一種抗人血管內皮生長因子人源化抗體可變區編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗體可變區編碼基因；基于該編碼基因，靶抗體的表達水平顯著提高。體外生物學功能評價結果顯示，基于該抗體可變區編碼基因獲得的靶抗體可以特異性識別人VEGF抗原；該抗體可以顯著抑制腫瘤組織新生血管形成，從而抑制腫瘤生長。本發明還公開了上述抗體的制備方法。
【專利說明】-種抗人血管內皮生長因子人源化抗體可變區編碼基因及 其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抗人血管內皮生長因子人源化抗體可變區編碼基因及其應用。通 過優化密碼子，獲得了一種抗人血管內皮生長因子人源化抗體的可變區編碼基因。應用分 子生物學技術全合成了基因；經過表達、純化，應用免疫學以及細胞生物學等實驗對靶抗體 的表達量及生物學功能進行了評價。
【背景技術】
[0002] 人血管內皮生長因子（VEGF)是正常和異常血管新生的重要調節因子，在生理和 病理性血管新生中起重要作用。其主要作用機制是作為一種促內皮細胞分裂素，促進血管 內皮細胞分裂、增殖以及血管生成。VEGF參與了腫瘤發生和發展整個過程，腫瘤組織快速生 長，導致營養供應不足，在缺氧狀態下，腫瘤細胞表達VEGF顯著增加，VEGF局部濃度的升高 可以促進新生血管的形成，促進腫瘤的發生發展。研究表明，抑制VEGF活性可以有效阻斷 腫瘤組織內血管生成，抑制腫瘤生長，具有重要的臨床治療意義。
[0003] 抗人血管內皮生長因子（VEGF)人源化抗體一阿瓦斯汀（Avastin)，化學名"貝伐 單抗"，可以特異性抑制能夠刺激新血管形成的"血管內皮生長因子（VEGF) "，致使腫瘤組織 無法獲得所需的血液、氧和其他養分而最終"餓死"，達到抗癌功效。800多名腫瘤已發生轉 移的結腸\直腸癌患者進行的臨床試驗發現，同時接受阿瓦斯丁和化療治療的患者，與只 接受化療的患者相比平均存活期要長5個月左右。美國FDA于2004年2月26日批準阿瓦 斯汀上市。目前阿瓦斯丁已經應用于多種癌癥，包括直結腸癌、肺癌、膠質瘤、腎癌、和卵巢 癌。
[0004] 抗體臨床應用劑量較大，每個療程的用量可以達到lg。目前世界上抗體的產能遠 低于需求量，抗體表達水平嚴重制約了抗體的應用。抗體的產量除了受制于培養規模、生 產工藝以及純化工藝等因素外，從很大程度上依賴于抗體基因在哺乳動物細胞內的表達水 平。
[0005] 本研究在Avastin抗體的基礎上，通過計算機輔助分析以及分子生物學技術，設 計獲得了一種新的抗體可變區編碼基因，其編碼的抗體可變區氨基酸序列與Avastin相 同，但目標抗體在哺乳動物細胞中的表達水平遠高于Avastin;進一步免疫學以及細胞生 物學等實驗結果顯示，新基因編碼的抗體序列具有良好的生物學活性。
【發明內容】
[0006] 本發明公布了一組新的抗體可變區編碼基因，序列表中序列1所示基因序列為輕 鏈可變區編碼基因；序列2所示基因序列為重鏈可變區編碼基因。
[0007] 本發明公布的抗體可變區編碼基因的一個特征在于，該抗體在哺乳動物細胞中的 表達水平要明顯優于Avast in。
[0008] 本發明公布的抗體可變區編碼基因的一個特征是，所編碼抗體可以特異性識別結 合靶抗原VEGF。
[0009] 本發明公布的抗體可變區編碼基因的一個特征是，所編碼抗體可以有效地血管內 皮細胞生長。
[0010] 本發明公布的抗體可變區編碼基因的一個特征是，所編碼抗體可以有效地抑制腫 瘤組織血管生成。
[0011] 本發明公布的抗體可變區編碼基因的一個特征是，所編碼抗體可以抑制腫瘤生 長。
[0012] 本發明公布的抗體可變區編碼基因可用于生產治療腫瘤藥物的應用前景。
[0013] 本發明還公布了該抗體可變區編碼基因制備方法，具體實施過程如下：
[0014] 1)利用計算機輔助分析，獲得新抗體基因；
[0015] 2)利用全合成PCR技術合成抗體基因；
[0016] 3)抗體的表達及鑒定；
[0017] 4)抗體生物學活性鑒定。
[0018] 下面參照上述步驟詳細描述實施過程。設計及制備本發明的方法僅僅是說明相關 方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。
[0019] 1)利用計算機輔助分析，獲得新抗體基因
[0020] 根據抗體氨基酸序列，選擇在哺乳動物細胞中常用的密碼子進行反向翻譯，通過 生物信息學技術合理優化，增加基因的穩定性及其在哺乳動物細胞的表達水平，獲得相應 的抗體基因。
[0021] 2)利用全合成PCR技術合成抗體基因；
[0022] 根據獲得的抗體基因。利用基因全合成PCR技術，設計相應的引物，通過重疊 PCR 的方法獲得全長基因；克隆入克隆載體，進行序列測定。
[0023] 3)抗體的表達及鑒定
[0024] a)抗體的表達：將抗體基因構建至真核表達載體中，通過脂質體轉染、電轉等方 法瞬時轉染真核表達細胞，培養足夠長時候后收獲上清，其中含有表達的目的抗體。
[0025] b)雙夾心酶聯免疫吸附實驗（ELISA):以合適的抗體包被后作為捕獲抗體，經過 封閉后，加入待測樣品以及標準樣品進行捕獲反應；隨后利用合適的酶標二抗進行顯色反 應，測定樣品中目的蛋白的含量。
[0026] c)SDS_PAGE :依據目的蛋白的大小配制合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，根據實驗需 要制備還原電泳樣品或非還原電泳樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白；經過考馬斯 亮藍染色后，確定目的蛋白分子量。
[0027] 4)抗VEGF抗體生物學活性鑒定
[0028] a)抗體識別活性鑒定：以合適濃度的VEGF包被，經過封閉后，加入待測樣品以及 標準樣品進行結合反應；隨后利用合適的酶標二抗顯色；測定樣品中目標抗體識別抗原能 力。
[0029] b)抗體體外抑制血管內皮細胞增殖：分離培養血管內皮細胞，加入待測抗體后， 觀測血管內皮細胞增殖生長情況。
[0030] c)抗體抑制腫瘤生長：利用腫瘤細胞系在裸鼠體內建立荷瘤動物模型，定期給予 目標抗體進行治療，觀察腫瘤生長速度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1抗體可變區基因的電泳分析。其中泳道1為核酸標準分子量DL2000 ;泳道2 為輕鏈可變區基因；泳道3為重鏈可變區基因。
[0032] 圖2抗體平均表達量比較。
[0033] 圖3SDS-PAGE分析靶抗體的分子量。泳道1為靶抗體；泳道2為Avastin ;泳道3 為人IgG ;M表示標準蛋白分子量Marker。
[0034] 圖4靶抗體特異性識別抗原分析
[0035] 圖5靶抗體體外抑制血管內皮細胞增殖
[0036] 圖6靶抗體體內抑制腫瘤生長
[0037] 實施例一抗VEGF抗體MIL60合理設計及基因合成
[0038] 一、材料：
[0039] 引物設計軟件為biosun軟件，引物由上海英駿生物技術有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase 為 TAKARA 公司產品；dNTP 為 TAKARA 公司產品；pGEM-T Easy vector system為Invitrogen公司產品；T4DNA連接酶為NEB公司產品；基因測序由北京諾賽基因 組研究中心有限公司完成；其他相關試劑均為市購。
[0040] 二、方法結果
[0041] 1、抗體MIL60的基因獲得
[0042] 根據Avastin抗體的氨基酸序列，選擇在哺乳動物細胞中使用頻率較高的密碼 子，進行反向翻譯，通過生物信息學技術合理優化，增加基因的穩定性及其在哺乳動物細胞 的表達水平，獲得抗體的輕鏈可變區基因序列（序列1)及重鏈可變區基因序列（序列2)。 根據實施例2中構建抗體真核表達載體需要，在抗體輕鏈可變區基因5'端及3'端分別引 入EcoR V和Xho I酶切位點；在抗體重鏈鏈可變區基因5'端及3'端分別引入Pvu II和 BstE II酶切位點。
[0043] 2、引物設計
[0044] 根據基因全合成的原理，利用計算機輔助設計軟件，設計引物，考慮引物的二級結 構、GC含量等相關參數。每條基因設計10條引物，分別編號為PI、P2、P3、P4、P5、P6、P7、 P8、P9及P10,用于基因全合成。
[0045] 3、全基因合成
[0046] 1)引物合成后以無菌水稀釋，方法如下：
[0047] a)取引物管12000RPM離心2mins，引物按IOOuM的濃度稀釋，-20°C保存；
[0048] b)取少量引物P2?P9混合成終濃度為IOuM作為使用液；
[0049] c)取少量引物Pl和PlO混合稀釋成終濃度為IOuM作為使用液P1/P10 ;
[0050] 2)基因全合成，米用Pyrobest DNApolymerase，方法如下：
[0051] a)取IuL P2?P9混合引物作為模板,配制如下Overlap PCR體系：
[0052]
【權利要求】
1. 一種抗體可變區編碼基因，其中輕鏈可變區編碼基因是序列1，重鏈可變區編碼基 因是序列2。
2. 權利要求1所述抗體可變區編碼基因在抗體制備中的應用。
【文檔編號】C07K16/22GK104278038SQ201310283898
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月8日 優先權日:2013年7月8日
【發明者】楊靜, 呂明, 李新穎, 耿樹生, 郎小玲, 馮健男, 謝波, 葉培, 黎燕, 沈倍奮 申請人:北京天廣實生物技術股份有限公司, 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所