌素/kexin(PCSK9)的抗體，或其抗原結合片段，包含此類PCSK9抗體或抗原結合片段的組合物，以及使用其治療高脂血癥或高膽固醇血癥的方法。
【專利說明】針對PCSK9的抗體及其用途
[0001]本發明在醫藥領域中。具體而言，本發明涉及針對9型前蛋白轉變酶枯草芽孢桿菌素/kexin (PCSK9)的抗體，包含此類PCSK9抗體的組合物，以及使用PCSK9抗體治療高脂血癥或高膽固醇血癥的方法。
[0002]9型前蛋白轉變酶枯草芽孢桿菌素/kexin (PCSK9)是分泌的絲氨酸蛋白酶，主要在肝中產生，其調節低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的血漿濃度。分泌的PCSK9結合位于肝細胞表面的LDL受體(LDLR)并與其內化。LDLR功能為通過從血漿中結合并轉運LDL顆粒至溶酶體進行降解來清除LDL-C。一旦LDL顆粒被遞送進行降解，則LDLR再循環至肝細胞表面以從血漿中結合并清除另外的LDL-C。PCSK9通過引導內化的LDLR進行降解而非循環至細胞表面來調節血漿LDL-C，從而減少LDL-C清除。在PCSK9缺陷的或過表達的嚙齒動物中的研究目前已經證實了 PCSK9通過調整LDLR水平來控制循環的LDL水平。循環的PCSK9參與肝LDLR的降解這一觀察結果暗示PCSK9的抗體中和是用于降低LDL-C的可行的治療方法。此外，已經報道作為目前用于降低LDL-C的護理標準的抑制素藥物實際上可以提高PCSK9的表達和血清水平。因此，PCSK9抗體還具有以與抑制素治療協同的方式降低LDL-C的潛力。
[0003]PCSK9抗體及其在降低血漿LDL-C中的作用在本領域是已知的。例如，US2009/0246192、US2009/0142352、US2010/0166768 和 W02010/029513 公開了此類 PCSK9抗體及其用途。然而，截 至目前，還沒有靶向PCSK9的抗體被批準用于治療用途。因此，存在替代PCSK9抗體的需求。具體而言，存在以高效能降低LDL-C的替代PCSK9抗體的需求。還更具體的是，存在以高效能降低LDL-C并提供持久的起效持續時間(例如，持久的LDL-C水平的抑制)的替代PCSK9抗體的需求。此類抗體將還優選具有利于開發、制造或配制的良好的物理化學特性。
[0004]本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)，其中HCVR包含互補決定區域(CDRs) HCDRl、HCDR2和HCDR3并且LCVR包含CDRsIXDRl、IXDR2和IXDR3，其中HCDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO:1給出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO: 2給出，HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 3給出，IXDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO: 4給出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO: 5給出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 6給出，其中所述抗體或其抗原結合片段結合人PCSK9。在一個實施方案中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)，其中HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7給出并且LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8給出，其中所述抗體或其抗原結合片段結合人PCSK9。在另一個實施方案中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含兩個重鏈可變區(HCVRs)和兩個輕鏈可變區，其中每一 HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7給出并且每一 LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8給出。
[0005]在另一個具體實施方案中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9給出并且LC的氨基酸序列由SEQ IDNO: 10給出。在甚至更具體的實施方案中，本發明提供抗體，其包含兩條重鏈(HCs)和兩條輕鏈(LCs)，其中每一 HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9給出并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10給出。在最具體的實施方案中，本發明提供抗體，其由兩條HCs和兩條LCs組成，其中每一 HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9給出并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ IDNO: 10給出。
[0006]本發明進一步提供藥物組合物，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。更具體而言，本發明的藥物組合物進一步包含一種或多種另外的治療劑。
[0007]此外，本發明提供治療高脂血癥或高膽固醇血癥的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的本發明的抗體或抗原結合片段。本發明還提供本發明的抗體或其抗原結合片段，其用于治療。更具體而言，本發明提供本發明的抗體或其抗原結合片段，其用于治療高脂血癥或高膽固醇血癥。此外，本發明提供本發明的抗體或其抗原結合片段在制造治療高脂血癥或高膽固醇血癥的藥物中的用途。 [0008]本發明還涉及編碼本發明的抗體或抗原結合片段的核酸分子和表達載體。此外，本發明提供按照這樣的方法制備的抗體，其中所述方法包括(a)培養包含編碼由SEQ IDNO: 9給出的多肽序列的第一條多核苷酸序列和編碼由SEQ ID NO: 10給出的第二條多肽序列的第二條多核苷酸序列的宿主細胞，并在所述多肽序列被表達的條件下進行；和6)從所述宿主細胞中回收包含重鏈和輕鏈的抗體，其中所述重鏈的多肽序列由SEQ ID N0:9給出，并且所述輕鏈的多肽序列由SEQ ID NO: 10給出。更具體而言，由上述方法產生的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每一重鏈的多肽序列由SEQ ID N0:9給出，并且每一輕鏈的多肽序列由SEQ ID NO: 10給出。
[0009]全長抗體是包含由二硫鍵互聯的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子。每一條鏈的氨基末端部分包括經其中包含的互補性決定區域(⑶Rs)主要負責抗原識別的約100-110個氨基酸的可變區。每一條鏈的羧基末端部分限定主要負責效應子功能的恒定區。將輕鏈分類為K或λ，其每一條的特征在于本領域中已知的特定的恒定區。將重鏈分為Y、μ、α、δ或ε ,并限定抗體的同種型分別為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗體可以進一步分入亞類例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4中。每一重鏈類型的特征還在于具有本領域熟知的序列的特定恒定區。如本文所用，“抗原結合片段”指Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、和結合人PCSK9的單鏈Fv片段。如本文所用，術語“結合(bind)(或‘結合(binds)’)人PCSK9”指與由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列給出的人PCSK9上的表位的相互作用。如本文所用，術語“表位”指抗原上分離的、三維位點，其被本發明的抗體或抗原結合片段所識別。
[0010]⑶Rs散布在更保守的名為框架區(“FR”)的區域中。每一輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個⑶Rs和4個FRs構成，其從氨基末端至羧基末端以以下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。將輕鏈的 3 個 CDRs 稱為“LCDRl、LCDR2 和 LCDR3”并將重鏈的3個⑶Rs稱為“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。⑶Rs包含大部分與抗原形成特異性相互作用的殘基。本發明的抗體或抗原結合片段的LCVR和HCVR區內的CDR氨基酸殘基的編號和位置可以按照眾所周知的Kabat編號協定(IXDR 1-3, HCDR2-3)或按照Kabat加Chothia (HCDRl)進行確定。
[0011]產生和純化抗體和抗原結合片段的方法是本領域熟知的，并且可見于例如Harlow矛口 Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15。例如，可以用人 PCSK9或其片段免疫小鼠，并可以隨后將產生的抗體回收，純化，并使用本領域熟知的常規方法確定氨基酸序列。抗原結合片段還可以通過常規方法制備。將本發明的抗體或抗原結合片段工程化以包含環繞來源于非人抗體的CDRs的一個或多個人框架區。人框架種系序列可以經其網址http://imgt.cines.fr獲自ImMunoGeneTics (IMGT),或者獲自Marie-Paule Lefranc 和 Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351 的The Immunoglobulin Facts Book。具體而言,用于本發明的抗體或抗原結合片段的種系輕鏈框架包括A3和02。具體而言，用于本發明的抗體或抗原結合片段的具體種系重鏈框架區包括 VH3-21 和 VH3-23。
[0012]可以使用已知方法制備并純化本發明的工程化的抗體或抗原結合片段。例如，可以將編碼重鏈(例如，由SEQ ID NO: 9給出的氨基酸序列)和輕鏈(例如，由SEQ ID NO: 10給出的氨基酸序列)的cDNA序列克隆并工程化入GS (谷氨酰胺合酶)表達載體。工程化的免疫球蛋白表達載體可以隨后穩定地轉染入CHO細胞中。如本領域技術人員將理解，抗體的哺乳動物表達將導致糖基化，通常在Fe區內的高度保守的N糖基化位點上。可以確認穩定克隆表達了特異性結合人PCSK9的抗體。可以將陽性克隆在生物反應器中在無血清培養基中擴大培養用于抗體生產。抗體已分泌入其中的培養基可以通過常規技術純化。例如，可以將培養基方便地應用到已經用相容性緩沖液諸如磷酸緩沖鹽溶液平衡的Protein A或GSepharose FF柱上。洗漆該柱以去除非特異性結合的組分。例如，通過pH梯度將結合的抗體洗脫下來， 并通過諸如SDS-PAGE檢測抗體級分，并隨后混合。可以使用常規技術將抗體濃縮和/或無菌過濾。通過常規技術包括尺寸排阻、疏水相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析可以將可溶的聚集體或多聚體有效去除。可以將產物立即冷凍，例如在_70°C下，或可以冷凍干燥。
[0013]本發明的抗體是單克隆抗體。如本文所用，“單克隆抗體”或“mAb”指來源于包括例如真核生物的、原核生物的或噬菌體克隆的單一拷貝或克隆的抗體，而不指其產生的方法。單克隆抗體或其抗原結合片段可以例如通過雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術例如⑶R嫁接(grafting)、或此類或其它本領域已知的技術的組合來產生。
[0014]在本發明的另一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段、或編碼其的核酸以分離的形式提供。如本文所用，術語“分離的”指不含或基本上不含細胞環境中發現的其他大分子種類的蛋白、肽或核酸。如本文所用，“基本上不含”表示目標蛋白、肽或核酸包含多于80% (以摩爾計)的存在的大分子種類，優選多于90%，并更優選多于95%。
[0015]本發明的抗體或抗原結合片段可以用于治療患者。術語“治療(treating)”(或“治療(treat)”或“治療(treatment)”)指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的癥狀、病癥、病況或疾病的進展或嚴重性。如本文所用，“患者”指人或非人哺乳動物，但優選指人。如本文所用，術語“有效量”指本發明的抗體或抗原結合片段這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者后，在治療的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師通過考慮以下多種因素來容易地確定:諸如哺乳動物的物種；它的大小、年齡和一般健康；涉及的具體疾病；疾病的程度或嚴重性；個體患者的應答；施用的具體抗體；施用模式；施用制劑的生物利用率特征；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。[0016]本發明的抗體或抗原結合片段或包含其的藥物組合物可以通過腸胃外途徑(例如皮下、靜脈內、腹膜內、肌內或經皮)施用。本發明的藥物組合物可以通過本領域熟知的方法制備(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版(1995)，A.Gennaro et al., Mack Publishing C0.)并包含如本文公開的抗體或其抗原結合片段以及一種和多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。例如，本發明的抗體或抗原結合片段可以與試劑諸如檸檬酸鈉、檸檬酸、聚山梨酯80和蔗糖配制，并且產生的組合物可隨后冷凍干燥并儲存在2°C - 8°C下。冷凍干燥的組合物在施用前可以用注射用的無菌水重構。
[0017]以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，并且本領域技術人員可以進行多種修改。
[0018]實施例1
工程化的PCSK9抗體
用包含人PCSK9 (SEQ ID NO: 17)的C末端截短片段的肽免疫鼠類宿主，并使用標準方法分離并克隆結合PCSK9的IgG抗體。分離的鼠類Fab的CDRs通過誘變進行隨機化，并篩選產生的抗體對人PCSK9的親和力。將親和力增強的突變組合，并將最優CDRs分別工程化到人VH3-21和A3重鏈和輕鏈框架中。為了進一步優化人源化抗體的生物物理特性，進行CDR序列內芳香族和疏水氨基酸的靶向替換。還對隨機CDR文庫篩選另外的親和力增強突變。將有益的⑶R突變隨機組合并表達，并篩選產生的抗體對人PCSK9的親和力。獲得具有以下氨基酸序列的全長人源化且優化的PCSK9抗體:
【權利要求】
1.抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)，其中所述HCVR 包含互補決定域(CDRs)HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 并且所述 LCVR 包含 CDRs LCDRl、LCDR2和IXDR3，其中HCDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO:1給出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ IDNO: 2給出，HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 3給出，LCDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO:4給出，IXDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO: 5給出，IXDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 6給出，其中所述抗體或其抗原結合片段結合人PCSK9。
2.權利要求1的抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)，其中所述HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7給出并且所述LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8 給出。
3.權利要求2的抗體或抗原結合片段，其包含兩條HCVRs和兩條LCVRs組成，其中每一HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7給出，并且每一 LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8給出。
4.權利要求1的抗體或抗原結合片段，其包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9給出，并且所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10給出。
5.權利要求4的抗體或抗原結合片段，其包含兩條重鏈(HCs)和兩條輕鏈(LCs)，其中每一 HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9給出，并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10給出。
6.抗體，其包含兩條重鏈(HCs)和兩條輕鏈(LCs)，其中每一HC的氨基酸序列由SEQIDNO: 9給出，并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10給出。
7.抗體，其由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中每一重鏈的氨基酸序列由SEQID NO:9給出，并且每一輕鏈的氨基酸序列由SEQ ID N0:10給出。
8.藥物組合物，其包含權利要求1的抗體或抗原結合片段以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.治療高脂血癥或高膽固醇血癥的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的權利要求I的抗體或抗原結合片段。
10.治療高脂血癥或高膽固醇血癥的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的權利要求6的抗體。
【文檔編號】C07K16/40GK103781802SQ201280044580
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年9月12日 優先權日:2011年9月16日
【發明者】J.戴維斯, B.艾倫, R.J.達林 申請人:伊萊利利公司