長效重組絨促性素及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了重組人絨促性素融合蛋白(Human?chorionic?gonadotrophin-Fc?fusion?protein，簡稱HCG-Fc)及其制備方法，該HCG-Fc蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包括HCGβ亞基、HCGα亞基、柔性肽接頭和人IgG?Fc變體，與現有絨促性素相比，其體內半衰期更長、生物利用度更高，可大大減少用藥次數和劑量。本發明還涉及重組HCG-Fc融合蛋白組合物在制備動物繁殖領域藥物中的用途。
【專利說明】長效重組絨促性素及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學和獸藥領域。更具體地，本發明涉及重組長效人絨促性素融合蛋白、其制備方法及應用。該融合蛋白體內半衰期顯著延長，生物利用度顯著增加，大大減少動物繁殖用藥次數和劑量。
【背景技術】
[0002]人絨促性素(Human chorionic gonadotrophin,簡稱HCG)是動物繁殖領域常用的藥物主要成分，現有上市HCG主要為人尿中提取的生化品種，可用于魚類和畜類的促排卵和催產。目前我國市場上的HCG主要為孕婦尿液中提取的產品，存在病毒污染、原料來源有限、采集困難、含量低及純化過程復雜等缺陷。另外，因檢測方法及病毒滅活技術的局限性以及一些不可預知的新致病病毒感染時有發生，并不能完全杜絕生化提取產品發生病毒污染的可能性。
[0003]相比而言，重組HCG在其純度、抗原性、安全性、無病毒感染等方面具有生化HCG產品無法比擬的優點。迄今為止，還未有重組HCG產品用于獸藥領域。HCG是一種糖基化蛋白，SDS-PAGE檢測其分子量為50KD。另外，HCG是具有兩條單鏈(α鏈和β鏈)的糖基化蛋白，鏈間以非共價鍵連接，兩條鏈的正確折疊才能保證HCG的生物活性。如何在蛋白表達和純化過程中保持兩條鏈的正常結合是一個挑戰。作為一種治療藥物，保證其生物活性，必要的條件是具有正確的三維結構和糖基化修飾。具有完善翻譯后修飾功能是哺乳動物細胞被選作大多數生物藥蛋白表達宿主的主因。其中，中國倉鼠卵巢細胞(Chinese HamsterOvary Cell，簡稱CH0)是用于真核生物外源基因表達最為成功的宿主細胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達，很多人用重組蛋白藥物已上市。與其它表達系統相比，該系統具有許多優點，如擁有完備的翻譯后加工過程，包括糖基化、羥基化，使表達的外源真核基因產物能夠保持其天然結構及活性，且使表達產物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分離純化。`
[0004]目前已有利用CHO細胞生產的人用藥物重組HCG上市，但仍然存在如下問題:首先，現有方法生產的重組HCG表達量太低，制備過程復雜，生產成本太高；其次，其半衰期短，需要頻繁注射給藥，特別是在魚類的催產過程中，頻繁的抓取親魚容易對親魚造成鱗片脫落、病毒入侵等傷害。因此，利用分子生物學和細胞培養方法，開發具有生物活性和更長半衰期的重組HCG藥物是本領域的一個挑戰。
【發明內容】
[0005]本發明旨在提供重組人絨促性素融合蛋白(Human chorionic gonadotrophin-Fcfusion protein,簡稱HCG-Fc)及其制備方法及應用，該重組HCG-Fc融合蛋白應用于動物繁殖領域，與現有生化提取產品活性類似，且具有純度高、半衰期顯著延長等特點。
[0006]本發明的一個目的是提供重組HCG-Fc融合蛋白，該融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含HCGii亞基、HCGa亞基、肽接頭(Linker，簡稱 L)和人 IgG Fe 變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc 和 vlgGlFc)，如 SEQ ID NO:2、4 和 6 所示(HCG β -HCG a -vIgG2Fc、HCG β -HCG α -vIgG4Fc、HCG β -HCG α -vlgGlFc 氨基酸序列)，優選的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 (HCG β -HCG a -vIgG2Fc)，上述融合蛋白統稱為HCG_Fc。
[0007]所述的HCGii亞基的氨基酸序列去除了完整HCGii亞基中的1_20位氨基酸殘基，即成熟HCGii亞基的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0008]所述的HCG α亞基的氨基酸殘基序列去除了完整HCG α亞基中的1_24位氨基酸殘基，即成熟HCGa亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0009]所述的肽接頭含有2-20個氨基酸殘基，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，優選的肽接頭氨基酸序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerο
[0010]所述的人IgG Fe變體包括:(I)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域；(2)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和CH3區域；(3)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgGl絞鏈區、CH2和CH3區域。優選的人IgGFc變體是，含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域。
[0011]以下具體介紹本發明的人IgG Fe變體、肽接頭功能:
[0012]IgG Fe 變體
[0013]IIgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質，它們的半衰期可高達21天，而Fe片段是IgG保持體內較長半衰期的主要原因，同時具有穩定蛋白的作用。
[0014]Fe來自免疫球蛋白的Fe區域，Fe在消滅病原體的免疫防御中具有重要作用。IgG的效應子功能由Fe介導，通`過兩種主要機制:(I)與細胞表面Fe受體(FcyRs)的結合，通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結合，引發依賴于補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3能有效的結合FcyRs0 IgG4與Fe Y Rs的結合親和力比IgGl和IgG3的低一個數量級，而IgG2與Fe Y Rs的結合低得難以測定。人IgGl和IgG3還能有效地結合Clq，并激活補體級聯反應。人IgG2對補體的固定很弱，而IgG4表現極端缺乏激活補體級聯的能力。對于醫療用途而言，重組二聚化蛋白的Fe區域必須不會介導效應子功能而裂解或除去這些細胞。因此，HCG-Fc的Fe區域必須是非裂解性的，即在結合Fe Y Rs和Clq而觸發效應子功能方面，Fe最好是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產生HCG-L-Fc重組二聚化蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區域中的一些氨基酸突變，以減少其效應子功能。
[0015]通過分析不同種屬的IgG同種型的氨基酸序列，發現CH2區域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結合中起作用，而與Clq結合至關重要的部分位于人IgG的CH2區域羧基端附近。為了減少Fe與FcyRs和Clq的結合而引發的效應子功能，本發明使用下列人IgG Fe變體(圖1):⑴IgG2Fc變體:含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域；(2) IgG4Fc變體:含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和 CH3 區域；(3) IgGlFc 變體:含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區、CH2和CH3區域。優選的人IgG Fe變體是，含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域。
[0016]上述Fe變體比天然IgG2Fc、IgG4Fc和IgGlFc表現出低得多的效應子功能，更適于制備重組HCG-Fc融合蛋白。
[0017]肽接頭
[0018]連接肽的長度對重組二聚化蛋白的活性非常重要。已有人報道了促紅細胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，與EPO單體相比，含有2個完整的EPO區域(相隔3到7個氨基酸肽接頭)的重組二聚化蛋白表現出減弱的活性(參見Qiu H等，J Biol Chem,273:11173-11176，1998)。然而，當這兩個EPO區域間的肽接頭的長度為17個氨基酸時，二聚體EPO分子的體外和體內生物活性明顯提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem, 274:24773-24778，1999 ;美國專利N0.6，187，564)。這可能解釋為重組二聚化蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能(參見Ashkenazi A等，Curr Opin inImmunol,9: 195-200,1997)。
[0019]本發明人經過長期而深入的研究，首次設計了一種獨特的絞鏈區肽接頭來降低空間位阻效應，可以制得HCG α鏈的C端與Fe變體偶聯的重組二聚化蛋白，中間有柔軟的肽接頭。此重組二聚化蛋白不僅不會導致HCG的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高HCG-Fc重組二聚化蛋白的生物活性。優選肽接頭的氨基酸殘基序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
[0020]本發明的重組HCG-Fc融合蛋白具有以下特征:該重組融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含HCGii亞基、HCGa亞基、肽接頭和人IgG Fe變體。人IgG Fe變體具有延長體內半衰期和穩定蛋白的作用，Fe變體是非裂解性的，可減少與Fe Y Rs和Clq結合而觸發的效應子功能。通過柔軟的肽接頭進行HCG α鏈的C端與Fe變體的偶聯，能夠維持、甚至提高重組HCG-Fc融合蛋白的生物活性。
[0021]本發明首次將肽接頭和人IgG Fe變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc或vlgGlFc)有序地連接到HCG中而形成新型的重組HCG-Fc融合蛋白，并首次應用于動物繁殖領域。該融合蛋白中人IgG Fe變體和肽接頭的`位置排列能維持HCG正確的空間構型，而不影響其生物活性，并可顯著延長半衰期、提高生物利用度，與現有動物繁殖用藥方案比較，可大大減少用藥次數和劑量。
[0022]本發明另一個目的是提供一種重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法包括:
[0023](I)構建編碼重組HCG-Fc融合蛋白的基因表達載體；
[0024](2)重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達；
[0025](3)高密度細胞培養重組HCG-Fc融合蛋白；
[0026](4)重組HCG-Fc融合蛋白的純化制備。
[0027]具體來說，構建編碼重組HCG-Fc蛋白的基因表達載體步驟為:采用人工合成方法獲得編碼重組HCG-Fc融合蛋白基因進行了密碼子優化的核苷酸序列(如SEQ ID NO: 1,3和5所示)，插入到哺乳動物細胞表達載體(如P⑶NA3)，獲得含有HCG-Fc目的基因表達質粒P⑶NA3-HCG-Fc (圖6)，優選的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。基因的核苷酸序列優化是基于哺乳動物宿主細胞偏愛的密碼子來選擇設計。
[0028]所述的哺乳動物細胞表達載體可采用市售的但不限于，如:p⑶NA3、pCMV / ΖΕ0、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核細胞系統表達的載體，優選，pCDNA3。
[0029]重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達步驟為:將含有HCG-Fc蛋白的表達質粒轉染到合適的哺乳動物宿主細胞，利用篩選標記篩選和擴增選擇性標記獲得穩定聞表達目的蛋白的細胞株。
[0030]所述的哺乳動物宿主細胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NSO和Sp2 / O細胞。優選，CHO細胞；更優選，已馴化適應無血清培養基中懸浮生長的DHFR(Dihydrofc)IateReductase, 二氫葉酸還原酶)缺陷型CHO細胞(簡稱CH0-DHFIT)。
[0031]所述的轉染方法包括磷酸鈣法，電轉法，脂質體轉染，優選的轉染方法是電轉法。
[0032]所述的篩選方法是先利用篩選標記進行篩選，然后用擴增選擇性標記可提高表達量并獲得穩定高表達細胞株。篩選標記是本領域內已知的任何一個合適的選擇性抗性標記，如ZEO (Zeocin,博來霉素)、G418 (氨基糖苷類抗生素)、PUR(puromycin,嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin,潮霉素)，優選的抗性基因為ZEO ;篩選標記也可為本領域內已知的任何一個突光標記基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein,綠色突光蛋白)、RFP (RedFluorescent Protein,紅色突光蛋白)，優選的突光標記基因為GFP。擴增選擇性標記是本領域內已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase,谷氨酰胺合成酶)序列，優選的擴增選擇性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶(DHFR)，無法自身合成四氫葉酸,所以必須在添加了次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺喃唳(Thymidine)和甘氨酸的培養液中才能得以存活。而通過目的基因與DHFR基因共轉染，不僅得到在不含上述添加劑的培養基上也能生長的細胞克隆，更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX (Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴增到很多的拷貝數才能生存，從而得到抗MTX細胞系；又由于與DHFR基因共轉染的目的基因傾向于同它一起整合到細胞染色體上的同一區域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴增而擴增，可得到大量表達外源蛋白的細胞克隆。
[0033]高密度細胞培養重組HCG-Fc融合蛋白的步驟為:將上述篩選到的穩定細胞株轉入搖瓶或生物反應罐進行大規模培養，特別是，本發明通過對細胞培養條件的優化，獲得高表達重組HCG-Fc融合蛋白的細胞`培養液。本發明的細胞培養方法可實現高密度細胞培養、重組蛋白質量和產量提升、重組蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。
[0034]所述的細胞培養條件的優化包括降溫培養法，具體來說，當細胞密度達到I X IO7個/ mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養直至表達產量不再增加。該方法可以提高表達蛋白的活力水平及重組蛋白的累積產量。
[0035]所述的細胞培養條件的優化方法還包括在培養基中加入特殊的添加劑，優選，在基礎培養基加入100 μ M Cu2+，feeding培養基加入2mM ManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。該方法可使重組HCG-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20 %。
[0036]重組HCG-Fc融合蛋白的純化制備步驟為:
[0037]DProteinA親和層析:離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fe片段的特性，利用親和ProteinA柱層析。
[0038]2)疏水層析柱純化:采用疏水層析柱，根據重組HCG-Fc融合蛋白的疏水性不同，進一步去除上述ProteinA純化后目標蛋白中的雜質。
[0039]所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。優選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。[0040]本發明所公開的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法可獲得表達產量高重組HCG-Fc融合蛋白。因與IgG Fe變體的偶聯，所形成的重組蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。經疏水層析進一步純化后得到的融合蛋白純度達到98%以上。此外，本發明所公布的重組HCG-Fc融合蛋白中α鏈和β鏈可正確折疊在一起，避免了 α-α 二聚體、β-β 二聚體的出現，大大簡化了純化步驟，降低了生產成本。
[0041]本發明的還一個目的是提供了一種含有長效重組HCG-Fc融合蛋白的藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發明所述的重組長效HCG-Fc融合蛋白。
[0042]具體來說，所述的藥物組合物含有有效量(如0.000001-90wt % ;較佳的
0.1-50被％;更佳的，5-40wt% )的本發明的重組長效HCG-Fc融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將有效量的本發明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
[0043]所述的藥學上可接受的載體包括(但并不限于):蔗糖、甘露醇、吐溫20 (Tween20)、蛋氨酸、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、及其組合物。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0044]本發明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述的融合蛋白的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；動物所要治療疾病的嚴重程度、動物的體重、動物的免疫狀況、給藥途徑等。
[0045]本發明的再一個目的`是重組HCG-Fc融合蛋白在動物繁殖領域中的應用。
[0046]本發明的重組HCG-Fc融合蛋白體內半衰期顯著延長、生物利用度明顯提高，從而改善了藥物動力學和藥效，與現有HCG比較，可減少注射次數和劑量，減輕動物養殖的經濟負擔。
[0047]本發明的重組HCG-Fc融合蛋白及其制備方法的優點概括如下:
[0048]1.本發明的重組HCG-Fc融合蛋白是由IgG Fe變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc或vlgGlFc)與HCG偶聯形成的二聚體蛋白，可顯著延長蛋白的體內半衰期，大大提高HCG在CHO細胞中的表達量，具有顯著的體內外活性。
[0049]2.二聚化單鏈HCG-Fc融合蛋白的α鏈與β鏈以共價鍵正確折疊，避免形成α-α 二聚體和β-β 二聚體，大大簡化了純化工藝，降低生產成本。
[0050]3.本發明的重組HCG-Fc融合蛋白體內半衰期顯著延長，其半衰期是現有人尿HCG的10倍，且絕對生物利用度是人尿HCG的2倍，可大大減少用藥次數和劑量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0051]圖1.顯示了人IgGl、IgG2、IgG4和它們變體的絞鏈區和CH2區域的氨基酸序列的比對。比較這三部分氨基酸序列:氨基酸區域228、234-237和330-331。這些變體的氨基酸突變以粗斜體顯示。氨基酸殘基編號是根據EU編號體系標定。[0052]圖2.顯示了 HCG-Fc單鏈及二聚化結構示意圖。a)單鏈HCG-Fc ；b) 二聚化的HCG-Fc。
[0053]圖3.顯示了在PCDNA3表達載體內HindII1-EcoRI片段的HCG-Fc的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。HCG-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導肽(1-20)、成熟HCGii鏈、成熟HCGa鏈、肽接頭、IgG2Fc變體(vIgG2Fc)。成熟的重組HCG-Fc融合蛋白含有成熟HCG β鏈(21-165)、成熟 α 鏈(166-257)、肽接頭(258-273)和 IgG2Fc 變體(vIgG2Fc) (274-496)。
[0054]圖4.顯示了在TCDNA3表達載體內HindII1-EcoRI片段的HCG-Fc的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。HCG-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導肽(1-20)、成熟HCGii鏈、成熟HCGa鏈、肽接頭、IgG4Fc變體(vIgG4Fc)。成熟的重組HCG-Fc融合蛋白含有成熟HCG β 鏈(21-165)、成熟 HCG α 鏈(166-257)、肽接頭(258-273)和 IgG4Fc 變體(vIgG4Fc)(274-502)。
[0055]圖5.顯示了在PCDNA3表達載體內HindII1-EcoRI片段的HCG-Fc的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。HCG-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導肽(1-20)、成熟HCGii鏈、成熟HCGa鏈、肽接頭、IgGlFc變體(vlgGlFc)。成熟的重組HCG-Fc融合蛋白含有成熟HCG β 鏈(21-165)、成熟 HCG α 鏈(166-257)、肽接頭(258-273)和 IgGlFc 變體(vlgGlFc)(274-500)。
[0056]圖6.顯示了所構建編碼HCG-Fc融合蛋白的真核表達質粒圖譜。該表達質粒全長9063bp，含有10個主要基因片斷，包括1.CMV啟動子；2.目標基因HCG-Fc ；3.1RES ；
4.Zeocin抗性篩選基因；5.BGH終止子；6.SV40啟動子；7.DHFR擴增基因；8.SV40終止子；
9.氨節青霉素抗性基因(Ampicillin) ; 10.ColEl復制起點(Ori)。
`[0057]圖7.顯示了在7L生物反應器中重組HCG-Fc細胞株表達分泌HCG-Fc蛋白的累積趨勢曲線圖。
[0058]圖8.Western bloting結果顯示了重組HCG-Fc融合蛋白在CHO細胞中的成功表達。非還原膠，Lanel:尿來源的HCG (50KDa) ;Lane2:本發明的重組HCG_vIgG2Fc融合蛋白(148KDa) ;Lane3:本發明的重組HCG-vIgGlFc融合蛋白(148KDa) ;Lane4:本發明的重組HCG-vIgG4Fc 融合蛋白(148KDa)。
[0059]圖9.顯示了純化的重組單鏈和二聚化HCG-Fc融合蛋白在還原條件和非還原條件下的10% SDS-PAGE電泳圖譜。Lanel:非還原膠，重組二聚化HCG_vIgG2Fc融合蛋白(148KDa) Lane2:非還原膠，重組二聚化HCG-vIgGlFc融合蛋白(148KDa) ；Lane3:非還原膠，重組二聚化HCG-vIgG4Fc融合蛋白(148KDa) ；Lane4:還原膠，重組單鏈HCG_vIgG2Fc融合蛋白(74kDa) ;Lane5:還原膠,重組單鏈HCG-vIgGlFc融合蛋白(74kDa) ;Lane6:還原膠，重組單鏈HCG-vIgG4Fc融合蛋白(74kDa)。
[0060]圖10.顯示了純化的重組HCG-Fc融合蛋白、人尿HCG在大鼠體內的代謝曲線。a)重組 HCG-vIgG2Fc、重組 HCG_vIgG4Fc 和重組 HCG-vIgGlFc ；b)人尿 HCG。
【具體實施方式】
[0061]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0062]實施例1.構建編碼重組HCG-Fc融合蛋白的基因表達載體
[0063]基因序列設計是基于CHO細胞偏愛密碼子進行優化，采用人工合成的方法合成經過優化的含有編碼HCG蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段和HCGa鏈成熟肽段的融合基因，將所合成的756bp DNA片段插入轉移載體如PUC57中的EcoRV限制性酶切位點間，獲得了HCG質粒(pHCG)，使用DNA測序方法驗證插入序列的正確性。
[0064]分別人工合成含有BamHI (5’端)和EcoRI (3’端)酶切位點的編碼柔性肽接頭(Linker，檢測“L”)和 Fe 變體(vIgG2Fc、vIgG4Fc 和 vlgGlFc)片段的融合基因 L_vIgG2Fc、L-vIgG4Fc和L-vIgGlFc。將獲得的融合基因片段分別插入到轉移載體如TOC19的BamHI和EcoRI位點間,得到含三種變體的質粒,分別為pL-vIgG2Fc、pL_vIgG4Fc和pL_vIgGlFc。通過DNA測序驗證L_vIgG2Fc、L_vIgG4Fc和L-vIgGlFc的基因序列。為制備兩種HCG-L-Fc融合基因，用限制性內切酶SpeI和BamHI雙酶切pHCG質粒，凝膠電泳后膠回收編碼HCG蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段和HCGa鏈成熟肽段的融合基因片段，經純化的上述基因片段分別插入到pL-vIgG2Fc、pL-vIgG4Fc和pL_vIgGlFc質粒中肽接頭的5'-端,T4連接酶連接構成pHCG-L-vIgG2Fc、pHCG-L_vIgG4Fc和pHCG-L_vIgGlFc質粒。所構建的融合基因由HCGi3、HCGa、肽接頭和Fe變體基因組成，其核苷酸序列如SEQ ID N0:l、3和5所示，其單鏈結構如圖2a所示，二聚化結構如圖2b所示。
[0065]限制性內切酶SpeI / EcoRI 分別雙酶切 pHCG-L_vIgG2Fc、pHCG-L_vIgG4Fc和 pHCG-L-vIgGlFc 質粒，DNA 凝膠純化得到 HCG-L-vIgG2Fc、HCG-L_vIgG4Fc 和HCG-L-vIgGlFc片段。將純化好的兩種HCG-L-Fc片段插入到哺乳動物細胞表達質粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相應酶切位點間，最終獲得含融合基因表達質粒 pCDNA3-HCG-vIgG2Fc、pCDNA3-HCG_vIgGlFc 和 pCDNA3-HCG_vIgG4Fc，統稱為pCDNA3-HCG-Fc質粒，如圖6所`示。該質粒含哺乳動物細胞高效表達外源基因蛋白所需的啟動子CMV ;該質粒還含有兩種選擇性標記基因，從而在細菌中可以具有氨芐青霉素抗性，在哺乳動物細胞中可以具有博來霉素(zeocin)抗性。此外，當宿主細胞是DHFR基因表達缺陷型時，PCDNA3表達載體所含有的小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在時，能共擴增pHCG-Fc融合基因和DHFR基因。
[0066]通過肽接頭(較佳地為柔性接頭)進行HCG和Fe片段的偶聯可提高蛋白的生物活性，對本發明而言，優選的是長度為約20個或更少(但不能少于2個)氨基酸的肽接頭，當然由I個氨基酸構成的肽接頭也在本發明的保護范圍內，宜使用含有或由2個或更多選自以下氨基酸構成的肽接頭:甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。本發明實施例的肽接頭含有 Gly-Ser 肽構件,其氨基酸序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0067]實施例2.重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物細胞中的穩定表達
[0068]將實施例1構建的表達質粒P⑶NA3-HCG-L-FC轉染入DHFR酶缺陷型CHO宿主細胞(CH0-DHFR-)，圖2b顯示了重組二聚化HCG-Fc融合蛋白的示意圖。采用電穿孔方法進行轉染，使用 96O μ Fd 電容的Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)，將其電場設置為250V，在比色杯內的2~5 X IO7個細胞中加入10 μ g用PvuI線性化的質粒DNA。在轉染兩天后，將培養基改成含100 μ g / mL Zeocin抗性標記基因的生長培養基，獲得經抗性初篩的轉染子。采用western blotting的方法,用抗HCG抗體檢測HCG-Fc的表達，如圖7。利用DHFR擴增選擇性標記基因提高重組二聚化蛋白的表達水平，為此在含有遞增濃度MTX的生長培養基中，用DHFR基因共擴增轉染的重組二聚化蛋白基因。用極限稀釋法亞克隆能在高達10 μ M / mL MTX培養基中生長的轉染子。對亞克隆細胞系的分泌率作進一步分析。篩選分泌水平超過約10 (較佳地約20) μ g / 106(即百萬)個細胞/24小時的細胞株，獲得穩定高表達重組HCG-Fc融合蛋白的細胞株。
[0069]實施例3.重組HCG-Fc融合蛋白的生產和純化
[0070]采用實施例2得到的高產量細胞株，首先在培養皿中進行無血清馴化培養，然后轉移到搖瓶中進行懸浮馴化培養，馴化過程中同時進行培養基的篩選，加入不同的成分觀察細胞的生長狀態、生長趨勢，以及表達產物的活性和唾液酸等生化指標，優選的細胞培養條件為:基礎培養基加入100 μ M Cu2+，feeding培養基加入2mM ManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)，該方法可使重組HCG-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20%。馴化成功后，進行細胞擴增，擴增到足夠量，進行7L生物反應器監測培養，在細胞密度超過IXlO7個/ mL時開始降溫至33°C培養，批次生長周期為20天。用Iml ProteinA柱層析對重組蛋白進行初步純化，測定重組HCG-Fc融合蛋白的表達量，結果顯示，重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG-vIgG4Fc和重組HCG-vIgGlFc細胞株表達的累積產量分別為1.20g/L、0.89g/L、
0.82g/L(圖 7)。
[0071 ] 重組HCG融合蛋白的純化包括以下步驟:
[0072]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fe片段的特性，利用親和層析方法，將上清液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的ProteinA柱；待重組融合蛋白結合于ProteinA后，用PBS洗滌該柱，直至0D280值低于0.01，再用20mM pH為4.0的醋酸鈉緩沖液洗脫結合的重`組HCG-Fc融合蛋白，最后用ρΗΙΟ.0的IM Tris-HCl緩沖液中和活性收集液。純化的HCG-Fc蛋白純度可達到95%以上。
[0073]2)疏水柱層析:用超濾方法將上述protein A活性收集液更換為20mMTris-HCl-1.5MNaCl (pH8.0)緩沖液，將該樣品加樣到用 20mM Tris-HCl-l.5M NaCl (pH8.0)平衡過的phenyl-6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mM Tris-HCl-l.35MNaCl (ρΗ8.0)淋洗，最后用 20mM Tris-HCl-0.5M NaCl (ρΗ8.0)緩沖液洗脫。
[0074]Western bloting結果顯示了重組HCG-Fc融合蛋白在CHO細胞中的成功表達,如圖8所示，在非還原條件下SDS-PAGE膠電泳圖譜，人尿HCG (商業產品)和本發明的重組HCG-Fc融合蛋白分別在50KDa和148KDa顯示相對應的目標蛋白雜交條帶，驗證了本發明得到的重組HCG融合蛋白中含有HCG蛋白。圖9是純化的HCG-Fc融合蛋白在還原和非還原條件下的SDS-PAGE膠電泳圖譜。結果顯示，純化的HCG-Fc蛋白純度可達到98%以上，HCG-Fc在還原條件下的分子量為非還原條件下分子量的50%。經N端15個氨基酸序列測定確認其氨基酸序列與SEQ ID NO:2、4和6相同。
[0075]實施例4.重組HCG-Fc融合蛋白的體內外活性測定
[0076]本發明的重組HCG-Fc融合蛋白(重組HCG_vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc和重組HCG-vIgGlFc)的體外活性(免疫原活性)采用B10CHECK(美國)公司生產的HCG酶免疫定量檢測試劑盒檢測，方法參考試劑盒說明書。體內活性采用2010版《英國藥典》中的卵巢增重法進行檢測。蛋白質含量測定使用LOWRY定量法。根據標準品標示量、人尿HCG和重組HCG-Fc融合蛋白(重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc和重組HCG-vIgGlFc)估計效價，用稀釋液(含0.1% BSA, pH7.2±0.2的磷酸鹽緩沖液)將標準品、人尿HCG和重組HCG-Fc融合蛋白配制成含HCGlIU / ml、2IU / ml、4IU / ml高中低三個劑量的工作液。選用19~28日齡，年齡相差不得超過3日，體重相差不得超過10克的SD雄鼠。標準品、人尿HCG組和HCG-Fc組均分為高中低三個劑量，每組6只動物。大鼠頸后皮下注射，每天注射兩次，每次注射體積為0.5ml，連續注射四天，每天在相同時間給藥。最后一次注射給藥24小時后，按照給藥順序采用脫白法處死動物，取精囊腺，剝離吸干表面水分后稱重，記錄器官重量。根據標準品精囊腺增重采用量反應平行線法計算人尿HCG和重組HCG-Fc的活性。測得重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc、重組HCG-vIgGlFc和人尿HCG的體外活性分別為 9961IU / ml、9305IU / ml、9521IU / ml 和 8369IU / ml，其體內活性分別為 9120IU /ml、8990IU / ml、8780IU / ml和8011IU / ml。結果表明，本發明的重組HCG-Fc融合蛋白具有顯著的體內外生物學活性。
[0077]實施例5.重組HCG-Fc融合蛋白的藥代動力學試驗
[0078]分為重組HCG-vIgG2Fc、重組 HCG_vIgG4Fc、重組 HCG-vIgGlFc、重組 HCG 給藥組和人尿HCG給藥組，每組選用體重200-250g的雄性SD大鼠3只，分別按10000IU / kg給予頸后皮下注射。重組HCG組合人尿HCG組在給藥后Ih、2h、4h、6h、8h、IOh、12h、24h、36h、48h、56h、72h進行眼眶靜脈采血，重組HCG-Fc融合蛋白分別在給藥后lh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、56h、72h、96h、144h、264h、312h、384h、432h、528h 進行眼眶靜脈采血。此外，每組分別另取3只大鼠進行相應藥物等劑量靜脈注射給藥，同樣的采血時間點進行采血。血樣經3000rpm離心5min后，吸取血清，_20°C保存。，采用ELISA試劑盒(B10CHECK，美國)測定各時間點血漿中HCG免疫活性。使用kinetica4.4軟件，通過統計矩法計算各組主要藥代動力學參數。各組藥代動力學曲線如圖10所示，半衰期結果如表1。結果顯示，人尿HCG在大鼠體內的消除半衰期約為15.3h，而本發明重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG-vIgG4Fc、重組HCG-vIgGlFc融合蛋白的消除半衰期分別為168.33h、166.82h和156.63h，是人尿HCG和重組HCG的10倍以上。將皮下`注射藥物計算得的AUC除以靜脈注射計算所得的AUC，即為絕對生物利用度，其中重組HCG-vIgG2Fc、重組HCG_vIgG4Fc、重組HCG-vIgGlFc融合蛋白的絕對生物利用度是重組HCG和人尿HCG的2倍以上，結果提示，和重組HCG和人尿HCG相比，達到同樣療效重組HCG-Fc融合蛋白所需注射次數大大減少、劑量顯著降低。
[0079]表1重組HCG-Fc融合蛋白的半衰期和生物利用度
[0080]
【權利要求】
1.重組HCG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含HCG β亞基、HCG α亞基、肽接頭和人IgGFc變體。
2.根據權利要求1所述的重組HCG-Fc融合蛋白，其中所述的HCGii亞基的氨基酸序列是去除了常規HCGii亞基中的1-18位氨基酸殘基之后的HCGi3 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；其中所述的HCGa亞基的氨基酸殘基序列是去除了常規HCGa亞基中的1_24位氨基酸殘基之后的HCGa SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；其中所述的肽接頭含有2_20個氨基酸，所述肽接頭存在于HCG a亞基和人IgG Fe變體之間，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸，優選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.根據權利要求1的重組HCG-Fc融合蛋白，其中所述的人IgGFe變體選自下組: (i)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和CH3區域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區、CH2 和 CH3 區域。
4.根據權利要求1所述的重組HCG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4和6所示。
5.編碼根據權利要求1的重組HCG-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQID NO:1、3 和 5 所示。
6.—種權利要求1的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，其步驟包括: 1)構建編碼重組HCG-Fc融合蛋白的基因表達載體: 采用人工合成方法獲得編碼HCG-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動物細胞表達載體，獲得含有HCG-Fc融合蛋白基因的表達質粒； 2)重組HCG-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達: 將含有HCG-Fc融合蛋白的表達載體轉染到哺乳動物宿主細胞，篩選穩定表達HCG-Fc融合蛋白的細胞株； 3)高密度細胞培養重組HCG-Fc融合蛋白: 將上述篩選到的穩定細胞株轉入搖瓶或細胞反應罐進行大規模培養，當細胞密度達到I X IO7個/ mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養直至表達產量不再增加； 4)重組HCG-Fc融合蛋白的純化制備: a)ProteinA親和層析:離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fe片段的特性，利用親和ProteinA柱層析； b)疏水層析柱純化:經疏水層析純化進一步去除上述ProteinA純化后目標蛋白中的雜質； 所述的疏水柱包括 Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B, Phenyl Sepharose CL-4B。優選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
7.根據權利要求6所 述的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟I)中所述的基因表達載體為 pCDNA3、pCMV / ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 或 pCMV-DHFR，優選，pCDNA3 ;其中步驟2)中所述的細胞轉染方法包括電穿孔轉染方法、磷酸鈣轉染、脂質體轉染和原生質融合，優選，電穿孔轉染方法；所述的哺乳動物宿主細胞包括010，冊1(293、8皿、吧0和3?2 /O細胞，優選，CHO細胞，更優選，DHFR酶缺陷型CHO-懸浮細胞(DHFR-CHO)。
8.根據權利要求6所述的重組HCG-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟3)中還包括在培養基中加入添加劑，優選，在基礎培養基加入100 μ M Cu2+，feeding培養基加入2mMManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1-8任意一項權利要求所述的重組HCG-Fc融合蛋白。
10.權利要求1的重組H CG-Fc融合蛋白在制備動物繁殖領域藥物中的應用。
【文檔編號】C07K1/20GK103804498SQ201310617155
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】侯永敏, 雷瑤, 鄧衡露 申請人:廣州諾新生物技術有限公司