抗CD1d的抗體的制作方法

抗CD1d的抗體的制作方法
【專利摘要】本發明提供結合CD1d的分離的抗體或其抗原結合部分。這些抗體及其抗原結合部分具有在治療涉及NKT細胞效應子功能的病況中的應用。
【專利說明】抗CD1d的抗體
[0001] 提交數據
[0002] 本申請與2011年10月14日提交的澳大利亞專利申請號2011904190和2011年 10月14日提交的美國專利申請號61/547, 307相關并要求其優先權，這些申請各自的全部 內容經此引用并入本文。 發明領域
[0003] 本發明涉及結合⑶Id并抑制⑶Id介導的生物學功能(例如活化⑶Id限制性T細 胞、自然殺傷T (NKT)細胞）的抗體。
[0004] 發明背景
[0005] 按照字母順序在說明書結尾處收集了作者在本說明書中提及的出版物的書目細 節。
[0006] 在本說明書中提及任何現有技術不被也不應視為是承認或以任何形式暗示現有 技術在任何國家構成公知常識的一部分。
[0007] CDld是對觸發細胞群體(例如NKT細胞）以釋放高水平的細胞因子(與某些炎性疾 病相關的活性）必不可少的反受體。因此阻斷CDld介導的作用具有潛在的治療益處。
[0008] ⑶Id蛋白質顯示于許多抗原呈遞細胞（APC)亞群上,包括朗氏細胞(皮膚中的主 要樹突狀抗原呈遞細胞)、活化B細胞、淋巴結中的樹突細胞、活化的血單核細胞。經CDld刺 激的一個細胞群體是NKT細胞--與多種通常與NK細胞相關的分子標記物例如CD161和 NKG2D-起表達alpha/beta (α β)Τ細胞受體（TCR)的T細胞亞群。抗原呈遞細胞（APC) 經⑶Id呈遞脂質或糖脂刺激ΝΚΤ細胞。大多數人⑶Id限制性ΝΚΤ細胞表達包含與νβ 11 配對的 Va 24Ja 18 的半不變 TCR (Brigl, Μ 等人，2004Annu. Rev. Immunol. , 22:817-890)。 ⑶ld-TCR相互作用快速誘導許多Thl-或Th2-樣細胞因子，例如干擾素（IFN) - γ和腫瘤 壞死因子（TNF)-a，以及白細胞介素（IL)-4、IL-5和IL-13。已知Thl/Th2細胞因子響應 的平衡在編排免疫反應性質方面起重要的作用。
[0009] 迄今已經在人體內識別了五種⑶1基因：⑶la、⑶lb、⑶lc、⑶Id和⑶le。⑶1蛋 白被表達為與β2-微球蛋白（β2Μ)非共價相關的大的亞單位(重鏈）（Van Agthoven，A. 和 Terhorst，C·，1982J. Immunol. 128:426-432 ;Terhorst，C.等人，1981Cell23:771-780)。 ⑶Id的胞外域由三個域組成：α 1域(殘基20-108)、α 2域(殘基109-201)和α 3域(殘基 202-295) (Pellicci，D.G.等人，2009Immunity31:47-59)。
[0010] 多種具有不同結構的脂質已經顯示：以在⑶Id分子的兩個疏水性結合口袋（A' 和F)各個中提供脂肪酸鏈的獨特方式結合CDld分子。能夠結合CDld分子的脂質物類包 括分枝菌酸類、二酰甘油類、鞘脂類、類聚異戊二烯類、脂肽類、phosphomycoketides和小 的疏水性化合物（Venkataswamy, Μ· M.和 Porcelli, S. A.，201 OSeminTmmunol 22:68-78)。 用于研究體內和體外的NKT細胞激活的原型化合物是KRN7000，一種衍生自海綿 Agelasmauritianus的α -半乳糖苷神經酰胺(" a GalCer")。附加的激動劑包括但不限 于異球三己糖基神經酰胺（"iGb3")，據報道其是內源性鞘糖脂，以及一類衍生自微生物 的α-葡糖醒酸基神經酰胺（glycuronosylceramides)的成員與多種人類糖脂如溶血磷 脂醜膽喊（lysophophatidylcholine)和溶鞘憐脂（lysosphingomyelin) (Fox，L.M.等 人，2009Plos Bi〇17:el000228)。某些天然存在的β-連接的糖鞘脂例如β-D-吡喃葡 萄糖基神經酰胺的C24:1形式也是ΝΚΤ細胞的弱激動劑（Brennan，P. J.等人，201 INat Immunol12:1202-1211)。
[0011] ΝΚΤ細胞過度產生細胞因子可能會貢獻于某些自身免疫性或炎性疾病的病理，例 如重癥肌無力（Reinhardt, C.等人，1999Neurology52:1485-87)、牛皮癬（Bonish, Β. D.等 人，2000J. Immunol. 165:4076-85)、潰瘍性結腸炎（Saubermann, L. J.等人，2000Gastroen terologyll9:119-128)、原發性膽汁性肝硬變（Kita, Η·等人，2002Gastroenterologyl23 :1031-43)、結腸炎（Heller, F.等人，2002Immunityl7, 629-638)、脂肪性肝炎（Syn，W.等 人，（2010) Hepatology, 51 (6) : 1998-2007)、自身免疫性肝炎（Santodomingo-Garzon，T.和 Swain，M.G. (2011)Autoimmunity Reviewsl0:793_800)、動脈粥樣硬化（Kyriakakis，E.等 人，EurJImmunol201040:3268-79)或與鐮狀細胞病相關的肺部炎癥或機能障礙（Wallace 等人，2009Bloodll4:667-676)。越來越多的證據表明ΝΚΤ細胞在哮喘中施加了有害影響 (Iwamura，C.和 Nakayama，Τ.，2010Curr0pinImmunol22:807-13)。
[0012] 哮喘是慢性炎性肺疾病，其特征是慢性局部炎癥引起的可逆的氣道阻塞、粘 液阻塞和響應于非特異性刺激的支氣管痙攣（Murdoch, J. R.和Lloyd, C. M. 20lOMutat Res690:24-39)。高哮喘患病率，越來越高的發病率和龐大的相關醫療保健開支使哮喘 成為主要公共衛生問題（Holgate，S.T.和 Polosa，R.2008Nat Rev Immunol8:218_30; Bahadori，K.，Doyle_WatersM.M·等人，2009BMC Pulm Med9:24)。在患有嚴重形式的哮喘， 例如皮質類固醇難治性哮喘的患者的治療方面存在顯著的未滿足的醫療需求。患有嚴重哮 喘的患者不能對標準治療產生響應，并占全部哮喘人群的約5-10%。這僅在美國就包括約 850, 000例患者。
[0013] 在過敏性哮喘的小鼠模型中，NKT細胞已經顯示使疾病加重（Akbari，0.等 人，2003NatMed9:582-8)。NKT細胞可以被CDld限制性糖脂抗原激活并釋放細胞因子例如 IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13,這些細胞因子激活在哮喘中重要的嗜酸性粒細胞和其它細胞 亞群（Chuang，Y.H.等人，2011J Immunoll86:4687-92)。通過針對 NKT 細胞，施用抗-CDld 抗體或⑶Id-依賴性拮抗劑在實驗中抑制了誘發的氣道炎癥（LiSb〇nne，M.等人，2003J Immunoll71:1637-41 ;Pichavant，M.等人，2008JExpMed, 205:385-93)。NKT 細胞在哮喘 的非人類靈長類動物模型中是也有害的（Matangkasombut,P.等，2008J Allergy Clin Immun〇1121:1287-9)。這樣的結果表明，肺中存在的低數量NKT細胞對人哮喘的發展和延 續非常重要。
[0014] 非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD)是其中過量脂肪堆積在無酗酒史的患者體內的一種 病況。NAFLD分為單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎（NASH)。在NASH中，存在脂肪變 性、小葉內炎癥和肝細胞氣球樣，通常伴隨著進行性纖維化。長期NASH會發展為肝硬化，并 且肝細胞癌（HCC)可能是一種結果。NAFLD被認為是代謝綜合征的肝臟表現。NAFLD在近數 十年來已經與增加流行的肥胖、2型糖尿病與高脂血癥一起在世界范圍內增力口。NAFLD/NASH 目前被認為是世界范圍內最常見的慢性肝病。據估計，全部成年人的約20%患有NAFLD，而 2-3%的成年人患有NASH。非酒精性脂肪肝疾病是慢性肝病的主要原因。其涵蓋組織病理 學的范圍，包括肝脂肪變性(脂肪肝）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH)。
[0015] 肝臟包含可以調節先天性免疫應答的NKT細胞定居群體。例如，含有不變的T細 胞受體的NKT細胞，其包含小鼠肝臟中最多20%的T細胞。此類細胞也富集在包含更多樣 化的NKT細胞的組成部分的人肝臟中（最多10%的T細胞)。在這兩種物種體內，NKT細胞主 要存在于肝竇狀隙中，在這里它們提供血管內的免疫監視。NKT細胞特異性地識別糖脂抗原 并可以在激活時產生細胞因子。該細胞亞群可能貢獻于NASH的發病機理(參見例如Syn，W. 等人，（2010)Η印atology，51 (6) : 1998-2007)。因此，輸送在體內阻斷NKT細胞的功能的抗 ⑶Id抗體可以具有治療益處。
[0016] 自身免疫性肝病的三個主要大類是自身免疫性肝炎（AIH)、原發性膽汁性肝硬變 (PBC)和原發性硬化性膽管炎（PSC)。這些疾病各自具有相對獨特的臨床、血清學和組織 學表現。這三種肝病在肝損傷的病理組織學形態方面也各不相同。AIH的特征在于肝實質 的進行性破壞，稱為界面性肝炎。另一方面，PBC的特征在于小肝內膽管的特異性破壞，而 PSC主要涉及大膽管的破壞。盡管這些病況的表現不同，所有這些自身免疫性肝疾病共享 涉及T淋巴細胞(其識別和摧毀干細胞）的肝復原的免疫介導肝損傷的共同徑路，并最終發 展為肝纖維化。NKT細胞可能有助于自身免疫性肝病的病理（Santodomingo_Garzon，T.和 Swain, M. G. (2011)AutoimmunityReviewsl0:793-800)。激活的 NKT 細胞可以直接通過上調 細胞表面FasL表達和/或釋放腫瘤壞死因子-a (TNF- α )與穿孔素/粒酶B誘導肝細胞 死亡。ΝΚΤ細胞可以通過釋放促炎細胞因子例如IFN-γ間接誘導肝細胞死亡。ΝΚΤ細胞還 可以產生IL-4,其誘導Th2響應和隨后的由漿細胞產生自身抗體。由于ΝΚΤ細胞的活化會 導致肝細胞破壞并最終導致肝硬化的發展。通過輸送抗⑶Id抗體阻斷NKT細胞功能可因 此具有治療益處。除了細胞因子釋放外，導致細胞溶解的NKT效應細胞功能,例如穿孔素釋 放和粒酶釋放以及Fas介導的細胞死亡，以及其它已知的NKT功能例如IL-2介導的旁觀者 效應可能也與涉及NKT細胞的病況相關。阻斷NKT細胞活化劑⑶ld，例如通過施用抗⑶Id 抗體，也可以調節這些NKT效應子功能。
[0017] 發明概述
[0018] 迫切需要抑制CDld介導的細胞活化并隨后表現出在治療炎性疾病(例如嚴重的 皮質類固醇難治性哮喘）中的益處的療法。完全人抗體具有實現開發提高治療效果的人用 藥物的目的的多個優點。它們可以靶向結合高度有效的中和表位并在施用于人類時耐受良 好。雖然已經在現有技術中描述了結合CDld并與其反應的小鼠抗體，本發明描述了在抑制 CDld介導的NKT細胞活化和所得效應子功能方面表現出強大效力的人抗體。令人驚訝地， 在某些情況下，這些抗體的效力比現有技術抗體的當前狀態高幾個數量級。具有顯著提高 的效力的此類抗體應當能夠治療CDld-介導的疾病，并應表現出優異的臨床療效。
[0019] 因此，在第一方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分， 其中該分離的抗體或其抗原結合部分與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體競爭與CDld 的結合。
[0020] 在第二方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分結合與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體所結合的表位 相同的表位。
[0021] 在第三方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含具有選自SEQ ID N01、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、 40、41、42、43、44和45的序列和至少95%與之相同的序列的VH域。
[0022] 在第四方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含具有選自SEQ ID勵2、4、6、46、49和62的序列和至少 95%與之相同的序列的VL域。
[0023] 在第五方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID NO:125)。
[0024] 在第六方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID NO:136)。
[0025] 在第七方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含VL域，該VL域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列 與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 RASQHISSWLA (SEQ ID N0:141)或 ASSSGAVSSGNFPN (SEQ ID N0:142)〇
[0026] 在第八方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分結合具有如使用基于細胞的效價測定測得的小于20ng/ml 的EC50的CDld。在一個實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部分結合具有0. 5ng/ml 至 20ng/ml 的 EC50 的人 CDld。
[0027] 在第九方面中，本發明提供分離的DNA分子，其編碼本發明的分離的抗體或其抗 原結合部分。
[0028] 在第十方面中，本發明提供在人類對象中治療涉及NKT細胞效應子功能的病況的 方法，包括向該對象施用本發明的抗體或其抗原結合部分。
[0029] 在第^^一方面中，本發明提供檢測樣品中存在CDld的方法，該方法包括使懷疑含 有CDld的樣品與本發明的分離的抗體或其抗原結合部分在允許該抗體或其抗原結合部分 結合CDld的條件下接觸以形成復合物并檢測樣品中該復合物的存在。
[0030] 在第十二方面中，本發明提供檢測細胞樣品中CDld陽性細胞的存在的方法，該方 法包括將細胞群體與本發明的分離的抗體或其抗原結合部分接觸以允許該抗體或其抗原 結合部分結合CDld陽性以形成復合物并檢測該抗體或其抗原結合部分-細胞復合物的存 在。
[0031] 在第十三方面中，本發明提供從多種CDld結合蛋白中選擇特異性地結合人CDld 并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競爭在⑶Id上的結合的⑶Id結合 蛋白的方法，該方法包括：
[0032] 在足以允許⑶Id結合蛋白結合該突變蛋白以形成⑶Id結合蛋白-人⑶Id突變 蛋白復合物和排除的多種沒有結合該人CDld突變蛋白的CDld結合蛋白的條件下，使多種 ⑶Id結合蛋白接觸人⑶Id突變蛋白，在所述人⑶Id突變蛋白中SEQ ID N0:116的氨基酸 位置87至93和141-143已經被這些位置處的相應的小鼠氨基酸取代，并且
[0033] 從排除的多種CD 1 d結合蛋白中收集沒有結合人CD Id突變蛋白的CD Id結合蛋白，
[0034] 其中收集的⑶Id結合蛋白特異性地結合人⑶Id并與選自401. 1U402.8和 401. 11. 158的至少一種抗體競爭在⑶Id上的結合。
[0035] 在第十四方面中，本發明提供從多種CDld結合蛋白中選擇特異性地結合人CDld 的CDld結合蛋白的方法，該方法包括：
[0036] 在足以允許⑶Id結合蛋白結合h⑶ldmu以形成⑶Id結合蛋白-h⑶ldmu復合物 和排除的多種沒有結合hCDldmu的CDld結合蛋白的條件下，使多種CDld結合蛋白接觸其 中位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143處的氨基酸已經被這些位置 處的相應小鼠序列替代的h⑶ldmu(SEQIDN0 :119)，并且
[0037] 從排除的多種⑶Id結合蛋白中收集沒有結合h⑶ldmu的⑶Id結合蛋白，
[0038] 其中收集的⑶Id結合蛋白特異性地結合人⑶Id (SEQ ID N0:116)或mCDldhu (SEQ ID N0:118)〇
[0039] 在任意上述方面的的一個實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部分還結合食 蟹猴和獼猴⑶Id。
[0040] 附圖簡述
[0041] 圖1 :證明通過抗⑶Id抗體抑制四聚體結合的測定結果的圖示。在使用α-半乳 糖苷神經酰胺（a -GalCer)脂質裝載的CDld四聚體(其結合用ΝΚΤ細胞受體穩定轉染的 J. RT3-T3. 5細胞）的測定中，由信號平均熒光強度降低，抗⑶Id抗體401. 11和402. 8與抗 體42和51. 1相比顯示出提高的對CDld四聚體結合的抑制。不相關的特異性陰性對照物 沒有顯示出抑制。表2列舉了所有受試抗體的EC50值。
[0042] 圖2:證明通過抗⑶Id抗體抑制IL-2釋放的測定結果的圖示。在使用 a -GalCer-裝載的CDld-陽性U-937細胞和NKT細胞受體穩定轉染的J. RT3-T3. 5細胞的 測定中，如通過ELISA測定的那樣，抗CDld抗體402. 8和401. 11與抗CDld抗體42和51. 1 相比在24小時后顯示出提高的IL-2釋放的抑制。在所有測定中，不相關的特異性陰性對 照物抗體沒有顯示出對IL-2釋放的抑制。表3中提出了來自代表性試驗的EC50值。
[0043] 圖3 :通過流式細胞計量術證明抗⑶Id抗體結合初生外周血單個核細胞（PBMC)的 測定結果的圖示。如通過流式細胞術測定的那樣，作為本說明書中所述抗體實例而非不相 關的特異性對照物抗體的抗⑶Id抗體402. 8結合初生人PBMC中的⑶Id-陽性、⑶11c-陽 性群體。
[0044] 圖4 :在使用THP-1細胞系作為抗原呈遞細胞的基于初生NKT細胞的測定中證明 通過抗CDld抗體抑制初生NKT細胞功能的測定結果的圖示。如通過ELISA測定的那樣，與 抗⑶Id抗體42相比，抗體401. 11和402. 8分別表現出高達114倍和高達180倍的24小 時后的IFN-γ (A)、IL-4 (B)、IL-5 (C)和IL-13 (D)釋放的提高的抑制。該結果來自于 使用a -GalCer-擴增的NKT細胞和a -GalCer-裝載的THP-1細胞作為CDld陽性細胞的 測定。在所有測定中，不相關的特異性陰性對照物抗體沒有抑制細胞因子釋放。表4中給 出了來自代表性試驗的EC50值。
[0045] 圖5 :在使用初生⑶14+單核細胞作為抗原呈遞細胞的基于初生NKT細胞的測定 中證明通過抗⑶Id抗體抑制初生NKT細胞功能的測定結果的圖示。在使用a-GalCer-擴 增的NKT細胞和a -GalCer-裝載的⑶14+單核細胞-衍生樹突細胞作為⑶Id陽性細胞的 測定中，如通過ELISA測定的那樣，與抗⑶Id抗體42和51. 1相比，抗體401. 11和402. 8證 實了在24小時后顯著提高的IFN-γ (A)、IL-4 (B)、IL-5 (C)和IL-13 (D)釋放的抑制。 在所有測定中，不相關的特異性陰性對照物抗體沒有抑制細胞因子釋放。表5中給出了來 自代表性試驗的EC50值。
[0046] 圖6 :證明高度有效的抗CDld抗體共享不同于通過較低效現有技術抗體所看到的 表位的類似中和表位的競爭ELISA的結果圖示。根據實施例7,如通過對應于結合的生物素 化402. 8 (A)水平的450nm下吸光度讀數與競爭轉化度（百分比）值（B)所顯示的那樣，使 用基于競爭ELISA方法，抗⑶Id抗體402. 8與其本身和與401. 11競爭但不與抗⑶Id抗體 42和51. 1競爭結合人CDld。
[0047] 圖7 :證明與重組食蟹猴⑶Id的交叉反應性的測定結果的圖示。根據實施例8,抗 CDld抗體401. 11和402. 8結合人CDld (A)，并通過ELISA與食蟹猴CDld (B)是交叉反應 性的。
[0048] 圖8 :證明與基于食蟹猴細胞的CDld的交叉反應性的測定結果的圖示。根據實施 例9,如通過流式細胞術所示，抗CDld抗體402. 8而非不相關的特異性陰性對照物抗體結 合來自兩只獨立的食蟹猴供體的PBMC上的⑶Id。數據顯示為篩選的活細胞（gated live cells)的流式細胞計量術柱狀圖，以柱狀圖形式劃分CDld陽性細胞的百分比。
[0049] 圖9 :證明食蟹猴CDld介導的初生NKT擴增的細胞基抑制的測定結果的圖示。根 據實施例10,如通過流式細胞計量術通過量化CD3+V α 24+細胞所顯示的那樣，抗CDld抗 體402. 8而不是不相關的特異性陰性對照物抗體在a GalCer-裝載的⑶Id-陽性PBMC的 存在下抑制食蟹猴NKT細胞的擴增。
[0050] 圖10 :顯示401. 11的可變區的序列的序列比對。框出區含有Kabat編號系統與增 強Chothia編號系統所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號系統定義的⑶R以粗體顯示。 由增強Chothia編號系統定義的⑶R具有下劃線。
[0051] 圖11 :顯示402. 8的可變區的序列的序列比對。框出區含有Kabat編號系統與增 強Chothia編號系統所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號系統定義的⑶R以粗體顯示。 由增強Chothia編號系統定義的⑶R具有下劃線。
[0052] 圖12 :401. 11的變體的比對。根據實施例11，顯示了 401. 11對IGHV-9. 01和 401. 11的變體的重鏈與輕鏈的氨基酸序列比對。
[0053] 圖13 :401. 11的優化變體的比對。根據實施例11，顯示了 401. 11及其變體的重 鏈與輕鏈的氨基酸序列比對。
[0054] 圖14 :證明通過抗⑶Id抗體401. 11的增強變體對初生NKT細胞功能的提高 抑制的測定結果的圖示。根據實施例11，401.11及其變體從lyg/mL滴定。在使用 a -GalCer-擴增NKT細胞與a -GalCer-裝載的CD14+單核細胞-衍生的樹突細胞作為 ⑶Id陽性細胞的測定中，401. 11抗體變體證實與401. 11相比通過ELISA測定的在24小時 后類似或提高的IFN- γ (A)與IL-4 (B)釋放的抑制，以及與從10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗 體42和51. 1相比通過ELISA測定的在24小時后顯著提高的IFN-γ (A)與IL-4 (B)釋 放的抑制。在所有測定中，不相關的特異性陰性對照物抗體沒有抑制細胞因子釋放。表13 中給出了來自代表性試驗的EC50值。
[0055] 圖15 :402. 8的優化變體的比對。根據實施例11，顯示了 402. 8對402. 8的變體 的重鏈的氨基酸序列比對。
[0056] 圖16 :證明通過抗⑶Id抗體402. 8的增強變體抑制初生NKT細胞功能的測定結 果的圖示。根據實施例11，在使用α-GalCer-擴增NKT細胞和α-GalCer-裝載的CD14+ 單核細胞-衍生樹突細胞作⑶Id陽性細胞的測定中，402. 8及其變體由10 μ g/mL滴定并 證實與由10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗體42相比，通過ELISA測定的在24小時后的類似的 IFN-γ (A)與IL-4 (B)釋放的抑制，和通過ELISA測定的在24小時后顯著提高的IFN-γ (A)與IL-4 (B)釋放的抑制。在所有測定中，不相關的特異性陰性對照物抗體沒有抑制細 胞因子釋放。在表18中給出了來自代表性試驗的EC50值。
[0057] 圖17 :證明在使用α-GalCer的替代抗原的基于初生NKT細胞的測定中通過 抗CDld抗體對初生NKT細胞功能的提高抑制的測定結果的圖示。根據實施例12,在使用 a -GalCer-擴增NKT細胞和C24:1 β -D-吡喃葡萄糖基神經酰胺-裝載的⑶14+單核細 胞-衍生樹突細胞作為⑶Id陽性細胞的測定中，由10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗體42和51 相比，由lyg/mL滴定的抗體401. 11. 158、401. 11和402. 8證實了通過ELISA測定的在24 小時后IFN-γ (A)和IL-4 (B)釋放的顯著提高的抑制。在所有測定中，不相關的特異性 陰性對照物抗體沒有抑制細胞因子釋放。在表20中給出了來自代表性試驗的EC50值。
[0058] 圖18 :證明在修正的條件下高度有效的抗⑶Id抗體共享不同于通過現有技術抗 體所看到的表位的類似中和表位的競爭ELISA的結果圖示。根據實施例13,如通過450nm 下吸光度讀數（A)與競爭轉化度(百分比）值（B)所顯示的那樣，抗體402. 8與其本身和與 401. 11競爭但不與抗體42和51. 1競爭結合人⑶Id。
[0059] 圖19 :證明是401. 11變體的高度有效的抗⑶Id抗體與402. 8共享類似中和表位 的競爭ELISA的結果圖示。根據實施例13,如通過450nm下吸光度讀數(A)與競爭轉化度 (百分比）值（B)所顯示的那樣，抗⑶Id抗體402. 8與其本身并與作為401. 11抗體變體實 例的 401. 11. 160、40L 11. 161 和 401. 11. 165 強烈競爭結合人 CDld。
[0060] 圖20 :證明衍生自402. 8的高度有效的抗⑶Id抗體與402. 8共享類似中和表位 的競爭ELISA的結果圖示。根據實施例13,如通過450nm下吸光度讀數(A)與競爭轉化度 (百分比）值（B)所顯示的那樣，抗⑶Id抗體402. 8與其本身并與作為402. 8抗體變體實例 的 402. 8. 84、402. 8. 86 和 402. 8. 87 強烈競爭結合人 CDld。
[0061] 圖21 :證明單克隆抗人⑶Id抗體不競爭402. 8的中和表位的競爭ELISA的結果 圖示。如實施例13中所述，如通過吸光度讀數(A)與競爭轉化度(百分比）值（B)所顯示的 那樣，抗⑶Id抗體402. 8與其本身強烈競爭但不與其它單克隆抗人⑶Id抗體例如AD58E7、 C3D5和C-9競爭結合人CDld。
[0062] 圖22 :證明單克隆抗小鼠⑶Id抗體不競爭402. 8的中和表位的競爭ELISA的結果 圖示。如實施例13中所述，如通過450nm下吸光度讀數（A)與競爭轉化度（百分比）值（B) 所顯示的那樣，抗CDld抗體402. 8與其本身強烈競爭但不與其它單克隆抗小鼠 CDld抗體 例如HB-321、HB-322和HB-323競爭結合人CDld。
[0063] 圖23 :證明多克隆抗人⑶Id抗體不競爭402. 8的中和表位的競爭ELISA的結果 圖示。如實施例13中所述，如通過450nm下吸光度讀數（A)與競爭轉化度（百分比）值（B) 所顯示的那樣，抗CDld抗體402. 8與其本身強烈競爭但不與作為多克隆抗人CDld抗體的 實例的C-19、H70和Ab96515競爭結合人CDld。
[0064] 圖24 :證明高度有效的抗⑶Id抗體共享不同于其它抗⑶Id抗體所結合表位的類 似中和表位的競爭ELISA的結果圖示。如實施例13中所述，如通過450nm下吸光度讀數 (A)與競爭轉化度（百分比）值（B)所顯示的那樣，抗⑶Id抗體401. 11. 158與其本身并與 402. 8強烈競爭，但不與抗⑶Id抗體42和51. 1競爭結合人⑶Id。
[0065] 圖25 :證明402. 8以及Fab或全長IgG形式的40L 1L 165結合至人CDld的ELISA 結果的圖示。
[0066] 圖26 :用于闡明抗⑶Id抗體結合的人⑶Id上的位置的⑶Id結構的序列比對。
[0067] 圖27 :證明結合人⑶Id和已經向其中引入人序列的小鼠 ⑶Id (mCDldhu)的抗體 402. 8 (A)與401. 11. 158 (B)的滴定的ELISA結果的圖示。兩種抗體均沒有結合小鼠 ⑶Id 和已經向其中引入小鼠序列的人⑶Id (h⑶ldmu)。
[0068] 圖28 :證明抗人CDld抗體的表位的氫氘交換圖譜實驗結果的圖示。（A)具有以黑 色顯示的氨基酸89-94和141-14的人⑶Id (灰色)。注意：X射線結構是具有表面描述的 3HUJ。（B)與NKT細胞受體（α和β鏈)復合的人CDld(具有結合的α-GalCer)。人CDld 上的抗⑶Id抗體的表位(氨基酸89-94和141-142)的原子用深灰色著色。該抗⑶Id抗體 的表位位于該NKT細胞受體β -鏈的結合位點的附近。
[0069] 圖29Α :優化的401. 11抗體的VH區的比對和共有序列。框出區含有Kabat編號系 統與增強Chothia編號系統所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號系統定義的⑶R以粗體 顯示。由增強Chothia編號系統定義的⑶R具有下劃線。
[0070] 圖29B :優化的401. 11抗體的八區的比對和共有序列。框出區含有Kabat編號系 統與增強Chothia編號系統所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號系統定義的⑶R以粗體 顯示。由增強Chothia編號系統定義的⑶R具有下劃線。
[0071] 圖30A:優化的402. 8抗體的VH區的比對和共有序列。框出區含有Kabat編號系 統與增強Chothia編號系統所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號系統定義的⑶R以粗體 顯示。由增強Chothia編號系統定義的⑶R具有下劃線。
[0072] 圖30B :優化的402. 8抗體的八區的比對和共有序列。框出區含有Kabat編號系 統與增強Chothia編號系統所定義的⑶R (如所示)。由Kabat編號系統定義的⑶R以粗體 顯示。由增強Chothia編號系統定義的⑶R具有下劃線。
[0073] 發明詳述
[0074] 本發明涉及結合CDld的特定表位的人和人源化的抗體及其抗原結合部分。本發 明人已經發現，結合CDld的這種表位的抗體在減輕CDld對NKT細胞的影響方面特別有效。 由于這種影響，據信這些抗體與其抗原結合部分將可用于治療其中NKT細胞效應子功能 (例如NKT細胞過度產生細胞因子）起作用的病況，例如哮喘。
[0075] 因此，在第一方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分， 其中該分離的抗體或其抗原結合部分與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體競爭與CDld 的結合。
[0076] 在第二方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分結合與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體所結合的表位 相同的⑶Id表位。
[0077] 在第三方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含具有選自SEQ ID N01、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、 40、41、42、43、44和45的序列和至少95%與之相同的序列的VH域。
[0078] 在第四方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含具有選自SEQ ID勵2、4、6、46、49和62的序列和至少 95%與之相同的序列的VL域。
[0079] 在第五方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID NO:125)。
[0080] 在本發明的這一方面的實施方案中，⑶R3的序列是DMCSSSGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 126), DLCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 152), DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 153), DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 154), GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID NO: 127), GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID N0:128), GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO: 155), GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID NO: 156), GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)或GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。在進一步的實施 方案中，CDR2 的序列是 TIIWNSAIIGYADSVKG (SEQ ID N0:131)、EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:132)、EINPSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:133)或EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:134)。
[0081] 在第六方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含VH域，該VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID NO:136)。
[0082] 在本發明的第六方面的實施方案中，⑶R3的序列是DMCSSSGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 126), DLCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 152), DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 153), DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID NO: 127)、GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID N0:128), GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO: 155), GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID NO: 156), GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)或GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。在進一步的實施 方案中，CDR2 的序列是 IWNSAI (SEQ ID N0:137)、NHSGS (SEQ ID N0:138)、NPSGS (SEQ ID NO:139)或 NHAGS (SEQ ID NO:140)。
[0083] 在第七方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分包含VL域，該VL域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列 與 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 RASQHISSWLA (SEQ ID N0:141)或 ASSSGAVSSGNFPN (SEQ ID N0:142)〇
[0084] 在本發明的第七方面的實施方案中，⑶R3的序列是QQANRFPLT (SEQ ID N0:141) 或LLYFGDTQLGV (SEQ ID N0:142)。在進一步的實施方案中，CDR2的序列是AASSLQS (SEQ IDN0:145)*SASNKHS(SEQIDN0:146)。
[0085] 在第八方面中，本發明提供結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該 分離的抗體或其抗原結合部分結合具有如使用基于細胞的效價測定測得的小于20ng/ml 的EC50的CDld。在實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部分結合具有0. 5ng/ml至 20ng/ml 的 EC50 的人 CDld。
[0086] 在本發明的實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO: 2的VH和VL序列對。
[0087] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 46 的 VH 和 VL 序列對。
[0088] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQID NO: 24 和 SEQ ID NO:47 的 VH 和 VL 序列對。
[0089] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的VH和VL序列對。
[0090] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 48 的 VH 和 VL 序列對。
[0091] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 49 的 VH 和 VL 序列對。
[0092] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 50 的 VH 和 VL 序列對。
[0093] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 28 和 SEQ ID NO: 51 的 VH 和 VL 序列對。
[0094] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 52 的 VH 和 VL 序列對。
[0095] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 53 的 VH 和 VL 序列對。
[0096] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 54 的 VH 和 VL 序列對。
[0097] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 55 的 VH 和 VL 序列對。
[0098] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 56 的 VH 和 VL 序列對。
[0099] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 34 和 SEQ ID NO: 57 的 VH 和 VL 序列對。
[0100] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 58 的 VH 和 VL 序列對。
[0101] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 59 的 VH 和 VL 序列對。
[0102] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQID NO: 37 和 SEQ ID NO: 60 的 VH 和 VL 序列對。
[0103] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 38 和 SEQ ID NO: 61 的 VH 和 VL 序列對。
[0104] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO :40 和 SEQ ID NO :62 的 VH 和 VL 序列對。
[0105] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 41 和 SEQ ID NO: 63 的 VH 和 VL 序列對。
[0106] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID N0:42 和 SEQ ID N0:64 的 VH 和 VL 序列對。
[0107] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對。
[0108] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對。
[0109] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對。
[0110] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列對。
[0111] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO :43 和 SEQ ID NO :65 的 VH 和 VL 序列對。
[0112] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO :44 和 SEQ ID NO :66 的 VH 和 VL 序列對。
[0113] 在本發明的一個實施方案中，提供分離的抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO :45 和 SEQ ID NO :67 的 VH 和 VL 序列對。
[0114] 在任一上述方面的一個實施方案中，該抗體或其抗原結合部分結合人⑶Id (SEQ ID NO: 116)，但是不結合h⑶ldmu (SEQ ID NO: 119)。在任意上述方面的一個實施方案 中，該抗體或其抗原結合部分結合mCDldhu (SEQ ID N0:118)，但是不結合mCDld (SEQ ID N0:117)。
[0115] 在第九方面中，本發明提供分離的DNA分子，其編碼本發明的分離的抗體或其抗 原結合部分。在一個實施方案中，該分離的DNA分子選自以下SEQ ID N0的任意種：10、 11、12、13、14、15、16、17、18、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115或至少95%與之相同的序列或在中等至高度嚴格條件 下與之雜交的序列。在一個實施方案中，分離的DNA分子選自以下SEQ ID N0的任一種：10、 11、12、13、14、15、16、17、18、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114 或 115。
[0116] 在第十方面中，本發明提供在人類對象中治療涉及NKT細胞效應子功能的病況的 方法，包括向對象施用本發明的分離的抗體或其抗原結合部分。
[0117] 在第十一方面中，本發明提供檢測樣品中存在CDld的方法，其包括使懷疑含有 CDld的樣品與本發明的分離的抗體或其抗原結合部分在允許該抗體或其抗原結合部分結 合CDld的條件下接觸以形成復合物并檢測樣品中該復合物的存在。
[0118] 在第十二方面中，本發明提供檢測細胞樣品中CDld陽性細胞的存在的方法，該 方法包括將細胞群體與本發明的分離的抗體或其抗原結合部分接觸以允許該抗體或其抗 原結合部分結合CDld陽性以形成復合物并檢測該抗體或其抗原結合部分細胞復合物的存 在。
[0119] 在第十三方面中，本發明提供從多種CDld結合蛋白中選擇特異性地結合人CDld 并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競爭在⑶Id上的結合的⑶Id結合 蛋白的方法，該方法包括：
[0120] 在足以允許CDld結合蛋白結合該突變蛋白以形成CDld結合蛋白-人CDld突變蛋 白復合物和排除的多種沒有結合該人CDld突變蛋白的CDld結合蛋白的條件下使多種CDld 結合蛋白接觸人⑶Id突變蛋白，在所述人⑶Id突變蛋白中SEQ ID NO: 116位置87至93 和141-143的氨基酸已經被這些位置處的相應的小鼠氨基酸取代，并且從排除的多種⑶Id 結合蛋白中收集沒有結合人CDld突變蛋白的CDld結合蛋白，其中收集的CDld結合蛋白特 異性地結合人⑶Id并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競爭在⑶Id上 的結合。
[0121] 在第十四方面中，本發明提供從多種CDld結合蛋白中選擇特異性地結合人CDld 的CDld結合蛋白的方法，該方法包括：
[0122] 在足以允許⑶Id結合蛋白結合h⑶ldmu以形成⑶Id結合蛋白-h⑶ldmu復合物 和排除的多種沒有結合hCDldmu的CDld結合蛋白的條件下，使多種CDld結合蛋白與其中 位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143處的氨基酸已經被相應于小鼠 的這些位置處的序列替代的h⑶ldmu (SEQ ID N0:119)接觸，并從排除的多種⑶Id結合蛋 白中收集沒有結合hCDldmu的CDld結合蛋白，其中收集的CDld結合蛋白特異性地結合人 CDld(SEQIDN0:116)或mCDldhu(SEQIDN0:118)。本發明的抗CDld抗體還可以用于 從血液中識別或選擇CDld陽性細胞群體。抗CDld抗體可用于在人類患者的外周血中檢測 CDld陽性細胞群，包括骨髓細胞如單核細胞，或淋巴樣細胞如B細胞。該抗體可用于在其中 此類⑶Id陽性細胞導致疾病的病況中檢測這些細胞，所述疾病例如是某些白血病，包括慢 性淋巴細胞白血病（CLL) (Metelitsa 等人，Leukemia(2003) 17, 1068 - 1077 ;Kotsianidis 等人，2011 ;AmJClinPathl36, 400-408)。
[0123] 該抗人CDld抗體還可以用于使用本領域公知的方法對組織切片進行染色用于免 疫組織化學。
[0124] 在本發明的某些具體實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部分可以包含人 kappa鏈恒定區或人lambda鏈恒定區。在某些實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部 分包含IgGl或IgG4恒定區。當該抗體包含IgG4恒定區時，其可以包括S228P突變。
[0125] 本發明還提供編碼本發明的分離的抗體或其抗原結合部分的DNA分子。在某些實 施方案中，該DNA分子的序列選自SEQ ID N0. 10至18、SEQ ID N0S68至115或至少95%與 之相同的序列或在中等至高度嚴格條件下與之雜交的序列的任意一種。
[0126] 本發明還提供在人類對象中治療涉及NKT細胞效應子功能的病況的方法，其包括 向該對象施用本發明的分離的抗體或其抗原結合部分。可以治療的涉及NKT細胞效應子功 能例如NKT細胞過度產生細胞因子的病況實例包括牛皮癬、潰瘍性結腸炎、原發性膽汁性 肝硬化、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、哮喘和與鐮 狀細胞病相關的肺部炎癥或機能障礙。
[0127] 如在下列實施例中描述的那樣，本發明人已經開發了結合CDld的特定表位的有 效抗體。確定這個表位的性質是抗體和抗原提供（arm)的領域中的技術人員的常規技術。 本領域那些技術人員公知的可用于確定抗體401. 11和402. 8結合的⑶Id表位的方法包括 CDld丙氨酸掃描誘變、氫/氣交換圖譜(mapping)、X射線晶體學、核磁共振和光親和標記 法。
[0128] 丙氨酸掃描誘變（參見例如 Ausubel: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN047 150338, 1987，第 8 和 15 章；或 Cunningham 等 人，1989Science244 1081-5)在CDld分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變。隨后對 所得突變分子測試它們結合該401. 11和/或402. 8抗體的能力。損失結合意味著已經變 為丙氨酸的特定殘基可能包括在該表位中。
[0129] 在使用氫氘交換的表位圖譜中，CDld中的氫在溶液中用氘交換。該401. 11和/或 402. 8抗體隨后結合到CDld上，其隨后在H20中交換回氫。在該方法中，存在于該表位中的 氘被抗體的結合保護。比較受該抗體結合保護和未受保護的CDld的交換模式揭示了作為 保留氣的CDld的氣基酸殘基的該表位。
[0130] 在X射線晶體學中，將401. 11和/或402. 8抗體與之結合的⑶Id結晶，并通過 X射線衍射檢查該晶體。這種方法提供了抗體與之結合的CDld的區的明確信息。核磁共 振或光親和標記也可使用，如deVos等人，1992Science255 306-12 ;和Smith等人，1992J MolBiol224 899-904 中所述。
[0131] 如本領域技術人員將理解的那樣，通過本發明的抗體或其抗原結合部分識別的表 位可以包含氨基酸的線性系列或可以是構象表位。
[0132] 在一方面中，本發明涉及與至少一種選自401. 11和402. 8的抗體競爭結合人⑶Id 的抗體。
[0133] 本文中所用的"競爭"指的是該抗體或其抗原結合部分以濃度依賴性方式降低了 選自 40L 11、40L 1L 28、402· 8、402· 8. 45、402· 8. 53 和 402. 8. 60 的至少一種抗體與 CDld 的結合。在下面給出的實施例7中提供了評估其的方式的一個實例。特別地，當選自401. 11 和402. 8的至少一種抗體與測試抗體的結合比與相同濃度使用的抗體42或51. 1結合極大 降低時，抗體或其抗原結合部分被稱為與至少一種選自401. 11和402. 8的抗體"競爭"與 CDld的結合(現有技術的抗體42和5L 1描述在Exley等人，1997JExp Medl86, 109-120和 W003/092615 中）。
[0134] 如本文中所述，"競爭結合CDld"的抗體或其抗原結合部分在競爭ELISA的歸一 化結果中表現出至少50%的競爭，其中40 μ g/mL的非生物素化測試抗體與結合到固定在固 體底物上的1. 〇 μ g/mL重組人⑶Id上結合的0. 2 μ g/mL生物素化抗⑶Id抗體402. 8或 40L 11 或 40L 1L 158 競爭。
[0135] 在某些實施方案中，本發明提供分離的抗體或其抗原結合部分，其結合具有如使 用基于細胞的效價測定測得的小于20ng/ml的EC50的CDld。在某些實施方案中，該分離的 抗體或其抗原結合部分結合至具有〇. 5ng/ml至20ng/ml的EC50的⑶Id。如本文中所用， 如下文給出的實施例4中那樣評估該抗體或其抗原結合部分的EC50。
[0136] 如上所述，該抗體或其抗原結合部分特異性地結合CDld。本文中所用的術語"特 異性地"指的是與CDld的結合是經由該抗體或其抗原結合部分的VH和VL域并且不是非特 異性結合(例如可以經Fc區發生的）。
[0137] 如在下列實施例中所述，本發明的抗體或其抗原結合部分與人CDld、和食蟹猴或 獼猴⑶Id結合。這與現有技術的抗體42和51. 1不同。
[0138] 人⑶Id的氨基酸序列可以是例如：
[0139] MGCLLFLLLWALLQAWGSAEVPQRLFPLRCLQISSFANSSffTRTDGLAffLGELQTHSffSNDSDTVRSLK PWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQG TSWEPTQEAPLffVNLAIQVLNQDKWTRETVQffLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAffLSRGPSPGPGRLLLV CHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQP⑶ILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYT SMGLIALAVLACLLFLLIVGFTSRFKRQTSYQGVL (SEQ ID 勵：157)人0)1(1的此1?1'(^登錄號為 P15813。
[0140] 在另一方面，本發明涉及抗體，其結合與選自401. 11和402. 8(在某些實施方案中 為40. 11. 158)的至少一種抗體所結合的表位相同的⑶Id的表位。如上所述，通過特定抗 體結合的CDld的表位可以通過許多方法評估，并且隨后可以與指定抗體所結合的表位進 行比較。
[0141] 在一個實施方案中，該表位包含SEQ ID N0:116的殘基141至143或SEQIDN0:116 的殘基87至93和141至143。
[0142] 本文中所用的術語"抗體"廣泛地指由四條多肽鏈--兩條重（H)鏈和兩條輕（L) 鏈--組成的任何免疫球蛋白（Ig)分子，或其保留了 Ig分子的必需表位結合特征的任何 功能性片段、突變體、變體或其衍生物。此類突變體、變體或衍生物抗體形式是本領域已知 的。下面討論其非限制性實施方案。
[0143] 在全長抗體中，各重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區 組成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮 寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可以 進一步細分為稱作互補決定區（CDR)的超可變區，該超可變區點綴有稱為框架區（FR)的更 保守的區。各VH和VL由三個CDR和四個FR組成，其以下列次序從氨基端向羧基端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何類型(例如，IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA 和 IgY)、類別（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。
[0144] 本文中所用術語抗體的"抗原結合部分"指的是保留了特異性地結合抗原(例如 CDld)的能力的抗體或蛋白質的一個或多個片段。已經表明，抗體的抗原結合功能可以通 過全長抗體的片段來實施。此類抗體實施方案還可以是雙特異性、雙重特異性的或多重特 異性的形式；特異性地結合兩個或多個不同的抗原。涵蓋在術語抗體的"抗原結合部分" 中的結合片段的實例包括（i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的一價片段；（ii) F (ab'）2片段，包含在鉸鏈區通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；（iii )由VH和 CH1結構域組成的Fd片段；（iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；（v)結構 域抗體（dAb) (Ward 等人，1989Nature341544_6，Winter 等人，PCT 公開 W090/05144,均 經此引用并入本文)，其包含單個可變結構域；和（vi)分離的互補決定區（⑶R)。此外，盡 管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但可以使用重組方法，通過能夠使其 制成單個蛋白質鏈的合成連接子，將它們接合，其中VL和VH區配對形成一價分子(稱為 單鏈 Fv(scFv));(參見例如 Bird 等人，1988Science242 423-6 ;Huston 等人，1988Proc Natl Acad Sci USA85 5879-83)。此類單鏈抗體也意在涵蓋在術語抗體的"抗原結合部 分"中。還涵蓋了其它形式的單鏈抗體，例如也涵蓋雙抗體。雙抗體是二價的、雙特異性的 抗體，其中在單個多肽鏈上表達VH和VL結構域，但使用太短以至于不允許同一鏈上兩個 結構域之間配對的連接子，由此迫使該結構域與另一條鏈的互補結構域配對并形成兩個抗 原結合位點（參見例如 Holliger, Ρ·等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 ; Poljak，R.J.等人，1994, Structure2:1121-1123)。此類抗體結合部分在本領域中是已知 的（Kontermann和Dubel 編輯，Antibody Engineering2001Springer-Verlag.New York.第 790 頁，ISBN3-540-41354-5)。
[0145] 本文中描述的抗體可以是人源化抗體。術語"人源化抗體"應理解為是指包含類人 可變區的蛋白質，其包括移植到或插入到來自人抗體的FR中的來自源于非人物種(例如小 鼠或大鼠或非人靈長目動物）的抗體的CDR (這種類型的抗體也稱為"CDR移植抗體")。人 源化抗體還包括其中人蛋白質的一個或多個殘基被一個或多個氨基酸置換改性和/或人 蛋白質的一個或多個FR殘基用相應的非人殘基替換的蛋白質。人源化抗體還可以包含既 非在人抗體中或也非在非人抗體中發現的殘基。該蛋白質的任何附加區(例如Fc區)通常是 人的。人源化可以使用本領域已知的方法進行，例如US 5225539、US 6054297、US 7566771 或US5585089。術語"人源化抗體"還涵蓋超人源化蛋白質，例如如在US 7732578中所述。
[0146] 本文中所述的抗體可以是人的。本文中所用的術語"人抗體"指的是具有在人類 中，例如在人類種系或體細胞中，發現的可變抗體區和任選恒定抗體區的蛋白質或來自使 用此類區制得的文庫的蛋白質。"人"抗體可以包括并非由人序列編碼的氨基酸殘基，例如 通過在體外的隨機或定點突變引入的突變(特別是包括在少量蛋白質殘基中，例如在蛋白 質的殘基的1、2、3、4、或5中的保守性置換或突變的突變)。這些"人抗體"不一定需要作為 人的免疫響應而產生，相反，它們可以使用重組手段(例如篩選噬菌體展示文庫)和/或通過 包含編碼人抗體恒定和/或可變區的核酸的轉基因動物(例如小鼠）和/或使用定向選擇 (例如如US5565332中所述)產生。該術語還涵蓋此類抗體的親和力成熟形式。就本公開目 的而言，人蛋白質還被認為包括含有來自人抗體的FR或包含來自人FR的共有序列的序列 的FR，其中CDR的一種或多種是隨機或半隨機的，例如如US6300064和/或US6248516中所 述。
[0147] 可以根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health，Bethesda，Md·，1987 和 1991 (在本文中也稱為 "Kabat 編號系 統"）來限定指定給⑶R和FR的氨基酸位置。在其它實施方案中，根據Enhanced Chothia Numbering Scheme ( http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)限定指定給 CDR 和 FR 的 氨基酸位置。根據Kabat的編號系統，VHFR和⑶R可如下定位：殘基1-30 (FRl)、31-35 (CDRl)、36-49 (FR2)、50-65 (CDR2)、66-94 (FR3)、95-102 (CDR3)和 103-113 (FR4)。 根據Kabat的編號系統，VLFR和CDR如下定位：殘基1-23 (FRl)、24-34 (CDRl)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)和 98-107 (FR4)。本公開不限于通 過Kabat編號系統限定的FR和CDR,而是包括所有編號系統，包括規范的編號系統或 Chothia和Lesk，J.MolBiol. 196:901-917, 1987 ;Chothia等人，Nature342, 877-883, 1989 ; 和 / 或 Al-Lazikani 等人，JMolBiol273, 927-948, 1997 ;Honnegher 和 Pliikthun 的 編號系統 J. Mol. Biol. , 309:657-670, 2001 ;或在 Giudicelli 等人，Nucleic Acids Res.，25:206-2111997中所討論的頂GT系統。在一個實例中，根據Kabat編號系統限定該 ⑶R。任選地，根據Kabat編號系統的重鏈⑶R2不包含本文中列舉的五個C-端氨基酸，或者 這些氨基酸的任意一個或多個被另一天然存在的氨基酸置換。在附加的或替換的選項中， 輕鏈CDR1不包含本文中列舉的四個N-端氨基酸，或者那些氨基酸的任意一個或多個被另 一天然存在的氨基酸置換。在這方面，Padlan等人，FASEBJ.，9:133-139, 1995證實了重鏈 CDR2的五個C端氨基酸和/或輕鏈CDR1的四個N端氨基酸通常不涉及抗原結合。
[0148] 本文中所用的術語"抗體構建體"指的是包含連接到連接多肽或免疫球蛋白恒定 結構域上的本發明的一個或多個抗原結合部分的多肽。連接多肽包含兩個或多個通過肽鍵 接合的氨基酸殘基并用于連接一個或更多抗原結合部分。此類連接多肽在本領域中是公知 的（參見例如 Holliger 等人，1993Proc Natl Acad Sci USA90 6444-8)。
[0149] 免疫球蛋白恒定結構域指的是重鏈或輕鏈恒定結構域。人IgG重鏈和輕鏈恒定結 構域氨基酸序列在本領域中是已知的，并且實例如下所示。
[0150] 人重鏈IgGl恒定域(或其衍生物，如NCBI登錄號：P01857)
[0151] ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIΕΚΤISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:158)
[0152] 人重鏈IgG4恒定結構域(如NCBI登錄號：P01861)
[0153] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:159)
[0154] 參入S228P突變的人重鏈IgG4恒定結構域
[0155] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:160)
[0156] 如US7, 083, 784中所述的參入S228P突變和YTE突變的人重鏈IgG4恒定結構域 也可以使用。
[0157] 人輕鏈kappa恒定結構域(如NCBI登錄號：P01834)
[0158] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:161)
[0159] 人輕鏈lambda恒定結構域(如NCBI登錄號：P01842)
[0160] QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASS YLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:162)
[0161] 如將被理解的，本發明中開發和描述的序列可以使用本領域公知的方法改性以提 高結合，例如通過親和力成熟，或通過除去預測的MHCII類結合基序來降低免疫原性。可 以通過調節其功能特性，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)、補體依賴性細胞毒性 (⑶C)、血清半衰期、生物分布和與Fc受體結合或任意這些方法的組合來進一步增強本文 中開發和描述的序列的治療實用性。這種調節可以通過蛋白質工程、糖工程或化學方法來 實現。取決于所需的治療應用，可以有利地提高或降低這些活性的任意種。
[0162] 用于抗體的親和力成熟的多種方法在本領域是已知的。這些方法許多基于通過誘 變并接著為提高的親和力而選擇和/或篩選生成變體蛋白的組或文庫的一般策略。誘變通 常在0嫩水平進行，例如通過易錯？0?法（111丨6!1200916丨11〇(18]\1〇18丨〇1.525:309-22)，通 過基因改組（Kolkman 和 Stemmer2001Nat Biotechnol. May; 19 (5) :423_8)，通過使用誘變 化學物質或輻射，通過使用具有易錯復制機制的"突變子"株（Green er1996)或通過利用天 然親和力成熟機制的體細胞超突變方法（Peled，Kuang等人，2008)。還可以在RNA水平下進 行誘變，例如通過使用Q3復制酶（Kopsidas，Roberts等人，2006)酶。允許篩選提高的變 體蛋白的基于文庫的方法可以基于各種展示技術，如噬菌體、酵母、核糖體、細菌或哺乳動 物細胞，并且在本領域是公知的（Benhar2007)。親和力成熟可以通過更有針對性/更有預 測性的方法來實現，例如通過定點誘變或通過來自3D蛋白質建模的發現所指導的基因合 成(參見例如Queen, Schneider等人，1989或美國專利6, 180, 370或美國專利5, 225, 539)。
[0163] 用于調節抗體血清半衰期和生物分布的多種方法基于改變抗體與新生Fc受體 (FcRn)之間的相互作用，所述新生Fc受體是在保護IgG免受分解代謝并保持高血清抗 體濃度中起關鍵作用的受體。Dali' Acqua等人描述了在IgGl的Fc區中增強與FcRn的 結合親和力的置換，由此提高血清半衰期（Dali' Acqua，Woods等人，2002)，并用M252Y/ S254T/T256E (YTE突變）的三重置換進一步證實了增強的生物利用率與ADCC活性的 調節（Dali，Acqua, Kiener 等人，2006)。還參見美國專利號 6, 277, 375 ;6, 821，505 ;和 7, 083, 784。Hinton等人已經描述了賦予提高的體內半衰期的在位置250和428處的恒 定結構域氨基酸置換（Hinton, Johlfs等人，2004) (Hinton, Xiong等人，2006)。還參見 美國專利號7, 217, 797。Petkova等人已經描述了賦予提高的體內半衰期的在位置307、 380和434處的恒定結構域氨基酸置換（Petkova, Akilesh等人，2006)。還參見Shields 等人（511丨61(18，似111611業等人，2001)和冊2000/42072。抗體恒定區還可以改性以去除 效應子功能。位置297處的天冬酰胺（N)突變為谷氨酰胺（Q)去除了介導Fc向Fc受體 的結合的N-聯碳水化合物。此類糖基化抗體不結合到人Fc γ RI并且不會激活補體途徑 (complementpathway) (Tao和Morrisonl989)。調節與Fc受體的結合以及隨后通過這些 受體介導的功能(包括FcRn結合和血清半衰期）的恒定結構域氨基酸置換的其它實例描述 在美國專利申請號 20090142340 ;20090068175 ;和 20090092599 中。
[0164] 在包含Fc區的本發明的分子中，在某些實施方案中工程設計置換L235E中以 減少或消除Fc結合和Fc相關效應子功能是有利的，如在Lund, Winter等人，（1991) J Immunologyl47:2657-2662 和 Alegre 等人，（1992) J Immunologyl48:3461-3468 中所述。 該抗體可以是IgGl，和IgG3或IgG4。
[0165] 在包含Fc區的本發明的分子中，在某些實施方案中工程設計或以其它方式選擇 其中C端賴氨酸（K447)被刪除的Fc是有利的。優選這種修改通過降低表達的分子的異質 性而提高可制造性。
[0166] 連接抗體分子的多糖已知會影響抗體與Fc受體和多糖受體的相互作用并由此影 響抗體活性，包括血清半衰期（Kaneko, Nimmer jahn等人，2006Jones, Papac等人，2007 ; 和Kanda，Yamada等人，2007)。因此，調節期望的抗體活性的某些糖形可以賦予治療優 勢。產生工程的糖形的方法是本領域已知的，并且包括但不限于美國專利號6, 602, 684 ; 7, 326, 681 ;7, 388, 081 ;和 W02008/006554 中描述的那些。
[0167] 通過添加聚乙二醇（PEG)延長半衰期已經廣泛用于延長蛋白質的血清半衰期，如 例如由Fishburn2008所綜述的。
[0168] 本發明還提供包含至少一種本發明的分離的抗體或其抗原結合部分的組合物。這 種組合物通常將包含至少一種配制劑，所述配制劑選自無菌水、無菌緩沖水和/或至少一 種防腐劑，所述防腐劑選自苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、芐醇、對羥基苯甲酸烷基 酯、苯扎氯銨、芐索氯銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或其在水性稀釋劑中的混合物，任選地，其 中蛋白質的濃度為約〇. lmg/ml至約200mg/ml，進一步包含至少一種等滲劑或至少一種生 理可接受的緩沖劑。
[0169] 本發明的抗體組合物可以任選進一步包含有效量的至少一種化合物或蛋白質， 其選自抗感染藥、心血管（CV)系統藥、中樞神經系統（CNS)藥、自主神經系統（ANS)藥、呼 吸道藥、胃腸（GI)道藥、激素藥、用于體液或電解質平衡的藥、血液學藥、抗腫瘤藥、免疫 調節藥、眼、耳或鼻藥、局部用藥、營養藥等等的至少一種。這些藥在本領域是公知的，包 括各種本文中提出的制劑、指征、劑量和給藥(參見例如Nursing2001Handbook of Drugs, 第 21 版，Springhouse Corp. , Springhouse, Pa.,2001 ；Health ProfessionalJ s Drug Guide2001,編輯Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N. J.； Pharmcotherapy Handbook, Wells 等人編輯，Appleton&Lange, Stamford, Conn.,其各自經 此引用全文并入本文)。
[0170] 本發明的組合物可以進一步包含任何合適的助劑的至少一種，例如但不限于稀 釋劑、粘合劑、穩定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等等。優選藥學上可接受 的助劑。此類無菌溶液的非限制性實例及其制備方法在本領域是公知的，例如但不限 于 Gennaro 編輯，Remington, sPharmaceutical Sciences,第 18 版，Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990。可以如本領域中公知或如本文中所述那樣常規選擇適于給藥方式、 抗體組合物的溶解性和/或穩定性的藥學可接受載體。
[0171] 可用于本組合物的藥物賦形劑和添加劑包括但不限于蛋白質、肽、氨基酸、脂質 和碳水化合物(例如，糖，包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇類、醛糖酸 類、酯化糖類等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以單獨或組合地存在，單獨或組合地構成 1-99. 99重量％或體積％。示例性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白，如人血清白蛋白（HSA)、重 組人白蛋白（rHA)、明膠、酪蛋白等等。也可以在緩沖能力方面起作用的代表性的氨基酸包 括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。一種優選的氨基酸是組氨酸。第二 優選的氨基酸是精氨酸。
[0172] 適用于本發明的碳水化合物賦形劑包括例如單糖類，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、 葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖類，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維素二糖等等；多糖 類，例如蜜三糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇類，例如甘露糖醇、木糖 醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（山梨醇)、肌醇等等。用于本發明的優選的碳水化合 物賦形劑是甘露糖醇、海藻糖和蜜三糖。
[0173] 抗體組合物還可以包括緩沖劑或pH調節劑；通常，緩沖劑是由有機酸或堿制備的 鹽。代表性的緩沖劑包括有機酸鹽，如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或鄰苯二甲酸的鹽；Tris、鹽酸氨丁三醇（tromethamine)或磷酸鹽緩沖劑。用于本組合 物的優選緩沖劑是有機酸鹽，如檸檬酸鹽。
[0174] 此外，本發明的組合物可以包含聚合賦形劑/添加劑，如聚乙烯吡咯烷酮、菲可 (一種聚合糖)、葡萄糖結合劑(例如，環糊精，如2-羥丙基-β -環糊精)、聚乙二醇、調味劑、 抗微生物齊?、甜味齊?、抗氧化齊?、抗靜電齊?、表面活性劑(例如聚山梨酯，例如" TWhHN? 20"和" TWEEN? 80")、脂質(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇）和螯合劑(例如 EDTA)。
[0175] 適用于本發明的抗體組合物的這些和其它已知藥物賦形劑和/或添加劑在 本領域中是己知的，例如如在"Remington:The Science&Practice of Pharmacy"， 第 19 版，Williams&Williams, (1995)和在 "Physician，sDesk Reference"，第 52 版，MedicalEconomics, Montvale, N. J. (1998)中所列舉的，其公開內容經此引用全部并入 本文。優選的載體或賦形劑材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和緩沖劑(例如檸檬酸鹽)或 聚合劑。
[0176] 本發明還提供了治療涉及NKT細胞效應子功能的病況的方法，其包括施用該抗體 或其抗原結合部分。本文中所用的術語"NKT細胞效應子功能"意在包括由致使NKT細胞的 CDld限制性糖脂活化所產生的NKT細胞功能。此類功能包括但不必要限于以下的任意一種 或多種：由NKT細胞的腫瘤壞死因子a (TNF- α )、IFN- γ、IL-4、IL-5或IL-13釋放，NKT 細胞表面FasL表達的上調、釋放穿孔素以及由ΝΚΤ細胞釋放粒酶Β。
[0177] 給藥途徑可以選自寬范圍的給藥途徑，包括腸胃外、肌內、靜脈內、推注（bolus)、 腹膜內、皮下、呼吸、吸入、局部、鼻、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內、真皮下和經皮。但是目 前據信最合適的途徑是腸胃外或吸入。關于吸入蛋白質的附加信息可以在Borish LC等 人，1999Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160(6)，1816-1823 中找到。
[0178] 對于腸胃外給藥，該抗體或其抗原結合部分可以配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干 粉末，與藥學上可接受的腸胃外載體結合或單獨地提供。此類載體的實例是水、鹽水、林格 氏溶液、右旋葡萄糖溶液和1-10%的人血清白蛋白。也可以使用脂質體和非水性載體，如不 揮發油。載體或凍干粉末可含有保持等滲性的添加劑(例如氯化鈉、甘露糖醇）和保持化學 穩定性的添加劑(例如，緩沖劑和防腐劑)。通過已知的或合適的技術將該制劑滅菌。
[0179] 本發明的分離的核酸分子可以包括包含開放閱讀框（0RF)的核酸分子，任選具有 一個或多個內含子，例如但不限于分別具有至少一個重鏈或輕鏈的至少一個⑶R (如⑶R1、 CDR2和/或CDR3)的至少一個特定部分；包含抗體或其抗體結合部分的編碼序列的核酸分 子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列但其因遺傳密碼簡并仍編碼本文中所述的 和/或本領域已知的至少一種抗體或抗體結合部分的核酸分子。當然，遺傳密碼在本領域 中是公知的。因此，產生編碼本發明的特異性抗體或其抗體結合部分的此類簡并核酸變體 對本領域技術人員而言是常規的。參見例如Ausubel等人(上文)，并且此類核酸變體包括 在本發明中。
[0180] 如本文中所示，包含編碼抗體或其抗體結合部分的核酸的本發明的核酸分子可以 包括但不限于自身編碼抗體或其抗體結合部分的氨基酸序列的那些；整個抗體或其抗體結 合部分的編碼序列；抗體或其抗體結合部分的編碼序列以及附加序列，例如至少一個信號 前導或融合肽的編碼序列，含有或不含有前述附加編碼序列，例如至少一個內含子，以及附 加的非編碼序列，包括但不限于非編碼5'和3'序列，如在轉錄、mRNA加工(包括剪接和多 腺苷酸化信號--例如核糖體結合和mRNA的穩定性）中起作用的轉錄、未翻譯的序列；編 碼附加氨基酸的附加編碼序列，例如提供附加功能的那些。由此，編碼抗體或其抗體結合部 分的序列可以融合成標記序列(例如編碼有助于純化該融合抗體或其抗體結合部分的肽的 序列)。
[0181] 本發明提供了在選擇性雜交條件下與編碼本發明的抗體或其抗體結合部分的多 核苷酸雜交的分離的核酸。因此，該具體實施方案的多核苷酸可以用于分離、檢測和/或量 化包含此類多核苷酸的核酸。例如，本發明的多核苷酸可以用于識別、分離或擴增保藏文 庫中的部分或全長克隆。在某些具體實施方案中，該多核苷酸是從人或哺乳動物核酸文庫 分離的基因組或cDNA序列，或者是與來自人或哺乳動物核酸文庫的cDNA互補的基因組或 cDNA序列。
[0182] 該cDNA文庫優選包含至少80%的全長序列，優選至少85%或90%的全長序列，更 優選至少95%的全長序列。可以將cDNA文庫標準化以提高罕見序列的呈現。通常，但不限 于，與相對于互補序列具有降低的序列同一性的序列，使用低或中等嚴格雜交條件。對于同 一性較高的序列，任選使用中等和高度嚴格條件。低嚴格條件允許具有約70%的序列同一 性的序列的選擇性雜交，并可以用于識別直系同源序列或旁系同源序列。
[0183] 任選地，本發明的多核苷酸將編碼由本文中所述多核苷酸編碼的抗體或其抗原結 合部分的至少一部分。本發明的多核苷酸包括可用于與編碼本發明的抗體或其抗原結合部 分的多核苷酸選擇性雜交的核酸序列（參見例如Ausubel,上文)。
[0184] 可以使用本領域公知的（a)重組方法，（b)合成技術，和（c)純化技術，或其組合來 制備本發明的分離的核酸。
[0185] 該核酸可以方便地包含除本發明的多核苷酸外的序列。例如，可以將包含一個或 多個限制性核酸內切酶位點的多克隆位點插入到該核酸中以幫助多核苷酸的分離。此外， 可以插入可翻譯序列以幫助分離本發明的翻譯的多核苷酸。例如，六-組氨酸標記序列提 供方便的手段以純化本發明的蛋白質。除該編碼序列外，本發明的核酸任選是用于克隆和 /或表達本發明的多核苷酸的載體、接頭或連接區。
[0186] 可以將附加序列添加到此類克隆和/或表達序列中以優化它們在克隆和/或表達 中的功能，以便幫助多核苷酸的分離，或改善將多核苷酸引入到細胞中。克隆載體、表達載 體、接頭和連接區的使用在本領域中是公知的(參見例如Ausubel,上文)。
[0187] 可以使用任何數量的本領域技術人員已知的克隆方法，從生物來源獲得本發明的 分離的核酸組合物，例如RNA、cDNA、基因組DNA或其任意組合。在一些具體實施方案中，在 嚴格條件下與本發明的多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針用于在cDNA或基因組DNA文 庫中識別所需序列。RNA的分離以及cDNA和基因組文庫的構建是本領域普通技術人員公知 的(參見例如Ausubel,上文)。
[0188] 可以使用基于本發明的多核苷酸序列（如本文公開的那些）的探針來篩選cDNA或 基因組文庫。探針可以用于與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同生物體中的 同源基因。本領域技術人員將認識到在測定中可以使用各種嚴格程度的雜交；并且雜交或 洗滌介質可以是嚴格的。當雜交條件變得更嚴格時，用于發生雙鏈體形成的探針與靶標之 間的互補程度必須更高。可以通過溫度、離子強度、pH和存在部分變性溶劑(例如甲酰胺） 的存在中的一種或多種來控制嚴格程度。例如，通過經由在0%至50%范圍內控制甲酰胺 濃度來改變反應物溶液的極性，由此方便地改變雜交的嚴格性。可檢測結合所需的互補性 (序列同一性)程度將根據雜交介質和/或洗滌介質的嚴格性而變化。互補性程度最適宜為 100%，或90-100%，或其中任何的范圍或值。但是，應當理解的是，探針和引物中較小的序列 變化可以通過降低雜交和/或洗滌介質的嚴格性來補償。
[0189] RNA或DNA的擴增方法在本領域中是公知的，并且可以基于本文中提供的教導 和指導根據本發明使用，而無需過度試驗。已知的DNA或RNA的擴增方法包括但不限 于聚合酶鏈式反應（PCR)和相關的擴增方法(參見例如授予Mullis等人的美國專利號 4, 683, 195、4, 683, 202、4, 800, 159、4, 965, 188 ;授予 Tabor 等人的美國專利號 4, 795, 699 和4, 921，794 ;授予Innis的美國專利號5, 142,033 ;授予Wilson等人的美國專利號 5, 122,464 ;授予Innis的美國專利號5,091，310 ;授予Gyllensten等人的美國專利號 5, 066, 584 ;授予Gelfand等人的美國專利號4, 889, 818 ;授予Silver等人的美國專利號 4, 994, 370 ;授予Biswas的美國專利號4, 766, 067 ;授予Ringold的美國專利號4, 656, 134) 和使用作為用于雙鏈DNA合成的模板的目標序列的反義RNA的RNA介導擴增(授予Malek等 人的美國專利號5, 130, 238,商標名為NASBA)，參考文獻的全部內容經此引用并入本文(參 見例如Ausubel,上文）。
[0190] 例如，PCR技術可以用于擴增本發明的多核苷酸序列和直接來自基因組DNA或 cDNA文庫的相關基因。PCR和其它體外擴增方法也可用于例如克隆編碼待表達蛋白質的 核酸序列、制造用作檢測樣品中所需mRNA的存在、用于核酸測序或用于其它目的的探針 的核酸。通過體外擴增方法足以指導技術人員的技術實例可以在下列參考文獻中找到： Ausubel,上文，以及Mullis等人，美國專利號4,683,202 (1987);和Ihnis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds, Academic Press Inc. , San Diego, Calif. (1990)。用于基因組PCR擴增的市售試劑盒在本領域中是已知的。參見例如 Advantage?-GC Genomic PCR Kit (Clontech)QT4 基因 32 蛋白（Boehringer Mannheim) 可以用于提高長PCR產物的產率。
[0191] 還可以通過已知方法通過直接化學合成來制備本發明的分離的核酸(參見例如 Ausubel等人，上文)。化學合成通常產生單鏈寡核苷酸，其可以通過與互補序列的雜交，或 通過使用單鏈作為模板用DNA聚合酶進行聚合，轉化成雙鏈DNA。本領域技術人員將認識 至IJ，雖然DNA的化學合成限于約100個或更多個堿基的序列，但是通過較短序列的連接可以 獲得更長的序列。通過重疊寡核苷酸的組裝來合成更長的序列在本領域中是常規的。
[0192] 本發明進一步提供了包含本發明的核酸的重組表達盒。本發明的核酸序列，例如， 編碼本發明的抗體或其抗原結合部分的cDNA或基因組序列，可以用于構建重組表達盒，該 重組表達盒可以被引入至少一個所需宿主細胞中。重組表達盒通常包含可操作地連接至轉 錄起始調控序列的本發明的多核苷酸，所述轉錄起始調控序列將指導多核苷酸在預期的宿 主細胞中轉錄。可以使用異源和非異源（即內源）啟動子來指導本發明核酸的表達。
[0193] 在一些實施方案中，可以在本發明的非異源形式的多核苷酸的合適位置中（上游、 下游或內含子中）引入用作啟動子、增強子或其他元件的分離的核酸，以上調或下調本發明 的多核苷酸的表達。例如，可以通過突變、刪除和/或置換在體內或體外改變內源性啟動 子。
[0194] 本發明還涉及包括本發明的分離的核酸分子的載體、用該重組載體遺傳工程化的 宿主細胞和如本領域中公知的那樣通過重組技術生產至少一種抗體或其抗原結合部分。參 見例如Ausubel等人，上文。可以任選將該多核苷酸接合到含有可選標記的載體上用于在 宿主中繁殖。通常，在沉淀物如磷酸鈣沉淀物中或在與帶電荷的脂質的復合物中引入質粒 載體。如果載體是病毒，可以使用合適的包裝細胞系在體外將其包裝并隨后轉導到宿主細 胞中。
[0195] DNA插入物應當可操作地與合適的啟動子連接。表達構建體將進一步含有用于 轉錄起始、終止的位點，并且在轉錄區中，含有用于翻譯的核糖體結合位點。通過構建體表 達的成熟轉錄本的編碼部分優選將包含適當位于待翻譯的mRNA末端的開始和終止密碼子 (例如UAA、UGA或UAG)上的翻譯起始，UAA和UAG優選用于哺乳動物或真核細胞的表達。
[0196] 表達載體優選但任選包括至少一個可選擇的標記。此類標記包括但不限于對真 核細胞培養具有抗性的氨甲蝶呤（MTX)、二氫葉酸還原酶（DHFR，美國專利號4, 399, 216 ; 4, 634, 665 ;4, 656, 134 ;4, 956, 288 ;5, 149, 636 和 5, 179, 017)、氨芐青霉素、新霉素 (G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶（GS，美國專利號5, 122,464 ;5, 770, 359和5, 827, 739)， 以及對于在大腸桿菌和其它細菌或原核生物中的培養的四環素或氨芐青霉素抗性基因（上 述專利經此引用全文并入本文)。用于上述宿主細胞的合適的培養基和條件在本領域中是 已知的。合適的載體對于技術人員是顯而易見的。可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介 導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其它已知方法實現將載體構建體 引入宿主細胞中。此類方法描述在本領域中，例如Ausubel,上文，第1、9、13、15、16章。
[0197] 可以以改進的形式，例如融合蛋白，來表達本發明的至少一種抗體或其抗原結合 部分，并且不僅可以包括分泌信號，而且還包括附加的異源功能區。例如，可以將附加氨基 酸(特別是帶電荷的氨基酸)區，添加至抗體或其抗原結合部分的N-端以提高純化過程或隨 后的操作和存儲過程中在宿主細胞中的穩定性和持久性。此外，可以將肽部分添加到本發 明的抗體或其抗原結合部分中以促進純化。在抗體或其至少一個片段的最終制備之前，可 以將此類區除去。此類方法描述在許多標準實驗手冊中，例如Ausubel，上文，第16、17和 18章。本領域普通技術人員可以得知可用于編碼本發明的蛋白質的核酸的表達的許多表達 系統。
[0198] 可選地，通過在含有編碼本發明的抗體或其抗原結合部分的內源DNA的宿主細胞 中啟始(通過操縱)，可以在宿主細胞中表達本發明的核酸。此類方法在本領域中是公知的， 例如如美國專利號5, 580, 734、5, 641，670、5, 733, 746和5, 733, 761中描述，其通過參考全 文并入本文。
[0199] 用于生產抗體、其特定部分或變體的說明性細胞培養物是哺乳動物細胞。哺乳動 物細胞系統通常是單層細胞的形式，盡管也可以使用哺乳動物細胞懸浮液或生物反應器。 本領域已經研發了許多能夠表達完整糖基化蛋白質的合適宿主細胞系，并且包括cos-ι (例 如 ATCCCRL1650)、C0S-7 (例如 ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如 ATCCCRL-10)、CH0 (例 如 ATCCCRL1610 )和 BSC-1 (例如 ATCCCRL-26 )細胞系、C0S-7 細胞、CH0K1SV 細胞、h印G2 細 胞、P3X63Ag8. 653、SP2/0-Agl4、293細胞、海拉細胞等等，其可以容易地獲自例如American Type Culture Collection, Manassas, Va。優選的宿主細胞包括淋巴來源的細胞，例如骨髓 瘤和淋巴瘤細胞。特別優選的宿主細胞是CH0K1 (ATCC:CRL-9618)或CH0K1SV (例如Lonza Biologies)。
[0200] 用于這些細胞的表達載體包括一個或多個以下的表達控制序列，例如但不限于， 復制起點；啟動子(例如，晚期或早期SV40啟動子，CMV啟動子；美國專利號5, 168, 062 ; 5,385,839)，HSVtk啟動子，pgk啟動子(磷酸甘油酸激酶）啟動子，EF-la啟動子(美國專 利號5, 266, 491)，至少一種人免疫球蛋白啟動子；增強子，和/或加工信息位點，如核糖體 結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點（例如，SV40大TAgpolyA添加位點）和轉錄終止 子序列。參見例如Ausubel等人，上文。用于生產本發明的核酸或蛋白質的其它細胞是已 知的和/或可獲自例如美國典型培養物中心的細胞系和雜交瘤目錄(WWW. atcc. org)或其 它已知或商業來源。
[0201] 使用真核宿主細胞時，通常將聚腺苷酸化或轉錄終止子序列參入到該載體 中。終止子序列的一個實例是來自牛生長激素基因的聚腺苷酸化序列。還可以包含 用于精確剪接轉錄本的序列。剪接序列的實例是來自SV40的VP1內含子（Sprague等 人，1983JVir 〇145773-81)。此外，如本領域已知的那樣，可以將控制宿主細胞中復制的基因 序列參入到載體中。
[0202] 如將要看到的那樣，本說明書使用術語" ％相同"來描述大量序列。要理解的是，術 語"％相同"指的是在特定區的兩個序列的比較中，兩個序列在相同位置具有特定數目的相 同殘基。同一性水平可以使用具有缺省參數的CLUSTALW來確定。
[0203] 還應當指出的是，該序列與比較序列"至少95%相同"。在某些實施方案中，優選該 序列與比較序列至少96%或至少97%或至少98%或至少99%相同。
[0204] 本文中所用的與雜交條件相關的術語"中等嚴格"指的是在2XSSC緩沖液， 0. l%(w/v)SDS中在45°C至65°C溫度下或等價條件下進行的雜交和/或洗滌。本文中所用 的與雜交條件相關的術語"高度嚴格"指的是在0. 1XSSC緩沖液，0. l%(w/v)SDS或更低鹽 濃度中并在至少65 °C的溫度下或等價條件下進行的雜交和/或洗滌。本文中提到特定水平 的嚴格性包括使用本領域技術人員已知的除SSC之外的洗滌/雜交溶液的等價條件。例如， 計算雙鏈核酸的鏈分解時的溫度(也稱為熔融溫度，或Tm)的方法在本領域是已知的。類似 于(例如在5°C內或在10°C內）或等于核酸的Tm的溫度被認為是高度嚴格的。中等嚴格性 被認為在核酸的計算Tm的10°C至20°C內或10°C至15°C內。
[0205] 在整個說明書中，詞語"包含"（或變形如"comprises"或"comprising"）將理解 為意味著包括所述要素、整體（integer)或步驟，或要素、整體或步驟的組，但不排除任何其 它要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組。
[0206] 本說明書中提及的所有出版物經此引入并入本文。本說明書中已經包括的文獻、 法案、材料、裝置、論文等等的任何討論僅是用于提供本
【發明內容】
的目的。并未視為允許這 些內容的任一或全部構成現有技術基礎的一部分或者是本發明相關領域中的公知常識，如 在本申請的每個權利要求的 優先權日:之前，其存在于澳大利亞或別處。
[0207] 必須注意，如本說明書中所用的單數形式"一個"、"一種"和"該"包括復數指代物， 除非上下文另行明確指出。因此，例如，"一個"的提法包括單個以及兩個或多個；"一種"的 提法包括單種以及兩種或多種；"該"的提法包括單個以及兩個或多個，等等。
[0208] 已經概括地描述了本發明，通過參考下列實施例將更容易理解本發明，下列實施 例以說明的方式提供，且不是限制性的。
[0209] 本發明的實施例
[0210] 一般方法
[0211] HEK293/pTT5 表達系統
[0212] 對于涉及HEK293E/pTT5表達系統的所有轉染，HEK293E細胞在完全細胞生長介 質（1 升的 F17 培養基（Invitrogen)，9 毫升的 PluronicF68 (Invitrogen)，含有 20%(w/v) TryptoneNI (Organotechnie)和 50 μ L/100mL 培養液的 Geneticin (50mg/mL, Invitrogen) 的2mMGlutamine)中培養。在轉染之前的那天，通過離心采集細胞并重新懸浮在不含 Geneticin的新鮮培養基中。第二天，將DNA與市售轉染試劑混合，并將該DNA轉染混合物 逐滴添加到培養物中。在沒有Geneticin的情況下將培養物在37°C、5%C02和120rpm下培 養整夜。第二天，每500毫升培養物添加12. 5毫升的Tryptone和250微升的Geneticin。 該培養物在37°C、5%C02和120rpm下培養七天，隨后收集上清液并純化。
[0213] CDld/P2M 蛋白質
[0214] 使用與編碼β2Μ的DNA表達構建體（SEQ ID N0:20)共轉染的、編碼具有位于HIS 標簽的C端（SEQ ID N0:19)的CDld胞外域的DNA表達構建體，在哺乳動物的HEK293E/pTT5 表達系統中生產人⑶Id/ β 2M。通過2000g下離心10分鐘采集含有分泌的⑶Id/ β 2M蛋白 質的培養物上清液以除去細胞。使用His Trap TM HP柱（GE Healthcare)經His8親和標 簽由該上清液提純該CDld/β 2M蛋白質復合物。洗脫的蛋白質用HiL〇adl6/60Superdex200 制備級柱（GEHealthcare)緩沖交換到PBS中，并在HiLoad26/60Superdex200制備級柱 (GE Healthcare)上通過凝膠過濾分離?50kDa的級份。以類似方式單獨制造人β 2M并 純化。采取類似的純化方法純化其它物種的CDld (例如小鼠 CDld)和CDld的合成構建體 (如 hCDldmu 和 mCDldmu)。
[0215] 為了確定食蟹猴⑶Id的序列，從Biochain獲得來自猴脾臟的cDNA。下列底物用 于擴增基于獼猴 CDld mRNA 的 CDld DNA (PubMed 登錄號：NM_001033114):
[0216] FI-GTGCCTGCTGTTTCTGCTG (SEQ ID NO:120)
[0217] R1-TGCCCTGATAGGAAGTTTGC (SEQ ID NO:121)
[0218] 建立擴增了 lkbDNA產物的PCR。使用M13正向與反向引物將該DNA連接到 pGEM-TEasy (Promega)中并測序。該序列與稱猴⑶Id (UniProt登錄號：Q4AD67)的序列 比對并發現是相同的。隨后合成該基因序列，添加 C端HIS標簽，亞克隆到pTT5載體中并 使用該ΗΕΚ-293Ε/ρΤΤ5系統表達。使用Ni層析經引入的HIS標簽純化該蛋白質。
[0219] 對于噬菌體展示試驗，使用EZ-linkSulfo-NHS-LC-生物素試劑盒（Pierce)以3:1 的biotin:⑶Id/β 2M比率將重組人⑶Id/β 2M生物素化。使用具有3. 5kDa分子量篩截 的Slide-A-Lyzer透析盒通過在PBS中的透析從蛋白質制劑中除去游離生物素。對于活動 (campaign) 2,也如上所述制備生物素化重組食蟹猴⑶Id/ β 2M。
[0220] 表達抗體的載體的構建
[0221] 表達具有人恒定區(人IgG4重鏈CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域）（例如在S228P處 具有置換的NCBI登錄號P01861)的VH氨基酸鏈。這可以通過將氨基酸序列反向翻譯為 DNA序列并隨后重新合成和組裝合成的寡核苷酸來實現。在基因合成后，將整個序列亞克隆 到PTT5重鏈載體的多個克隆位點中（Durocher, Y.等人，2002, NucleicAcidsRes, 30, E9)。 通過將該序列亞克隆到pTT5輕鏈載體的多個克隆位點中，表達具有人kappa或lambda輕 鏈恒定區(如NCBI登錄號AAI10395和C6KXN3)的VL氨基酸鏈。
[0222] 抗體的表達和純化
[0223] 將重鏈和輕鏈DNA載體共轉染到HEK293/pTT5表達系統中并培養七天。在裝載到 HiTrapProteinA柱（5毫升，GEHealthcare)上之前將獲自這些轉染的上清液調節至ρΗ7· 4。 該柱用50毫升的1XPBS (ρΗ7. 4)洗滌。使用0. 1Μ檸檬酸ρΗ2. 5進行洗脫。洗脫的抗體用 Zeba脫鹽柱（Pierce)脫鹽到1XPBS (ρΗ7·4)中。該抗體用SDS-PAGE分析。抗體濃度使用 BCA測定試劑盒（Pierce)測定。
[0224] 實施例1--生成抗⑶Id抗體
[0225] 噬菌體展示
[0226] 從首次用于試驗的噬菌粒文庫中分離與人和食蟹猴CDld/ β 2M結合的FAbs。
[0227] 在兩次淘選"活動"（即具有不同試劑或淘選條件的分離的噬菌體展示試驗）過程 中從噬菌體展示文庫中分離抗⑶Id/ β 2MFAbs。一般試驗規程遵循Marks等人概述的方法 (Marks, J. D. &Bradbury, A. , 2004, MethodsMolBiol, 248, 161-76)〇
[0228] 各噬菌體展示活動包含三輪淘選。對每一輪，通過與封閉緩沖液(在磷酸鹽緩沖鹽 水中的5%脫脂奶，pH7. 4) 1:1混合并在室溫下培育1小時，將?IX 1013噬菌體粒子封閉。 封閉的噬菌體文庫隨后通過用100微升鏈霉親和素偶聯的Dynabead (Invitrogen)培育45 分鐘來預排除鏈霉親和素結合劑，將該鏈霉親和素偶聯的Dynabead如對文庫所述進行封 閉。在培育步驟后將該珠粒（以及連接于其上的鏈霉親和素結合劑）丟棄。
[0229] 通過捕獲至鏈霉親和素偶聯的Dynabead (Invitrogen)表面來制備重組⑶Id/ β2Μ抗原用于淘選。為此，10-100皮摩爾的生物素化⑶Id/β2Μ用100微升珠粒在室溫下 培育45分鐘。將所得CDld/ β 2Μ-珠粒復合物用PBS洗滌以除去游離的CDld/ β 2Μ并隨即 用于隨后的淘選反應。
[0230] 通過將封閉的和預排除的文庫與該⑶Id/ β 2Μ-珠粒復合物在1. 5毫升微量離心 管中混合并在室溫下旋轉2小時來進行文庫淘選。用一系列洗滌除去非特異性結合的噬菌 體。每次洗滌包括用磁架將珠粒復合物由溶液中牽引到管壁上，吸取上清液，并隨后將珠粒 再次懸浮在新鮮的洗滌緩沖液中。該洗滌用PBS洗滌緩沖液(含有0. 5%脫脂奶的PBS)或 PBS-T洗滌緩沖液(含有0. 05%吐溫20 (Sigma)和0. 5%脫脂奶的PBS)重復多次。通過用 〇. 5毫升的100mM三乙胺（TEA)(Merck)在室溫下培育20分鐘，將洗滌過程后保持結合的噬 菌體從⑶Id/ β 2M-珠粒復合物中洗脫。通過添加0. 25毫升的lMTris-HClpH7. 4 (Sigma) 來中和洗脫的"輸出"噬菌體。
[0231] 在第一和第二輪淘選結束時，將該輸出噬菌體添加到10毫升指數增長的TG1 大腸桿菌(酵母-胰胨（YT)生長培養基）的培養物中，并通過在37°C下在無搖振的情況 下培育30分鐘并隨后在250rpm的搖振下30分鐘以感染該細胞。將編碼該噬菌體展 示輸出的噬菌粒隨后根據標準試驗計劃再活化（rescued)作為噬菌體粒子（Marks, J. D.&Bradbury，A.，2004, Methods Mol Biol, 248, 161-76)。在第三輪淘選結束時，用輸出噬 菌體感染該TG1細胞，但是細胞以足夠的稀釋度在固體YT生長培養基(補充有2%的葡萄糖 和100微克/毫升的羧芐青霉素）上鋪板以制備離散的大腸桿菌菌落。這些菌落用于接種 1毫升液體培養物以允許表達用于篩選試驗的FAb片段。
[0232] 用于⑶Id結合的基于ELISA的篩選
[0233] 各單獨的大腸桿菌菌落用于表達FAb，篩選該FAb的⑶Id/ β 2M結合活性。將菌 落接種到96孔深孔板（Costar)中的1毫升ΥΤ起子培養物(補充有100微克/毫升的羧芐 青霉素和2%的葡萄糖)并在以650rpm搖振的情況下在30°C下培育整夜。這些起子培養物 以1:50稀釋為1毫升表達培養物(僅用100微克/毫升的羧芐青霉素補充的YT)并生長至 600nm下0. 8-1. 0的光學密度。通過添加異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷至ImM的最終濃 度來誘導FAb表達。培養物在20°C下培育16小時。
[0234] 通過離心（2500g，10分鐘）采集細胞并進行周質提取來制備FAb樣品。將細胞 聚合體再懸浮于75微升提取緩沖液（30mM Tris-HCl，pH8.0，lmM EDTA，20%蔗糖）中并 以lOOOrpm在4°C下搖振10分鐘。通過添加225微升的H20,在lOOOrpm下搖振1小時 并通過在2500g下離心10分鐘以澄清提取物，由此完成提取物制備。將上清液回收，經 AcropreplOOkDa分子量篩截板（Pall Corporation)過濾并在4°C下儲存直到下一次試驗 需要的時候。
[0235] 為了通過ELISA篩選由噬菌體展示產生的潛在人⑶Id-結合劑，將人⑶Id/β 2M (如上所述在ΗΕΚ293Ε細胞中制得并生物素化）以1微克/毫升捕獲在涂布鏈霉親和素的 ELISA板（Pierce)上。隨后洗滌該板并將單獨的FAb樣品(如上所述制備)添加到ELISA板 上的單個孔中。讓FAb在室溫下結合捕獲的⑶Id/β 2M兩小時，隨后用PBS-T洗滌三次和 用PBS洗滌三次。使用針對融合到FAb重鏈C端的V5親和標簽（Sigma)的HRP-綴合抗體 檢測結合的FAb。檢測抗體在室溫下培育1.5小時。洗滌該板以除去未結合的抗體，并通 過用50微升3, 3'，5, 5'-四甲基聯苯胺（KPL)培育并用50 μ L1MHC1猝滅以顯現測定信號。 測定信號使用酶標儀（Bio-Tek)在A450nm下讀數。結果表示為原始A450nm值，其中任何 大于平均測定背景2倍的信號定義為"陽性"。
[0236] 在后面的測定中，制備單獨涂布未生物素化的人⑶Id/β 2M、食蟹猴⑶Id/β 2M或 的β2Μ的MaxisorpELISA板（Nunc)以檢測FAb樣品的結合。洗漆和檢測步驟如上所述。
[0237] 對CD 1 d/ β 2M結合的FAb的SPR基篩選
[0238] 使用BIAcore4000Biosensor (GEHealthcare)以單一濃度分析物通過測定進 行SPR篩選。使用標準胺偶聯化學在pH5. 5下在四個流動池各個的點1、2、4和5上將約 10, 000RU 的抗 V5 抗體（Invitrogencat#R960CUS)固定在 CM5Series S Sensor 芯片上，留 下點3未修飾。所用運行緩沖液是HBS-EP+ (GE Healthcare)，所有相互作用在25°C下測 得，并將數據收集速率設定為10Hz。在各流動池的點1或5上以10微升/分鐘的流速捕獲 100秒(通常捕獲約200RU的FAb)之前，將V5-標記的FAbs的粗周質制劑在運行緩沖液中 稀釋兩倍。在短暫的穩定期后，人或食蟹猴CDld/ β 2M同時以30微升/分鐘的流速在所有 四個流動池的所有點上通過100秒。在使用lOOmM磷酸的30秒脈沖再生回抗V5抗體之前 測量相互作用的解離100秒。產生的傳感圖參考每個流動池的相鄰抗V5抗體點，并用1:1 朗繆爾方程擬合以確定ka、kd和KD。
[0239] 噬菌體展示活動的結果
[0240] 通過SPR測定對于與人和食蟹猴⑶Id/ β 2M的結合篩選了超過4400個克隆。發 現總計51種FAbs具有對人和食蟹猴CDld的高選擇性。
[0241] 實施例2--證實IgG結合CDld
[0242] 將人-食蟹猴⑶Id反應性FAb轉化為IgG4格式，將其如一般方法中所述表達并 純化。使用實施例1中描述的改進版本的測定通過ELISA和SPR測試純化抗體與人和食蟹 猴⑶Id的結合。簡而言之，對于ELISA測定，用合適的抗原以1微克/毫升涂布Maxisorp ELISA板（Nunc)。隨后洗滌該板，并將純化的IgG樣品添加到ELISA板的單個孔中。讓IgG 與捕獲的⑶Id/β 2M在室溫下結合一小時，并隨后用PBS-T洗滌三次和用PBS洗滌三次。使 用針對人Fc (Sigma)的HRP-綴合抗體檢測結合的IgG。檢測抗體在室溫下培育30分鐘。 洗滌該板以除去未結合的抗體，并通過用50微升3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺（KPL)培育并 用50μ?1Μ HC1猝滅以顯現測定信號。測定信號使用酶標儀（Bio-Tek)在A450nm下讀數。 結果表示為原始A450nm值，其中任何大于平均測定背景2倍的信號定義為"陽性"。
[0243] 還使用Biacore T100生物傳感器（GE Healthcare)對純化抗體進行全動力學表 征（full kinetic)。在Biacore T100生物傳感器的流動池（FC)1和FC2 (或者FC3和 FC4)中使用標準胺偶聯化學將約10, 000RU的抗人IgG (Invitrogen cat#H10500)固定在 CM5Series S Sensor芯片上。所用運行緩沖液是HBS-EP+ (GE Healthcare)，相互作用在 25°C下測得。將峰值純化IgG在運行緩沖液中稀釋至10nM，并以10微升/分鐘的流速在 FC2 (或者FC4)上捕獲以捕獲50-80RU的IgG。在適當的穩定期后，該目標一人或食蟹猴 CDld/ β 2M在33. 3nM至0. 4nM (使用三倍稀釋的CDld/ β 2M)濃度下以60微升/分鐘的流 速通過FC1和FC2 (或FC3和FC4)。用于締合的接觸時間為120秒，對于最高濃度在20分 鐘測得解離，對該系列中所有其它濃度在240秒測得解離。從FC1中減去來自FC2的傳感 圖數據，緩沖液僅為對照物。用1:1朗繆爾方程擬合曲線以生成ka、kd和KD值(表1)。
[0244] 表1 :噬菌體展示抗體的ELISA和SPR結果
[0245]
【權利要求】
1. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體競爭與⑶Id的結合。
2. 如權利要求1所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原 結合部分與抗體401. 11. 158競爭與⑶Id的結合。
3. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分結合與選自401. 11和402. 8的至少一種抗體所結合的表位相同的⑶Id表位。
4. 如權利要求3所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位包含SEQ ID NO: 116 的殘基 141 至 143。
5. 如權利要求3或4所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位包含SEQ ID NO: 116的殘基87至93和141至143。
6. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分包含具有選自 SEQ ID 勵1、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、40、41、42、43、44和45的 序列和至少95%與之相同的序列的V H域。
7. 如權利要求6所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述VH域的所述序列是 SEQIDN0:148*SEQIDN0:150。
8. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分包含具有選自SEQ ID N02、4、6、46、49和62的序列和至少95%與之相同的序列的VL 域。
9. 如權利要求8所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述VL域的序列是SEQ ID NO:149 或 SEQ ID NO:4。
10. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分包含VH域，所述V H域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述 CDR1 序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID N0:125)。
11. 如權利要求10所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述CDR3序列是 DMCSSSGCPDGYFDS(SEQ ID N0:126)、DLCSSGGCPEGYFDS(SEQ ID N0:152)、DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID N0:153)、DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID N0:154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID N0:127)、 GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID NO:128),GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO:155),GEIYDFYKSYMDV (SEQ IDN0:156)、GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)*GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。
12. 如權利要求10或11所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述CDR2序 列是 TIIWNSAIIGYADSVKG (SEQ ID N0:131)、EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:132)、 EINPSGSTNYNPSLKS(SEQIDN0:133)*EINHAGSTNYNPSLKS(SEQIDN0:134)。
13. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分包含VH域，所述V H域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述 CDR1 序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID N0:136)。
14. 如權利要求13所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述CDR3序列是 DMCSSSGCPDGYFDS(SEQ ID N0:126)、DLCSSGGCPEGYFDS(SEQ ID N0:152)、DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID N0:153)、DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID N0:154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID N0:127)、 GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID NO:128)、GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO:155)、GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID N0:156)、GEIYDFWKSYLDV (SEQ ID N0:129)或 GEIYDFYNSYMDV (SEQ ID N0:130)。
15. 如權利要求13或14所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述CDR2序列是 IWNSAI(SEQIDN0:137)、NHSGS(SEQIDN0:138)、NPSGS(SEQIDN0:139)*NHAGS(SEQ ID NO:140)。
16. 結合人CDld的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗原結合 部分包含八域，所述八域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述CDR1序列是RASQHISSWLA(SEQIDN0:141)或ASSSGAVSSGNFPN(SEQID NO:142)。
17. 如權利要求16所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述CDR3序列是 QQANRFPLT(SEQIDN0:143)*LLYFGDTQLGV(SEQIDN0:144)。
18. 如權利要求16或17所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述CDR2序列是 AASSLQS(SEQIDN0:145)*SASNKHS(SEQIDN0:146)。
19. 如權利要求6至18中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分包含選自以下的VH和VL序列對：SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、 SEQIDN0:23和SEQIDN0:46、SEQIDN0:24和SEQIDN0:47、SEQIDN0:5和SEQID N0:6、SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:26和 SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:27和SEQ IDN0:50、SEQIDN0:28和SEQIDN0:51、SEQIDN0:29和SEQIDN0:52、SEQIDN0:30 和 SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:34 和 SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:58、 SEQ ID NO :36 和 SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :37 和 SEQ IDNO :60、SEQ ID NO :38 和 SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:40 和 SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:41 和 SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:42 和 SEQIDN0:64、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4、SEQIDN0:7和SEQIDN0:4、SEQIDN0:8和 SEQIDN0:4、SEQIDN0:9和SEQIDN0:4、SEQIDN0:43和SEQIDN0:65、SEQIDN0:44 和 SEQ ID N0:66 與 SEQ ID N0:45 和 SEQ ID N0:67。
20. 如權利要求1至19中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分結合具有如使用基于細胞的效價測定測得為〇· 5ng/ml至20ng/ ml 的 EC50 的人 CDld。
21. 如權利要求1至20中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分包含人kappa鏈恒定區。
22. 如權利要求1至21中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分包含人lambda鏈恒定區。
23. 如權利要求1至22中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分包含IgGl或IgG4恒定區。
24. 如權利要求23所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離的抗體或其抗 原結合部分含有包含S228P突變的IgG4恒定區。
25. 如權利要求1至24中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分是抗體。
26. 如權利要求1至24中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述分離 的抗體或其抗原結合部分是Fab、F (ab) 2、scFv或結構域抗體。
27. 如權利要求1至26中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中修飾所述 抗體或其抗原結合部分以調節功能特性，所述功能特性選自抗體依賴性細胞毒性、補體依 賴性細胞毒性、血清半衰期、生物分布和與Fc受體結合。
28. 組合物，其包含如權利要求1至26中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分， 和藥學上可接受的載體。
29. 分離的DNA分子，其編碼如權利要求1至26任一項所述的分離的抗體或其抗原結 合部分。
30. 如權利要求29所述的分離的DNA分子，其中所述DNA分子的序列選自SEQ ID NO. 10至18和68至115或至少95%與之相同的序列或在中等至高度嚴格條件下與之雜交 的序列。
31. 轉化細胞，其產生如權利要求1至26中任一項所述的抗體或其抗原結合部分。
32. 如權利要求31所述的轉化細胞，其中所述細胞用如權利要求29或30所述的DNA 分子轉化。
33. 在人類對象中治療涉及NKT細胞效應子功能的病況的方法，其包括向所述對象施 用如權利要求1至27中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分或如權利要求28所述 的組合物。
34. 如權利要求33所述的方法，其中所述病況選自牛皮癬、潰瘍性結腸炎、原發性膽汁 性肝硬變、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫性肝炎、缺血再灌注損傷、與鐮狀細 胞病相關的肺部炎癥或機能障礙、和哮喘。
35. 如權利要求1至27中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分用于制備用于治 療涉及NKT細胞效應子功能的病況的藥物的用途。
36. 檢測樣品中存在人或食蟹猴CDld的方法，所述方法包括使懷疑含有CDld的樣品與 如權利要求1至27中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，在允許所述抗體或其抗 原結合部分結合CDld的條件下接觸，以形成復合物并檢測所述樣品中所述復合物的存在。
37. 如權利要求36所述的方法，其中樣品中的所述CDld是細胞膜結合的CDld。
38. 如權利要求1至27中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其用于治療涉 及NKT細胞效應子功能的病況。
39. 檢測細胞樣品中人CDld陽性細胞的存在的方法，所述方法包括將細胞群體與如權 利要求1至27中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分接觸，以允許所述抗體或其抗 原結合部分結合CDld陽性細胞以形成復合物，并檢測所述抗體或其抗原結合部分-細胞復 合物的存在。
40. 如權利要求39所述的方法，其中所述細胞樣品是外周血樣品或細胞系樣品。
41. 從多種CDld結合蛋白中選擇特異性結合人CDld的CDld結合蛋白的方法，所述 ⑶Id結合蛋白與選自401. 1U402. 8和401. 11. 158的至少一種抗體競爭在⑶Id上的結合， 所述方法包括： 在足以允許CDld結合蛋白結合所述突變蛋白以形成CDld結合蛋白-人CDld突變蛋 白復合物和允許排除多種沒有結合所述人CD 1 d突變蛋白的CD 1 d結合蛋白的條件下，使所 述多種⑶Id結合蛋白接觸人⑶Id突變蛋白，在所述人⑶Id突變蛋白中SEQ ID NO: 116的 位置87至93和141至143的氨基酸已經被這些位置處的相應的小鼠氨基酸取代，并且從 所述排除的多種CDld結合蛋白中收集沒有結合人CDld突變蛋白的CDld結合蛋白，其中所 述收集的⑶Id結合蛋白特異性結合人⑶Id并與選自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少 一種抗體競爭在⑶Id上的結合。
42.從多種CDld結合蛋白中選擇特異性結合人CDld的CDld結合蛋白的方法，所述方 法包括： 在足以允許⑶Id結合蛋白結合h⑶ldmu以形成⑶Id結合蛋白-h⑶ldmu復合物和允 許排除多種沒有結合hCDldmu的CDld結合蛋白的條件下，使所述多種CDld結合蛋白與其 中位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143處的氨基酸已經被這些位置 處的相應小鼠序列替代的h⑶ldmu (SEQIDNO: 119)接觸，并從所述排除的多種⑶Id結合蛋 白中收集沒有結合至所述hCDldmu的CDld結合蛋白，其中所述收集的CDld結合蛋白特異 性結合人CDld(SEQIDNO:116)或mCDldhu(SEQIDNO:118)。
【文檔編號】C07K16/28GK104144700SQ201280050432
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2012年10月15日 優先權日:2011年10月14日
【發明者】J.K.納姆比亞爾, L.D.波頓, A.克拉克, A.J.波, D.塔姆瓦基斯, G.科普斯達斯, A.G.多伊勒, M.波拉德, H.穆斯塔發 申請人:特瓦制藥澳大利亞私人有限公司