種子活力的調節的制作方法

種子活力的調節的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種多核苷酸，該多核苷酸使得能夠調節種子活力、并且特別地提高種子活力，并且更特別地使得能夠修飾萌發速度。還提供了一種包括所述多核苷酸的植物種子。還提供了一種生產該植物種子的方法，用于改善植物種子、轉基因植物的萌發和活力的方法，以及本發明的多核苷酸用于產生具有改善的萌發和活力特征的生長植物的種子的用途。本發明特別地涉及蕓苔屬，更特別地甘藍。NCIMB4195120120404NCIMB4195020120404
【專利說明】種子活力的調節 發明領域
[0001] 本發明總體上涉及一種多核苷酸，該多核苷酸使得能夠調節種子活力、特別是提 高種子活力，并且更特別地使得能夠修飾萌發速度。本發明還涉及包括所述多核苷酸的一 種植物種子。另外，本發明中還提供了一種生產該植物種子的方法，用于改善植物種子、轉 基因植物萌發和活力的方法，以及本發明的多核苷酸用于產生具有改善的萌發和活力特征 的生長植物的種子的用途。本發明的植物特別地涉及蕓苔屬，更特別地甘藍。
[0002] 發明背景
[0003] 如由可從一個種子批次獲得的均一的可用的植物的數目定義的，種子質量在發達 的園藝市場中已成為更重要的性狀。養育幼小植物在這些市場中是高技術活動，并且因此 對于種子質量的需求是高的。對此需要可靠的和一致的高種子質量。在不利條件下的萌發 也是一個重要的種子質量性狀。這意味著，對于種子品種的商業成功的一個需求是一致和 強健的種子質量。然而，目前商業品種的種子質量不總是穩定的和可預測的。
[0004] 種子質量參數受種子發育期間的母體環境條件高度影響。給定所需的種子體積和 商業可行性，這些條件中僅有限的管理是可能的。因此，種子質量的一致性受母體條件的敏 感度限制。研宄已顯示母體環境可潛在地影響所有種子質量參數，包括在不利條件下的均 一性和萌發。降低母體條件的影響將因此導致更一致的和強健的種子質量，這在發達的和 發展中的市場中提供優勢。
[0005] 可預測的和均一的幼苗建立對于生產可持續的和可營利的作物是必要的。對于這 種可預測性的關鍵促成因素是種子的萌發性能，種子的萌發性能受種子休眠和活力的直接 影響。休眠自身（在一般的可允許條件下沒有萌發）在許多作物種類上不被認為是實際問 題，而低種子活力（實踐中差的種子性能）不僅大大影響所有作物中出苗的數目，還影響出 苗的時機和均一性。這樣的影響對確定成本效率和所需投入的作物生產的許多方面具有重 大影響，也對市場收益率有直接的作物特定影響（芬奇-薩維奇（Finch-Savage)，1995)。 低種子活力可起因于許多類型的種子退化和損害，并且這具有極大商業意義。然而，在種子 開始退化之前，其初始活力中也存在固有的區別，但是對此遺傳、分子和生理學基礎保持仍 了解甚少。
[0006] 已經鑒定了許多基因中的顯示具有改變的種子萌發性能的表型的突變，并且這些 在發展我們對于管理萌發的現有了解中是有用的（由芬奇-薩維奇（Finch-Savage)和羅 伊貝爾 _ 梅茨格（Leubner-Metzger)，2006 ;霍爾茲沃思（Holdsworth)等人，2008a 和 2008b 綜述）。然而，這些基因在野生型或作物種子中的相對影響是知之甚少的，并且未顯露將形 成針對種子活力的辨別測試的基礎的清晰的候選者。在自然群體和作物基因型中可獲得實 驗室誘發突變的遺傳變異的可替代來源。使用這種變異來鑒定與種子活力相關聯的QTL，并 且然后影響這些性狀的候選基因可提供鑒定實際上重要的基因的途徑。
[0007] 在西紅柿（富拉德（Foolad)等人，1999)、甘藍（貝特艾（Bettey)等人，2000,芬 奇-薩維奇（Finch-Savage)等人，2005)以及擬南芥（格羅特（Groot)等人，2000,克列爾 科斯（Clerkx)等人，2004)的一系列的種子活力性狀的數量遺傳分析中已利用了天然和作 物植物變異。已在所有三個種類中鑒定了種子萌發速度QTL。在健康的未老化種子中，在萌 發速度方面休眠和低種子活力之間的區別（如果存在）是未被了解的并且可具有相同的基 礎（希爾霍斯特（Hilhorst)和圖羅普（Toorop)，1997)。在大部分情況下，例如在擬南芥 中，生理休眠不是絕對的，但種子有條件地休眠，即萌發傾向于是慢的并且僅在有限范圍的 環境中是可能的。隨著休眠逐漸消失，萌發傾向于加速并變得在更寬范圍的環境中是可能 的，并因此顯得像活力的增加。
[0008] 在對建立種子萌發和調節種子休眠負責的因子中，脫落酸（ABA)( -種眾所周知 的植物激素）發揮了重要作用。ABA對于種子萌發和種子成熟過程是特別必要的（綜述參 見芬克爾斯坦（Finkelstein)等人2002)，因為它造成種子休眠期的建立。至于萌芽，重要 的是，種子不會在例如冬季或一個干季之前的不合時令的溫和條件下過早萌發。該種子中 的ABA強制這種休眠。僅如果該種子已被暴露于長時間的寒流和/或其他適合的環境信號 并且如果存在足夠的水以支持萌發的話，則休眠被抬升。除了在種子活力上的作用，ABA還 調節植物生命的多個重要方面，包括對生物威脅和非生物脅迫像干旱和干燥的生理響應。
[0009] 因此對具有更可靠的和一致的種子活力、尤其具有時間上定義的和均一的萌發速 度的種子的存在長期需要，以提供獨立于母體條件并且無論外部環境條件如何，以更恒定 速率萌發的種子。這樣的增加的種子活力在種子被一種給定制劑（化學的、生物的）包衣 的情況下受到特別關注，因為這種情況下通常觀察到種子萌發中的延遲。因此，包括提高種 子活力、更特別地提高種子萌發的速度和均一性的序列的種子對于在中和包衣處理的影響 是最重要的，同時仍施用殺昆蟲劑和殺真菌劑。
[0010] 另外，雖然在許多方面中增加種子活力將是非常有用的和所希望的形狀，在一些 情況下似乎降低種子活力會受到極大關注。特別地在胎萌種子中，降低種子活力可能是有 益的。胎萌被定義為種子在仍處于母本植物上時或在干燥之前萌發，并可在未成熟的和成 熟的種子中發生。已經在許多不同作物種類包括蕓苔屬作物中觀察到胎萌（魯安（Ruan) 等人2000)。因此，包括能夠降低種子活力的序列的種子能夠延遲（如果不能去除的話）不 希望的胎萌表型。
[0011] 發明概述
[0012] 因此，在這樣的現有技術中，諸位發明人的貢獻是從一個群體中鑒定包含一個小 的跨越S0G1 (萌發速度1)(由貝特艾（Bettey)等人（2000)在甘藍中指定的種子萌發的一 個速度QTL)的滲入區域的一種植物，并且特別地證明和鑒定涉及到調節種子活力、特別地 涉及到種子萌發速度的調節中的對應的基因給。特別證明了，這些基因和它們對應的序列 可被用作使能夠獲得展現修飾的種子活力表型的種子（或產生種子的植物）的工具。特別 地，為了調節種子活力，基因序列可被引入新的背景中。更特別地，基因序列可被用于工程 化一種新的植物，獨立于外部環境條件并且不論母體條件如何，該植物的種子會更早出芽、 更均一。另外，所述基因序列可被用作以下的工具：修飾該種子中的ABA含量，和/或該種 子響應ABA，從而影響就種子休眠以及種子貯藏蛋白和脂質合成而論的種子行為。 實施例
[0013] 因此，在一個第1實施例中，本發明提供一種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷 酸，包括選自下組的一種核酸分子，該組由以下各項組成：
[0014] a. -種包括如在SEQ ID NO: 1 (BolC. VG1. a的A12版本）中描述的核苷酸序列的 核酸分子；
[0015] b. -種包括如在SEQ ID NO: 2 (BolC. VG2. a的A12版本）中描述的核苷酸序列的 核酸分子；
[0016] c.一種包括如在SEQIDNO:3 (BolC. VG1.a的⑶33版本）中描述的核苷酸序列的 核酸分子；
[0017] d.-種包括如在SEQIDNO:4(BolC. VG2.a的⑶33版本）中描述的核苷酸序列的 核酸分子；
[0018] e. -種包括其互補鏈與a)_d)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核 酸分子；
[0019] f. -種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_e)中任一項所定義的核苷酸序列的核 苷酸序列的核酸分子；
[0020] 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)-f)中任一項所定義的核酸分 子導致修飾的種子活力。
[0021] 在一個第2實施例中，本發明提供根據實施例1所述的一種多核苷酸，特別地一種 分離的多核苷酸，包括選自下組的一種核酸分子，該組進一步由以下各項組成：
[0022] a. -種包括如在SEQ ID NO: 5 (BolC. VG2. b的截短的A12等位基因）中描述的核 苷酸序列的核酸分子；
[0023] b. -種包括如在SEQ ID NO: 6 (BolC. VG2. b的截短的⑶33等位基因）中描述的核 苷酸序列的核酸分子；
[0024] c. -種包括其互補鏈與a)_b)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核 酸分子；
[0025] d. -種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_c)中任一項所定義的核苷酸序列的核 苷酸序列的核酸分子；
[0026] 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_d)中任一項所定義的核酸分 子導致修飾的種子活力。
[0027] 在一個第3實施例中，本發明提供一種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包 括選自下組的一種核酸分子，該組由以下各項組成：
[0028] a.包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少60%序列一致性的核苷酸 序列的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6;
[0029] b.包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少80%序列一致性的核苷酸 序列的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6;
[0030] c.包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少90%序列一致性的核苷酸 序列的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6;
[0031] d.包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少95%序列一致性的核苷酸 序列的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ;
[0032] e.包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少98%序列一致性的核苷酸 序列的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ;
[0033] f.包括其互補鏈與a)_e)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核酸分 子；
[0034] g.包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_f)中任一項所定義的核苷酸序列的核苷酸 序列的核酸分子；
[0035] 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_g)中任一項所定義的核酸分 子導致修飾的種子活力。
[0036] 在一個第4實施例中，本發明涉及根據第一、第二或第三實施例所述的一種多核 苷酸，其中該修飾的種子活力表型由在下組中選擇的一個另外的表型表征，該組包括：修飾 的萌發速度、修飾的出苗速度、修飾的種子萌發均一性、修飾的出苗均一性、修飾的種子萌 發百分比、修飾的該種子相對于外部環境和/或母體條件的耐受性、修飾的對ABA的敏感性 或修飾的ABA含量。
[0037] 在一個第5實施例中，本發明涉及一種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包 括在下組中選擇的一種核酸分子，該組包括：
[0038] a. -種包括如在SEQIDNO:3中描述的核苷酸序列的核酸分子；
[0039] b. -種包括如在SEQIDNO:4中描述的核苷酸序列的核酸分子；
[0040] c. 一種包括如在SEQIDN0:6中描述的核苷酸序列的核酸分子；
[0041] d. -種包括其互補鏈與a)_c)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核 酸分子；
[0042] e. -種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_d)中任一項所定義的核苷酸序列的核 苷酸序列的核酸分子；
[0043] 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_e)中任一項所定義的核酸分 子導致增加的種子活力。
[0044] 在本發明的背景下，表述"增加的種子活力"意為可在種子萌發更快并且因此更茁 壯的意義上修飾種子萌發速度。在一個具體實施例中，萌發速度被增加，允許待獲得由于在 其基因組中存在根據本發明的一種多核苷酸而萌發更快（與不包括所述多核苷酸的種子 相比）的種子。這樣的增加的萌發速度導致出苗顯著更快，并因此提供具有提高的柔韌性 和對各種環境更好適應的種子。發現鑒定的這2個基因具有意義重大的萌發表型，該萌發 表型表明這些基因是不同程度上的萌發調節子。對應于根據本發明的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4(這些基因的⑶33等位基因）的多核苷酸的等位基因已被證明對應于增加的種子 活力的表型，并因此允許修飾其中對此被滲入該等位基因的植物種子的萌發速度以及增加 的萌發速度。
[0045] 在一個第6實施例中，本發明涉及根據實施例5所述的一種多核苷酸，其中該增加 的種子活力表型由在下組中選擇的一個另外的表型表征，該組包括：增加的萌發速度、增加 的出苗速度、增加的種子萌發均一性、增加的出苗均一性、增加的種子萌發百分比、增加的 該種子相對于外部環境和/或母體條件的耐受性、降低的對ABA的敏感性或降低的ABA含 量。
[0046] 在一個第7實施例中，本發明涉及一種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包 括在下組中選擇的一種核酸分子，該組包括：
[0047] a.-種包括如在SEQIDNO: 1中描述的核苷酸序列的核酸分子；
[0048] b.-種包括如在SEQIDNO:2中描述的核苷酸序列的核酸分子；
[0049] c.一種包括如在SEQIDN0:5中描述的核苷酸序列的核酸分子；
[0050] d.-種包括其互補鏈與a)至c)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核 酸分子；
[0051] e.-種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)-d)中任一項所定義的核苷酸序列的核 苷酸序列的核酸分子；
[0052] 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_e)中任一項所定義的核酸分 子導致降低的種子活力。
[0053] 在一個第8實施例中，本發明提供一種表達盒，該表達盒包括以上實施例中任一 項所述的一種多核苷酸。
[0054] 在一個第9實施例中，本發明提供一種載體分子，該載體分子包括根據第8實施例 所述的表達盒。
[0055] 在一個第10實施例中，本發明涉及根據實施例1至3所述的多核苷酸用于修飾種 子活力的用途。
[0056] 在一個第11實施例中，本發明涉及用于修飾種子活力的一種方法，該方法包括： 通過雜交或通過植物轉化技術將實施例1至10中任一項所述的多核苷酸、表達盒或載體分 子滲入一種植物或植物部分中并在其中表達。
[0057] 在一個第12實施例中，本發明涉及用于產生具有修飾的種子活力的種子的一種 方法，包括：
[0058] a.獲得一種第一植物，該第一植物被證實包含實施例1至7中任一項所述的多核 苷酸；
[0059] b.使所述第一植物與被證實缺乏所述多核苷酸的一種第二植物雜交；并且
[0060] c.鑒定從該雜交中得到的一種植物種子，與由該第二植物產生的種子相比，該植 物種子展現修飾的種子活力。
[0061] 在一個第13實施例中，本發明涉及一種植物或植物部分，該植物或植物部分在其 基因組內包含包括實施例1至9中任一項所述的多核苷酸、表達盒或載體分子的滲入，并且 與不包括所述多核苷酸、表達盒或載體分子的一種植物或植物部分相比，展現種子活力的 修飾。
[0062] 在一個第14實施例中，本發明涉及一種植物或植物部分，該植物或植物部分在其 基因組內包含包括根據實施例5所述的多核苷酸的滲入，并且與由不包括所述多核苷酸的 一種植物或植物部分產生的種子相比，展現增加的種子活力。
[0063] 在一個第15實施例中，本發明涉及一種植物或植物部分，該植物或植物部分在其 基因組內包含包括根據實施例7所述的多核苷酸的滲入，并且與由不包括所述多核苷酸的 一種植物或植物部分產生的種子相比，展現降低的種子活力。
[0064] 在一個第16實施例中，本發明提供用于選擇具有修飾的種子活力的植物或植物 部分的一種方法，該方法包括在待測的植物或植物部分中檢測存在或不存在根據實施例I至7中任一項所述的多核苷酸。
[0065] 在一個第17實施例中，本發明提供用于選擇具有修飾的種子活力的植物或植物 部分的一種方法，包括使候選植物或植物部分接觸一種選自下組的選擇工具，該組包括實 施例1至7中任一項所述的多核苷酸。
[0066] 在一個第18實施例中，本發明涉及根據以上權利要求中任一項所述的植物或植 物部分，該植物或植物部分是栽培的植物或栽培的植物部分，并且是在下組中選擇的，該組 包括甘藍（Brassicaoleracea)、甘藍型油菜（Brassicanapus)、白菜型油菜（Brassica rapa)、蕓苔（Brassicacampestris)、芥菜（Brassicajuncea)、黑芥（Brassicanigra)、 大白菜(Brassicapekinensis)、小白菜(Brassicachinensis)、塌棵菜(Brassica rosularis)、蕓芥（Erucavesicaria)、芝麻菜（Erucasativa)、蘿卜（Raphanussativus)、 家獨行菜（Lepidiumsativum)、豆辦菜（Nasturtiumofficinale)、山葵（Wasabia japonica)〇
[0067] 在一個第19施例中，本發明提供用于獲得具有修飾的種子活力的植物或植物部 分的一種非生物方法，該方法包括將根據實施例1至7中任一項所述的多核苷酸引入所述 植物或植物部分的基因組中。
[0068] 在一個實施例20中，本發明涉及根據實施例N° 16所述的方法，包括（a)獲得被 證實包含實施例1至7中任一項所述的多核苷酸的一種第一植物；(b)使所述第一植物與 被證實缺乏所述多核苷酸的一種第二植物雜交；并且（c)鑒定從該雜交中得到的展現修飾 的種子活力并包含所述多核苷酸的一種植物。
[0069] 在一個實施例21中，本發明涉及根據實施例20所述的方法，其中該多核苷酸的存 在是通過使用一個分子標記，特別地通過一種物理地定位于包含該多核苷酸的遺傳基因座 的內部或外部的一個位置處的分子標記來證實的。
[0070] 在一個實施例22中，本發明涉及根據實施例20所述的方法，其中該多核苷酸的存 在是通過使用至少兩個分子標記，特別地通過至少兩個物理地定位于包含該多核苷酸的遺 傳基因座的側翼的一個位置處的分子標記來證實的。
[0071] 在一個實施例23中，本發明涉及一種包括根據實施例1至7所述的多核苷酸的種 子，其中用任意類型的包衣對所述種子進行包衣。
[0072] 在一個實施例24中，本發明涉及根據實施例13至18所述的植物或植物部分，其 中該植物是一種雜種植物。
[0073] 在一個實施例25中，本發明涉及根據實施例24所述的植物或植物部分，可從保藏 于NCMB的保藏號NCMB41951下的種子或其子代獲得。
[0074] 發明詳細說明
[0075] 根據以上實施例的多核苷酸序列已被鑒定并從具有不同的種子活力表型的一種 甘藍植物中分離。具有根據本發明的多核苷酸序列的等位基因被滲入到具有不同的種子質 量和不同的種子活力的一種植物中。由于滲入根據本發明的多核苷酸序列中任一個，種子 活力被顯著修飾，并且因此植物或植物部分質量、特別是該植物的種子質量被顯著地修飾， 特別是種子活力，如通過萌發速度突出的。在一個實施例中，該種子能夠萌發更好并且更 快，特別地在冷的條件下，顯示更強健的種子質量。滲入根據實施例5的一種多核苷酸序列 允許獲得不那么容易受到種子產生環境影響的植物種子質量。這意味著滲入根據本發明的 多核苷酸序列使的能夠從常規種子產生中交付一致的種子質量。
[0076] 根據本發明的多核苷酸序列在商業栽培植物、特別是栽培蕓苔屬植物、更特別栽 培甘藍植物中的引入將確保更可靠地生產具有足夠種子質量的種子。這將顯著增加操作靈 活性。
[0077] 包括根據本發明的多核苷酸序列中任一項的雜種種子展現更均一的群叢建植，尤 其在不利條件下。這將決定性地為該商業種子產品增添價值。
[0078] 種子保藏詳情
[0079] 2012年4月4日根據布達佩斯條約（theBudapestTreaty)的規定以先 正達公司（SyngentaParticipationsAG)的名義將以下種子樣品保藏在英國蘇格 蘭阿伯丁郡AB219YA貝克斯伯恩的克萊伯斯通莊園弗格森大廈的NCMB(Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,AberdeenAB219YA,Scotland,UK)：
[0080] NCMB41950 甘藍A12
[0081] NCMB41951 甘藍SLlOl
[0082] 定義
[0083] 在本申請的范圍內所使用的技術術語和表述，如果在此以下沒有另外說明，總體 上將被給定通常地在植物基因工程、植物育種和栽培的相關領域中應用于它們之上的意 義。
[0084] 如在本說明書和所附的權利要求中所使用的，單數形式"一個"、"一種"和"該"包 括復數指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，涉及"一種植物"包括一種或多 種植物，并且涉及"一種細胞"包括多種細胞、組織等的混合物。
[0085] "栽培植物"、特別"栽培蕓苔屬植物"、更特別"栽培甘藍植物"在本發明的范圍內 被理解為是指不再是呈天然狀態，而是已經通過人類的照料進行發育并且供人類使用和/ 或種植目的和/或消費的植物。"栽培植物"、特別"栽培蕓苔屬植物"、更特別"栽培甘藍植 物"應進一步被理解為不包括那些包含了本發明主題的性狀作為天然性狀和/或其天然遺 傳學的一部分的野生型物種。
[0086] 在本發明的范圍內"等位基因"被理解為是指與一個基因或任意類型的可鑒定遺 傳元件的不同形式相同的或關聯的不同遺傳單位的可替代或變體形式，這些遺傳單位在遺 傳中是可替代的，因為它們處于同源染色體的相同的基因座。這類可替代或變體形式可以 是單核苷酸多態性、插入、倒置、易位或缺失的結果，或是基因調控（由例如化學或結構修 飾引起的）、轉錄調控或翻譯后修飾/調控的結果。在二倍體細胞或生物中，一個給定基因 或遺傳元件的兩個等位基因典型地占有同源染色體對上相應的基因座。
[0087] -個基因的"截短的"等位基因在本發明中意在表示一個基因的等位基因，當與其 全長基因等位基因對應物相比時，已經失去單個或多個部分的核苷酸序列。
[0088] 與質量性狀關聯的等位基因可包括不同遺傳單位的可替代或變體形式，這些遺傳 單位包括與一個單基因或多基因或其產物或甚至一個基因破壞相同的或關聯的或被促成 由該基因座表示的表型的一個遺傳因子控制的那些。
[0089] 如此處使用的，術語"標記等位基因"是指當被用作在染色體上定位包含促成表型 性狀的可變性的等位基因的遺傳基因座的一個標記物時的如此處以上定義的一個遺傳單 位的一個可替代或變體形式。
[0090] 如此處使用的，術語"生殖"及其語法變體是指產生子代個體的任何過程。生殖可 以是有性的或無性的，或其任意組合。繁殖的示例性非限制類型包括雜交、自交、雙單倍體 衍生世代、及其組合，這些都是本領域的普通技術人員已知的技術。
[0091] "回交"在本發明的范圍內應理解為是指使雜種后代與親本之一重復往回回交的 過程。不同的輪回親本可以被用在隨后的回交中。重組體株系可通過將回交得到的子代進 行自交產生。
[0092] "基因座"在本發明的范圍內應理解為是指染色體上包含對性狀有貢獻的基因或 任何其他遺傳元件或要素的一個區域。
[0093] "滲入"（或滲入的（introgressed)在本發明的范圍內被理解為指將核酸的基因 或一個或多個區段從一個物種移動到另一個物種的基因池中，或在相同的物種內從一個株 系移動到另一個株系的基因池中。滲入可通過有性相交、有性雜交或通過遺傳轉化實現。
[0094] 如在此所使用，"標記位點"是指染色體上包含了存在于個體的基因組中并且與一 個或多個感興趣的位點相關的核苷酸或多核苷酸序列的一個區域，該區域可能包含對性狀 有貢獻的基因或任何其他遺傳元件或要素。"標記位點"還指染色體上包含與基因組序列互 補的多核苷酸序列（如用作探針的核酸的序列）的一個區域。
[0095] 出于本發明的目的，術語"分離"或"共分離"是指以下事實：針對性狀的等位基因 和針對標記的等位基因傾向于一起傳遞，這是因為它們在同一染色體上物理地緊靠在一起 (它們之間的重組由于它們物理的鄰近而減少），導致它們的等位基因由于它們在同一染 色體上的鄰近而非隨機關聯。"共分離"還指單一植物內存在兩種或更多種性狀，已知其中 至少一種是遺傳的并且這些性狀不能輕易地用偶然性解釋。
[0096] 如在此所使用，短語"基因標記"或"標記"是指個體的基因組中與一個或多個感興 趣的位點相關的特征（例如，存在于個體的基因組中的核苷酸或多核苷酸序列）。在一些實 施例中，基因標記在感興趣的群體中是多態性的，或位點被多態性占據，取決于上下文。基 因標記包括例如單核苷酸多態性（SNP)、插入或缺失（indels) (S卩，插入/缺失）、簡單序列 重復（SSR)、限制片段長度多態性（RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAH))、裂解擴增多態性序 列（CAPS)標記、多樣性陣列技術（DArT)標記以及擴增片段長度多態性（AFLP)以及許多其 他實例。基因標記可以例如用于對包含染色體上對表型性狀的可變性有貢獻的等位基因的 基因位點進行定位。短語"基因標記"或"標記"還可以指與基因組序列互補的多核苷酸序 列，如用作探針的核酸的序列。
[0097] "基因標記"或"標記"可以物理地定位于染色體上在與它關聯的基因位點內部或 外部（即，對應地是基因內的或基因外的）的一個位置。換句話說，盡管在相應于感興趣的 位點的基因或功能突變在染色體上的位置（例如，在基因外部的控制元件內）還沒有被鑒 別并且"基因標記"或"標記"與感興趣的位點之間存在非零重組比率時典型地使用"基因 標記"或"標記"，但本發明披露的主題還可以使用物理地處于基因位點的邊界內的"基因標 記"或"標記"（例如，在相應于基因的基因組序列內部，如但不限于基因的內含子或外顯子 內的多態性）。在本發明披露的主題的一些實施例中，該一個或多個"基因標記"或"標記" 包含在一個與十個之間的標記，并且在一些實施例中，該一個或多個基因標記包括多于十 個基因標記。
[0098] 如在此所使用，術語"基因型"是指細胞或生物的基因組成。個體的"一組基因標 記的基因型"包括個體的單倍型中存在的一個或多個基因標記位點的具體等位基因。如本 領域中已知，基因型可以涉及單一位點或多個位點，無論這些位點是相關還是非相關的，和 /或是關聯還是非關聯的。在一些實施例中，個體的基因型涉及一個或多個相關的基因，因 為這些基因中的一個或多個參與感興趣的表型的表達。因而，在一些實施例中，基因型包括 個體內在數量性狀的一個或多個基因位點處存在的一個或多個等位基因的匯總。在一些實 施例中，基因型從單倍型方面來表達。
[0099] 如在此所使用，術語"連鎖"和它的語法變體是指同一染色體上不同的位點處的等 位基因在它們的傳遞是單獨的情況下傾向于比偶然所預期的更經常地一起分離，在一些實 施例中是它們物理的鄰近的結果。
[0100]例如，如此處使用的"多核苷酸序列"是指所有形式的天然產生的或重組產生的類 型的核酸和/或核苷酸序列連同化學合成的核酸/核苷酸序列。該術語還囊括核酸類似物 和核酸衍生物，例如像鎖定的DNA、RNA、cDNA、PNA、硫代磷酸寡核苷酸和取代的核糖寡核苷 酸。另外，術語"多核苷酸序列"還指包括核苷酸或核苷酸類似物的任何分子。短語"核酸" 或"多核苷酸"是指可能相應于核苷酸串的任何物理單體單元串，包括核苷酸的聚合物（例 如，典型的DNA、cDNA或RNA聚合物）（任選地包含能夠結合入DNA或RNA聚合物中的合成 的、非天然的或改變的核苷酸堿基）、修飾過的寡核苷酸（例如，包括對于生物RNA或DNA不 典型的堿基的寡核苷酸，如f-O-甲基化寡核苷酸）等等。術語"多核苷酸"在此應當理 解為指高分子量的聚合物分子，該聚合物分子可以是由包含一種糖、磷酸鹽和一種堿基的 單體（核苷酸）組成的單鏈的或雙鏈的、多鏈的、或其組合，該堿基是或者一種嘌呤或者一 種嘧啶。除非另外指示，否則本發明披露的主題的具體核酸序列任選地還包括或編碼除了 明確指示的任何序列以外的互補序列。
[0101] 優選地，術語"多核苷酸序列"是指一種核酸分子，即脫氧核糖核酸（DNA)和/或 核糖核酸（RNA)。在本發明的背景下"多核苷酸序列"可以通過本領域的一個普通技術人 員已知的合成化學方法、或通過使用重組技術制成，或可以從天然來源中分離，或通過其組 合制成。DNA和RNA可任選地包括非天然核苷酸，并且可以是單鏈的或雙鏈的。"多核苷酸 序列"還指正義和反義DNA和RNA，即與DNA和/或RNA中的核苷酸的一個特異序列互補的 一個多核苷酸序列。另外，術語"多核苷酸序列"可指DNA或RNA或其雜種或其現有技術中 已知的修飾（參見例如US5525711、US4711955、US5792608或EP302175,例如修飾的）。 該多核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的、線性或環狀的、天然或合成的，并且沒有任何尺寸限 制。例如，該多核苷酸序列可以是基因組DNA、cDNA、mRNA、反義RNA、編碼這類RNA的核酶 或DNA或基因修正（chimeroplast)(甘佩爾（Gamper)，核酸研宄，2000, 28, 4332-4339)。所 述多核苷酸序列可以處于質粒的形式，或病毒DNA或RNA的形式。"多核苷酸序列"還可指 一種或多種寡核苷酸，其中包括現有技術修飾例如硫代磷酸或肽核酸（PM)中的任一個狀 --τO
[0102] 一個"多核苷酸片段"是一種給定的多核苷酸分子的一部分或一個"多核苷酸序 列"的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸（DNA)是遺傳物質，而核糖核酸（RNA)涉及將 DNA中包含的信息傳遞到蛋白中。一個"基因組"是在一種生物的每個細胞中所包含的遺傳 物質的整體。
[0103] 除非另外表明，本發明的一種特定的核酸序列還暗示性地涵蓋它的保守地修飾的 變體（例如，簡并密碼子取代）以及互補序列、以及連同明確地指明的序列。確切地，簡并 密碼子取代可通過產生以下序列來實現，在這些序列中一個或多個所選（或全部）密碼子 的第三位置被經混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代（巴澤爾（Batzer)等人，1991 ;大冢 (Ohtsuka)等人，1985;羅索利尼（Rossolini)等人，1994)。術語多核苷酸與核酸、核苷酸 序列可互換使用并且可以包括基因、cDNA、以及被一個基因編碼的mRNA、等。
[0104] 本發明的多核苷酸應當理解為是以一種分離的形式提供的。術語"分離的"指在 此披露和要求的多核苷酸，如果它確實具有一個天然發生的對應物，該多核苷酸不是以其 天然背景的方式出現的多核苷酸。因此，以下進一步描述的本發明的其他化合物應當理解 為是分離的。如果要求在一個植物基因組的背景中，通過該基因組的插入側以及位于該插 入側處的側翼序列將本發明的多核苷酸與天然發生的對應物區別開。
[0105] 在此使用的，術語"基因"是指與一種生物學功能相關聯的核酸的任何區段。因此， 基因包括對于它們的表達所要求的編碼序列和/或調節序列。例如，"基因"是指表達mRNA 或功能性RNA、或編碼一種特異性蛋白的一個核酸片段，并且它包括調節序列。基因還包括 非表達的DNA區段，例如形成針對其他蛋白的識別序列。基因可以獲自多個來源，包括從一 個感興趣的來源進行克隆、或從已知的或預測的序列信息合成，并且可以包括被設計成具 有所希望的參數的序列。
[0106] "基于標記的選擇"在本發明的范圍內應理解為是指例如使用基因標記從植物中 檢測一個或多個核酸，其中該核酸與所希望的性狀相關聯，以鑒別出攜帶令人希望的（或 不希望的）性狀的基因的植物，使得在選擇性育種計劃中可以使用（或避免）那些植物。一 種"標記基因"編碼一種可選擇或可篩選的性狀。
[0107] 本發明中使用的適合的標記可以例如選自下組，該組由以下各項組成：單核苷酸 多態性（SNP)標記、插入或缺失（indel)(即，插入/缺失）標記、簡單序列重復（SSR)標記、 限制片段長度多態性（RFLP)標記、隨機擴增多態性DNA(RAPD)標記、裂解擴增多態性序列 (CAPS)標記、多樣性陣列技術（DArT)標記以及擴增片段長度多態性（AFLP)標記。
[0108] 例如，RFLP涉及在具體的短限制位點使用限制酶來切割染色體DNA，由這些位點 之間的復制或缺失或這些限制部位處的突變產生多態性。
[0109] RAro利用低嚴格聚合酶鏈反應（PCR)擴增使用具有任意序列的單一引物來產生 無特色DNA片段的株系特異性陣列。該方法僅需要很少的DNA樣品并且分析大量的多態性 位點。
[0110] AFLP需要在使用PCR和引物中的選擇性核苷酸擴增具體片段之前用限制酶消化 細胞DNA。利用這種方法，使用電泳技術來目測所獲得的片段，每個引物組合可以測量多達 100個多態性位點，并且每一測試僅需要少量的DNA樣品。
[0111]SSR分析是基于廣泛分布在真核生物的基因組中的DNA微衛星（短重復）序列，將 這些序列選擇性地擴增以檢測簡單序列重復中的變化。SSR分析僅需要很少的DNA樣品。 SNP使用可有效地獲得點突變的PCR延伸檢驗。該程序每份樣品需要極少DNA。在典型的 基于標記的選擇育種計劃中可以使用上述方法中的一種或兩種。
[0112] 實現了跨越植物基因組多態性區的核苷酸片段的擴增的最優選的方法使用聚合 酶鏈反應（"PCR"）（穆利斯（Mullis)等人，冷泉港定量生物學專題討論會（ColdSpring HarborSymp.Quant.Biol.) 51:263273 (1986))，它使用了包括一個正向引物和一個反向引 物的成對引物，這些引物能夠呈其雙股形式與界定了多態性的鄰近序列雜交。如此處披露 的，可將這類啟動子用于精細作圖、圖位克隆以及用于表述分析。
[0113] 在本發明的范圍內"微衛星或SSR(簡單序列重復）標記"被理解為指一種類型的 遺傳標記，由在整個植物基因組的基因座處發現的并具有尚度多態的可能性的DNA喊基的 短序列的眾多重復組成。
[0114] "PCR(聚合酶鏈反應）"在本發明的范圍內應理解為是指產生基因組的DNA或一 個或多個子集的相對較大量的具體區域，從而進行可能的基于那些區域的不同的分析的方 法。
[0115] "PCR引物"在本發明的范圍內應理解為是指DNA的具體區域的PCR擴增中所使用 的相對較短的單股DNA片段。
[0116] "表型"在本發明的范圍內應理解為是指在基因上控制的性狀的可區分的特征。
[0117] 如在此所使用，短語"表型性狀"是指個體中由個體的基因組、蛋白質組和/或代 謝組與環境的相互作用產生的外觀或其他可檢測的特征。
[0118] "多態性"在本發明的范圍內應理解為是指一個群體中存在兩種或更多種不同形 式的基因、基因標記或遺傳性狀或例如通過可替代的剪接、DNA甲基化等可獲得的基因產 物。
[0119] 如在此所使用的"探針"是指能夠識別并且結合于具體目標分子或細胞結構并且 因而允許目標分子或結構的檢測的一組原子或分子。特別地，"探針"是指可以用于通過分 子雜交來檢測互補序列的存在并且對其定量的經過標記的DNA或RNA序列。
[0120] 能夠雜交的這類多核苷酸序列可通過使用此處所述的多核苷酸序列或其反 向互補序列進行鑒定或分離，例如通過根據標準方法進行雜交（參見例如薩姆布魯克 (Sambrook)和拉塞爾（Russell) (2001)，分子克隆：實驗室手冊（MolecularCloning:A LaboratoryManual)，CSH出版社，冷泉港，NY,USA)。包括與如在SEQIDNO1、2或3中列 出而指出的核苷酸序列、或其部分/片段相同或基本相同的核苷酸序列可以例如被用作雜 交探針。用作雜交探針的片段還可以是通過一般合成技術制備的合成片段，其序列與根據 本發明的核苷酸序列的序列基本相同。
[0121] 如在此所使用的術語"雜交"是指常規的雜交條件，優選地是指以下雜交條件，即： 使用5XSSPEU%SDSUXDenhardts溶液作為溶液和/或雜交溫度在35°C與70°C之間， 優選地65°C。雜交后，優選地首先用2XSSCU%SDS并且隨后用0.2XSSC在35°C到75°C 之間的溫度下、特別地在45°C到65°C之間、但尤其在59°C下進行洗滌（關于SSPE、SSC和 Denhardts溶液的定義，參見上述引文中的薩姆布魯克（Sambrook)等人）。如例如以上薩 姆布魯克等人中所述的高嚴格雜交條件是特別優選的。特別優選的嚴格雜交條件例如在如 上指示雜交和洗滌在65°C下進行時存在。例如雜交和洗滌在45°C下進行的非嚴格雜交條 件是不太優選的并且在35°C下是更不太優選的。
[0122] "序列同源性或序列一致性"在此被可互換地使用。在兩個或更多個核酸或蛋白 序列的背景下，術語"一致"或"一致性"百分比是指如使用以下序列比較算法之一或通過 目測進行測量，當比較和比對最大相應性時，兩個或更多個序列或子序列是相同的或具有 指定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸。例如，該術語用在與另一個、優選地完整的核苷 酸序列具有至少50%、55%、60%，優選地至少70%、75%，更優選地至少80%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94、95%、96%、97%、98%，以及甚至最優選地至 少99%的同源性（這就是說序列一致性）的一個核苷酸序列的背景下。
[0123] 如果將彼此進行比較的兩個序列長度不同，則序列一致性優選地涉及與較長序列 的核苷酸殘基一致的較短序列的核苷酸殘基的百分比。如在此使用的，考慮了裂隙的數目 以及每個裂隙的長度，這兩種序列之間的百分比一致性/同源性是由這些序列共享的相同 位置的數目的函數（即，％同源性=相同位置的#/位置的總#X1〇〇)，在這兩種序列的優 化比對中需要引入百分比一致性。序列的比較和兩種序列之間的百分比一致性的確定可以 使用數學算法來完成，如下文所述的。例如，常規地通過使用計算機程序例如Bestfit程序 (威斯康星序列分析包（WisconsinSequenceAnalysisPackage)，針對Unix的版本8,遺 傳學計算機集團公司（GeneticsComputerGroup)，大學研宄園區（UniversityResearch Park)，575 科學先驅麥迪遜（575ScienceDriveMadison)，WI53711)可以確定序列一 致性。Bestfit使用史密斯（Smith)和華特曼（Waterman)，應用數學進展2(Advancesin AppliedMathematics2) (1981)，482-489的局部同源性算法以便找到兩個序列之間具有 最大序列一致性的區段。當使用Bestfit或其他序列比對程序來確定是否一個具體的序 列與本發明的一個參照序列具有例如95% -致性時，優選地對參數進行這樣的調整從而在 參照序列的整個長度上對一致性的百分比進行計算并且允許該參照序列中同源性缺口占 核苷酸總數的高達5%。當使用Bestfit時，優選地將所謂的任選的參數保留在它們預設 ("默認"）值。在一個給定的序列和上述本發明的序列之間的比較中出現的偏差可能是 由例如加入、缺失、取代、插入或重組引起的。優選地還可以使用程序"fasta20u66"（版本 2. 0u66,1998年9月，由威廉（William)R.皮爾森（Pearson)和佛吉尼亞大學編寫，也參見 W.R.皮爾森（Pearson) (1990)，酶學方法（MethodsinEnzymology) 183, 63-98,所附的實 例以及 http://workbench.sdsc.edu/)進行這樣一種序列比較。對于這個目的，可以使用 "默認"參數設定。
[0124] 兩個核酸序列實質上一致的另一指示是這兩種分子在嚴格條件下彼此雜交。短 語"特異性雜交"是指一個分子在嚴格條件下僅與一個特定的核苷酸序列結合、雙鏈化或雜 交，這是在該序列存在于一種復合混合物（例如，總細胞）DNA或RNA中時進行的。"實質上 結合"是指在一個探針核酸與一個靶核酸之間的互補雜交，并且涵蓋少量錯配，這些錯配可 以通過降低該雜交介質的嚴格來容納，以實現該靶核酸序列的所希望的檢測。
[0125] 在核酸雜交實驗（如DNA和RNA雜交）的背景下"嚴格雜交條件"和"嚴格雜交 洗滌條件"是序列依賴性的，并且在不同的環境參數下是不同的。較長的序列特定地在較 高的溫度下雜交。對核酸雜交的廣泛指導見于蒂森（Tijssen) (1993)生物化學和分子生 物學實驗室技術-使用核酸探針的雜交第2章第I部分"雜交原理和核酸探針檢驗策略綜 述"（LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-Hybridization withNucleicAcidProbespartIchapter2"Overviewofprinciplesof hybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays"），愛思唯爾，紐約。 總體而言，對于在限定的離子強度和pH值下的具體序列，高嚴格雜交和洗滌條件被選擇為 比熱熔點低約5°C。典型地，在"嚴格條件"下，探針將會與它的靶子序列進行雜交，但不會 與其他序列雜交。
[0126] 熱熔點是50%的目標序列與完全匹配的探針雜交時溫度（在限定的離子強度和PH值下）。極嚴格條件被選擇為等于對于具體探針的解鏈溫度（T.sub.m)。針對互補核酸 (它們在DNA或RNA印跡中在濾紙上具有超過100個互補的殘基）的雜交的嚴格雜交條件 的一個實例是具有Img肝素的50%甲酰胺、在42°C下、將該雜交過夜進行。高嚴格洗滌條件 的一個實例是〇. 15MNaCl，在72°C下持續約15分鐘。嚴格洗滌條件的一個實例是在65°C 下，0.2XSSC洗滌，持續15分鐘（關于SSC緩沖液的說明，參見薩姆布魯克，以下）。經常， 高嚴格洗滌之前會先進行低嚴格洗滌，以去除背景探針信號。對例如超過100個核苷酸的 雙鏈體進行中等嚴格洗滌的一個實例是在45°C下，1XSSC，持續15分鐘。對例如超過100 個核苷酸的雙鏈體進行低嚴格洗滌的一個實例是在40°C下，4-6XSSC，持續15分鐘。對于 短探針（例如，大約10到50個核苷酸），嚴格條件典型地涉及小于約LOM的Na離子的鹽 濃度，典型地約0. 01到I.OM的Na離子濃度（或其他鹽類），在pH7. 0到8. 3下，并且該溫 度典型地是至少約30°C。還可以通過加入去穩定劑（如甲酰胺）來實現嚴格條件。總體而 言，在具體的雜交檢驗中，信噪比是針對非相關的探針所觀測到的2倍（或更高）指示檢測 到特異性雜交。如果在嚴格條件下彼此不雜交的核酸所編碼的蛋白是實質上一致的，則它 們仍然是實質上一致的。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大程度的密碼子簡并而生成一 個核酸拷貝時發生這種情況。
[0127] "植物"是在發育的任何階段的任何植物，特別是種子植物。
[0128]如此處使用的"植物部分"是指植物的結構性和/或功能性亞單位，包括但不限于 植物細胞、植物組織、植物材料、植物器官、可收獲的植物部分等，如下文所定義的。
[0129] "可收獲的植物部分"是植物的一部分，是指該植物的那些在任何合適的時間可以 收獲的并且可被進一步處理用于工業用途或消費的部分，包括花、果、葉、種子、纖維等。
[0130] "植物細胞"是植物的結構和生理單位，包括原生質體和細胞壁。植物細胞可以呈 分離的單一細胞或培養細胞的形式，或作為高等組織化單位（如植物組織、植物器官或整 株植物）的一部分。
[0131] "植物細胞培養物"意指植物單元（例如像，原生質體、細胞培養物細胞、植物組織 中的細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及處于不同發育階段的胚）的培養物。
[0132] "植物材料"或"從植物可獲得的植物材料"是指葉、莖、根、花或花的部分、果實、花 粉、卵細胞、接合子、種子、切條、細胞或組織培養物、或植物的任何其他部分或產物。
[0133] "植物器官"是植物的一個獨特而明顯的已結構化并且分化的部分，如根、莖、葉、 花蕾或胚。
[0134]如在此使用的"植物組織"意指組織化成結構和功能單元的一組植物細胞。包括 植物中或培養物中的任何植物組織。這個術語包括但不限于：全株植物、植物器官、植物種 子、組織培養物以及被組織化成結構和/或功能單元的任何植物細胞群組。這個術語與以 上列出的或由該定義以其他方式涵蓋的任何具體類型的植物組織的聯合應用或單獨應用 并不旨在排除任何其他類型的植物組織。
[0135]如此處使用的，術語"群體"意指共享一個常見遺傳衍生的植物的遺傳上異質的集 合。
[0136]如此處使用的，術語"品種"或"栽培品種"意指可以通過結構特點和表現從相同 物種內的其他品種鑒定出來的一組相似的植物。
[0137] 如此處使用的，術語"植物轉化技術"涉及將一種轉基因（賦予特異性狀）引入宿 主植物。該轉基因被摻入宿主植物基因組并穩定地通過后代遺傳。將正確的調節序列添加 到感興趣的基因中，即啟動子和終止子，然后使用適合的載體將DNA轉運到植物細胞培養 物中。在一些實施例中，將該基因附接到一個選擇標記上，該選擇標記允許針對如上文所述 的轉基因的存在的選擇。一旦該植物組織被轉化，則選擇包含該轉基因的細胞并且重生回 完整植物。
[0138] 可以按多種不同的方式進行植物轉化用于產生具有使植物宿主能夠表達感興趣 的序列所需的委派功能的植物宿主，這取決于所討論的植物物種。例如，可使用土壤桿菌介 導的轉化來轉化根據本發明的植物。在這種轉化方法中，植物或植物組織（例如葉）被切 成小片，例如IOXl〇mm，并在包含懸浮的土壤桿菌（包含由土壤桿菌屬攜帶的一個Ti-質粒 載體）的一種液體中浸泡10分鐘（US5, 591，616;US4, 940, 838;US5, 464, 763)。放置在 選擇生根和發芽介質上，這些植物將會重新生長。
[0139] 非農桿菌技術涉及直接通過原生質體或細胞的外源基因材料的攝入。這些技術 包括但不限于PEG或電穿孔介導的攝入、粒子轟擊介導的遞送以及微注射。帕克沃斯基 (Paszkowski)等人，歐洲分子生物學組織雜志（EMBOJ.) 3, 2717-2722 (1984)，拍特里庫斯 (Potrykus)等人，分子與普通遺傳學（Mol.Gen.Genet.) 199, 169-177 (1985)，里奇（Reich) 等人，生物技術（Biotechnology)4:1001-1004(1986)，以及克萊恩（Klein)等人，自然 (Nature) 327, 70-73(1987)中描述了這些技術的實例。在每一情況下，使用標準技術將這些 轉化的細胞再生為完整的植物。例如，在金或鎢的粒子轟擊粒子內用DNA涂覆，并且然后將 其射入幼小植物細胞或植物胚胎中（US05100792;EP00444882B1;EP00434616B1)。一些 遺傳物質將停留在這些細胞中并轉化它們。還可使用這種方法來轉化植物質體。另外，可 使用電穿孔技術來轉化根據本發明的植物。在電穿孔中，使用電擊在細胞膜中制備瞬態孔 允許DNA進入該細胞。本發明中的另一種轉化技術可以是病毒轉化（轉導）。這里，將所希 望的遺傳物質裝入適合的植物病毒中并允許該修飾的病毒感染該植物。如果該遺傳物質是 DNA，它可以與該染色體重組以產生轉化的細胞。然而，大部分植物病毒的基因組由在受感 染細胞的細胞質中復制的單鏈RNA組成。
[0140]用根據本發明的核苷酸序列或載體對該植物或植物細胞進行的轉化或基因工程 可以通過標準方法（如例如描述于薩姆布魯克（Sambrook)和拉塞爾（Russell) (2001)，分 子克隆：實驗室手冊（MolecularCloning:ALaboratoryManual)，CSH出版社，冷泉港， NY，USA中的）開展。另外，本發明的轉基因植物細胞是在營養培養基中培養，滿足使用的具 體細胞的需求，特別是關于PH值、溫度、鹽濃度、通風、抗生素、維生素、微量元素等的需求。
[0141] 如此處使用的術語"載體"或"載體分子"可包括一種表達盒，該表達盒可包括可 操作地連接到所述多核苷酸的表達控制序列。這種或這些載體可以處于質粒的形式，并可 以單獨或與其他質粒組合使用，使用如以下所述的轉化方法將轉基因并入這種或這些植物 的遺傳物質中來提供轉化的植物。其他載體可包括粘粒、病毒、噬菌體和其他在基因工程中 常用的載體。
[0142] "轉基因"是指一個基因，該基因已經通過轉化被引入該基因組中并且被穩定地保 持。轉基因可以包括例如對于有待轉化的一個特定植物的基因而言或者是異源的或者是同 源的基因。此外，轉基因可以包括被插入非天然生物中的天然基因，或嵌合基因。
[0143] "編碼序列"是指對特定氨基酸序列進行編碼并排除非編碼序列的一個DNA或RNA 序列。它可由例如在cDNA中的一個"不間斷的編碼序列"構成，即缺乏內含子，或它可包括 以適合的剪接點為界的一個或多個內含子。"內含子"是RNA的一個序列，它包含在原轉錄 本中但通過該細胞內的RNA的裂解和再連接去除以建立可被翻譯為蛋白質的成熟mRNA。
[0144] 如此處使用的術語"表達盒"可由本發明的處于與控制其表達的調節核苷酸序列 可操作連接的一個或多個核苷酸序列構成。如本領域中已知的，一個表達盒可由一個啟動 子序列（啟動子）、一個開放閱讀框或其一個功能件、一個3'非翻譯區以及一個終止子序列 (終止子）組成。該盒可以是如上文中所述的一種載體分子的部分。只要使用正確的調節 序列，就可將不同的表達盒轉化到植物或植物細胞中。
[0145] 如在此使用的，術語"啟動子"是指一個核苷酸序列，通常在它的編碼序列的上游 (5'），它通過提供對適當的轉錄所要求的RNA聚合酶以及其他因子的識別來控制該編碼序 列的表達。"啟動子"包括一種最小的啟動子，該啟動子是一個短DNA序列，該序列是由一個 TATA盒以及其他多個序列（它們用來限定轉錄起始位點）構成，將調節元件加到該啟動子 上用于表達的控制。另外，"啟動子"也指一個核苷酸序列，該核苷酸序列包括一種最小的 啟動子加上調控元件，它能夠控制一個編碼序列或功能性RNA的表達。這種類型的啟動子 序列由近端以及更遠端的上游元件組成，這些后者元件經常被稱為增強子。因此，一種"增 強子"是一個DNA序列，它可以促進啟動子的活性并且可以是該啟動子或一種插入的異源元 件的一個固有元件以增強一種啟動子的水平或組織特異性。它能夠在兩個方向（正常或翻 轉）上進行操作，并且甚至當移動到該啟動子的上游或下游時還能夠發揮作用。增強子以 及其他上游啟動子元件均結合了介導它們的作用的序列特異性DNA結合蛋白。啟動子可以 是全部衍生自一種天然基因、或由衍生自在自然界中發現的不同啟動子的不同元件構成、 或甚至由合成的DNA區段構成。一種啟動子可能還包含參與蛋白因子的結合的DNA序列， 這些蛋白因子控制了響應于生理學的或發育狀況的轉錄起始的有效性。
[0146] "起始位點"是圍繞著該第一核苷酸的位置，該第一核苷酸是經轉錄的序列的一部 分，它還被定義為位置+1。相對于這個位置，對該基因的所有其他序列及其控制區域進行 編號。對下游序列（即，在3'方向上的其他蛋白編碼序列）進行正性命名，而對上游序列 (在5'方向上的大多數控制區域）進行負性命名。
[0147] 啟動子元件，特別是一種TATA元件（它們是無活性的或它們在上游激活作用不存 在時具有大大降低的啟動子活性）被稱為"最小或核心啟動子"。在一種適合的轉錄因子的 存在下，該最小啟動子發揮作用以允許轉錄。因此，一種"最小或核心啟動子"僅僅由轉錄 起始所需要的全部基礎元件組成，例如，一個TATA盒和/或一個起始子。
[0148] 根據本發明，術語"啟動子"是驅動基因轉錄的核酸（例如DNA)的一個調節區域。 啟動子典型地位于它們調節的基因的附近，在相同的鏈和上游（向著正義鏈的5'區域）處。 同其他可單獨或與其他啟動子組合使用的調節元件一樣，一些類型的啟動子是轉化領域內 熟知的。"植物啟動子"是能夠起始植物細胞中的轉錄的啟動子。發育控制下的啟動子的 實例包括涉及以下受調節的啟動子的"組織特異性啟動子"，這些受調節的啟動子不表達于 所有植物細胞中而是僅僅在特異器官（如，葉或種子）的一個或多個細胞類型、特異性組織 (如，胚或子葉）、或特異的細胞類型（如，葉實質或種子存儲細胞）中。這些還包括受時間 調節的啟動子，例如在胚形成的初期或晚期、在種子或果實發育的果實成熟期間、在葉子被 徹底分化中、或在衰老的起始時。
[0149] "細胞類型特異性啟動子或也被稱為"誘導型啟動子"主要通過外界刺激例如一 種化學品、光、激素、應激、或一種病原體，來驅動在一個或多個器官中的某些細胞類型（例 如，根或葉中的維管細胞）中的表達。
[0150] "組成型表達"是指使用一種組成型或受調節的（regulated)啟動子的表達。"有 條件的"和"受調節的表達"是指由一種受調節的啟動子所控制的表達。
[0151] "組成型啟動子"是指一種啟動子，該啟動子能夠在所有或幾乎所有的植物組織中 在植物的所有或幾乎所有的發育階段過程中表達它所控制的開放閱讀框（ORF)。這些轉錄 激活元件各自沒有展示出一種絕對的組織特異性，但是卻在大多數植物部分中以一種水平 來介導轉錄激活，該水平是該植物中的轉錄最有活性的部分中所達到的水平的多1%。
[0152] "受調節的啟動子"是指非組成型地、但是卻以一種暫時地和/或空間地調節方式 指導基因表達的啟動子，并且包括組織特異性啟動子以及誘導型啟動子這兩者。它包括自 然序列以及合成序列、連同可能是合成序列與自然序列的組合的多個序列。不同的啟動子 可以在不同的組織或細胞類型中、或在不同的發育階段、或響應于不同的環境條件來指導 一種基因的表達。在植物細胞中有用的不同類型的新型啟動子正不斷被發現，許多實例可 見于由奧卡穆羅（Okamur0)等人（1989)的編輯物中。在植物中有用的典型的受調節的啟 動子包括但不限于：安全劑誘導的啟動子、衍生自四環素誘導系統的啟動子、衍生自水楊酸 鹽（酯）誘導系統的啟動子、衍生自醇誘導系統的啟動子、衍生自糖皮質激素誘導系統的啟 動子、衍生自病原體誘導系統的啟動子、以及衍生自蛻皮激素（ecdysome)誘導系統的啟動 子。
[0153] "可操作地連接"是指在單核酸片段上的核酸序列的關聯，這樣使得一個的功能受 另一個的影響。例如，一個調節DNA序列被認為是"可操作地連接到"對一個RNA或一種多 肽進行編碼的一個DNA序列或"與之相關聯"，如果這兩個序列處于使得該調節DNA序列影 響該編碼DNA序列的表達（即該編碼序列或功能性RNA受該啟動子的轉錄控制）的狀況下。 編碼序列可操作地連接到正義或反義定向中的調節序列。
[0154] 在以上背景下，術語"終止子"涉及一個DNA序列的一個調節區域，其標記用于轉 錄的基因組DNA上的基因的末端，并且因此啟動相應基因的轉錄的終止。
[0155] 如此處使用的"表達"是指一種內源性基因、ORF或其部分、或一種轉基因在植物中 的轉錄和/或翻譯。例如，在反義構建體的情況下，表達可僅指該反義DNA的轉錄。另外， 表達是指正義（mRNA)或功能性RNA的轉錄和穩定累積。表達還可指蛋白質的產生。
[0156] "過表達"涉及轉基因細胞或生物中的表達水平超過正常或未轉化（非轉基因）細 胞或生物中的表達水平。
[0157] "反義抑制"是指能夠抑制蛋白質從內源基因或轉基因表達的反義RNA轉錄本的產 生。
[0158] "基因沉默"是指病毒基因、轉基因、或內源核基因的同源依賴抑制。當該抑制歸 因于受影響的基因的降低的轉錄時，基因沉默可以是轉錄的，或當該抑制歸因于與受影響 的基因同源的RNA種類的增加的周轉（降解）時，基因沉默可以是轉錄后的（英格利什 (English)等人，1996)。基因沉默包括病毒誘導性基因沉默（魯伊斯（Ruiz)等人，1998)。
[0159] 如此處使用的，術語"BAC"代表細菌人工染色體并基于功能性致育質粒定義了一 個DNA構建體，用于在細菌（例如大腸桿菌）中轉化和克隆。BAC可被用于對生物（例如植 物）的基因組進行測序。將該生物的DNA的一小塊在BAC中作為一個插入片段進行擴增， 并且然后進行測序。最終，將經測序的部分計算機模擬地重新排序，得到該生物的基因組序 列。
[0160] 如此處使用的，"增加的種子活力"是指種子以下各方面的能力：以均一的方式快 速萌發并達到萌發的高百分比；產生從土壤中快速出苗的幼苗并具有出苗的高百分比；產 生生長快速并表現對各種應激（包括但不限于寒冷）的出眾的耐受的幼苗。種子活力是上 述的參數中任一項以及這些的任意組合的量化。
[0161] "種子萌發"被定義為胚根從種皮中露出。
[0162] 下文的"萌發速度"是指種子吸脹和胚根從種皮中露出之間觀察到的平均時間。
[0163] 在本申請中，最后萌發速度可通過計算觀察到種子萌發50%所需的時間段來測量 (結果表示為T50測量）。
[0164] "增加的萌發速度"應被理解為包括根據實施例5的多核苷酸的種子與不包括所述 多核苷酸中的種子的萌發之間可觀察到的顯著差異。典型地，增加的萌發速度意為包括根 據實施例5的多核苷酸的種子比不包括SEQIDNO3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的種子 萌發更早。
[0165] "修飾的萌發速度"應被理解為包括根據實施例1至7的多核苷酸的種子與不包括 所述多核苷酸中的種子的萌發之間可觀察到的顯著差異。典型地，修飾的萌發速度意為包 括根據實施例1至7的多核苷酸的種子與不包括SEQIDNO1、2、3、4、5或6的種子不同地 萌發。
[0166] 如此處使用的，種子萌發均一性可被表示為10%萌發和90%萌發之間的時間。這 個時間段越短，種子萌發均一性越好。
[0167] "不利外部環境條件"是抑制或延緩該種子萌發或該幼苗出苗的條件。在本發明的 背景下，寒冷在其他事項中可被認為是不利于正常萌發條件的一個因子。
[0168] "出苗（幼苗的）"意在指該植物可觀察到的生長。
[0169]"增加的出苗"應被理解為包括根據實施例5的多核苷酸的種子與不包括SEQID NO3、4或6的種子的幼苗從種子中出苗之間可觀察到的顯著差異。
[0170] 本發明將從以下的非限制實例連同如下述的相關聯的序列表中更加顯而易見：
[0171] SEQIDN0 1:對應于BolαVGLa基因（At3g01060 基因的甘藍直系同源物）的 A12DHd等位基因的多核苷酸序列。
[0172]SEQIDNO2:對應于BolC.VG2.a基因（At3g01150基因的甘藍直系同源物）的 A12DHd等位基因的多核苷酸序列。
[0173]SEQIDNO3:對應于BolCVGLa基因（At3g01060基因的甘藍直系同源物）的 ⑶33DHd等位基因的多核苷酸序列。
[0174]SEQIDNO4:對應于BolC.VG2.a基因（At3g01150基因的甘藍直系同源物）的 ⑶33DHd等位基因的多核苷酸序列。
[0175]SEQIDNO5:對應于BolCVG2.b基因（At3g01150基因的甘藍直系同源物）的截 短的A12DHd等位基因的多核苷酸序列。
[0176]SEQIDNO6:對應于BolCVG2.b基因（At3g01150基因的甘藍直系同源物）的截 短的⑶33DHd等位基因的多核苷酸序列。
[0177] 附圖簡要說明
[0178] 圖1是來自代換系SL101(〇）和親本系（A12DHd( )和⑶DH33( ·))的種子 在15°C在水上的累積萌發曲線的圖解表示法。垂直線是標準誤差。
[0179] 圖2是SL101( ?)和復發的A12DHd( )親本以及交互的F1回交系 (A12DHdXSL101(A)和SL101XA12DHd(〇）的累積萌發曲線的圖解表示法。垂直線是標 準誤差。
[0180] 圖3是來自代換系SLlOl(A)以及親本系A12DHd(·)和⑶D33H()的種子 在大田中的累計出苗的圖解表示。
[0181] 圖4是說明代換系SLlOl(白色柱）和親本系⑶DH33(黑色柱）和A12DHd(灰色 柱）的種子的萌發過程中ABA的內源濃度的圖。
[0182] 圖5是說明3個KO系（對于基因At3g01060 (黑色柱）以及2個KO系（對于基 因At3g01150(灰色柱）中的種子萌發速度的圖。野生型對照系（白色柱）是colO。
[0183] 圖6是說明在溫室（更加有壓力的條件）中產生種子之后，與野生型對照系 ColO(黑色線）相比，KO系102(淡灰色線）和18(低中等灰色線）（對于基因At3g01060) 中以及KO系15(高中等灰色線）和3(深灰色線）（對于基因Atg01150)中的種子萌發速 度的圖。
[0184]實例1
[0185] 材料和方法
[0186] 種子生產和系的比較
[0187] 對于源于雙單倍體親本系A12DHd(芥藍變種）和⑶DH33(西蘭花變種；瑞伊（Rae) 等人，1999)的一系列甘藍染色體代換系，種子樣品是從英國伯明翰大學獲得。然后從這 些代換系和GDDH33親本的10株個體重復植物產生和收集大部分種子，并將作為代換系的 復發的A12DHd親本的20株植物與萌發試驗中的后者相比。如通過貝特艾（Bettey)等人 (2000)所述的在溫室中以16h白天16°C-18°C以及夜晚10°C-15°C將植物以10個重復 的隨機化區組安排。當在16h白天期間光強度跌到300wm2以下時，補充照明（400W高壓 鈉燈；歐司朗有限公司（OsramLtd)，圣海倫斯（StHelens)，UK)。通過在花開放之前將花 序封閉在包含綠頭蒼蠅的穿孔聚乙烯袋中使植物自體受粉。在收獲之前允許心皮在封閉的 袋子內的植物上完全干燥。在進行萌發試驗之前，清潔這些種子，在15%rh和15°C平衡， 并且然后儲存在_20°C。在15°C記錄從上述的10株重復植物（或20，A12DHd)中的每株采 集的15顆種子的4個重復在濕潤的濾紙上進行的累積萌發。先前的工作已顯示這是足夠 的種子（貝特艾（Bettey)等人，2000)。進行頻繁計數以允許來自這些測量的這個時間到 50%萌發的精確計算。萌發百分比在所有種子份中是高的。
[0188] 在后面的試驗中，以如上所述的相同方式產生來自交互回交的Fl種子。進行營期 授粉以進行雜交，獲得F1。同時產生來自親本系的種子用于比較，以將種子生產過程中的環 境差異的影響最小化。另外，在多種情況下，種子是在年度的不同時間在如上所述的溫室中 從親本A12DHd和代換系SLlOl的重復植物中產生的。盡管溫室的供暖、通風和照明設置如 上述的那些保持相同，但環境溫度不同并被記錄。
[0189] 萌發測定
[0190] 將來自代換系和親本系甘藍的50顆種子的三個生物重復或來自擬南芥野生型和 突變系的50顆種子的3至15個生物復制置于通過用水處理而保持濕潤的2層濾紙上萌發 (沃特曼國際有限公司（WhatmanInternationalLtd·)，UK) 〇
[0191] 在所有萌發試驗中，在濾紙上的種子保持在透明的聚苯乙烯箱中，這些聚苯乙烯 箱以隨機化區組安排并保持在黑暗中。沒有觀察到真菌感染的證據，并且因此未將種子進 行滅菌以避免影響萌發。時間間隔地記錄萌發（胚根露出），以構建累積萌發曲線。
[0192] 大田出苗
[0193] 作為來自甘藍基因型的出苗的更大的未公開的比較的部分，將親本系GDDH33、 A12DHd和代換系SLlOl的100顆種子按隨機化區組安排在5月31以4個重復Im行進行播 種。種子是通過手動以15_深犁溝播種，用篩過的土壤（篩孔尺寸〈4_)覆蓋，并用斯坦 哈伊（Stanhay)條播機壓土輪將表面滾壓一次。該土壤是沙壤土，并實施灌溉以在種子萌 發和出苗期間維持土壤水分。定期記錄后者直至沒有更多幼苗出苗。
[0194] 激素分析
[0195] 將來自代換系和親本系的種子樣品作為未吸脹的干種子，并將種子在15°C濕潤的 濾紙上吸脹24和48小時。在吸脹前，將包含Ig干種子的每個樣品進行測量。立即將這些樣 品置于液氮中，凍干并且然后在_20°C置于家用冷凍機中直至萃取。這些樣品處于IOml冷 的（4°C)80%甲醇（包含20mg1-1BHT)中，然后添加500ngABA和IOOngGA標準中的每 個。將這些樣品在冷柜中攪拌過夜，并且然后離心。傾析上清液并將該沉淀重懸于另外IOml 的80%甲醇中。將這些樣品攪拌4h，離心并合并上清液。將上清液蒸發至水性（c.3-4ml) 并添加IOml0. 5MpH8.2磷酸鹽緩沖液，將樣品用2X15ml二氯甲烷進行分配，并棄去二 氯甲烷。將水性餾分用IM磷酸調節至pH3,用3X15ml乙酸乙酯進行分配。
[0196] 將合并的乙酸乙酯用2X3. 5mlpH3.0水進行洗滌，并蒸發至干燥，重溶于5ml水 中，并且將pH調節至8。然后將該溶液裝載到QMA連接柱，隨后將該連接柱用5ml15%甲醇 pH8. 0進行洗滌。將GA和ABA用5 %甲醇中的0. 2M甲酸從該QMA連接柱直接洗脫到C1821 連接柱。然后將C18連接柱用5ml20%甲醇進行洗滌，并在5ml80%甲醇中回收樣品，并 蒸發至干燥。然后將樣品溶于甲醇中，并且用過量含醚的重氮甲烷進行甲基化。在蒸發至 干燥以后，將樣品重溶于干乙酸乙酯中，并通過氨基連接柱。將所得到的樣品通過GC-MS直 接分析ABA含量，然后蒸發至干燥，并在通過GC-MS分析GA含量之前重溶于BSTFA。
[0197] 標記分析
[0198]引物對被設計為30個擬南芥基因模型，這些基因模型間隔地橫跨SOGl區域傳 播，使用引物 3(Primer3)軟件（http://gene.pbi.nrc.ca/cgibin/prime;r/p;rimer3_www· cgi)和來自泰爾（Tair) ( http://www.arabidopsis.org/)的基因數據給出從 200 至 700bp 的PCR產物。使用的PCR混合是標準的，但使用了 一個觸地程序（touch-downprogram)。 這由如下的循環參數組成：94°C持續5min;然后在65°C至55°C退火持續10個循環，每個循 環降低1度，在72°C延伸30s并在94°C變性30s經10個循環；接著94°C30s、55°C30s、 72°C45s循環30次；并在72°C最終延伸15min。給出多態結果的這些基因模型的引物序 列被選作標記（表1)。
[0199] 數據分析
[0200] 使用統計包Genstat5 (佩恩（Payne)等人1993)進行所有分析，并且合適時，使 所有數據經受方差分析。
[0201] 結果
[0202] 針對確認的和精細測譜的連鎖群Cl的萌發速度（SOGl)的QTL
[0203] 比較代換系和親本系的萌發數據的方差分析顯示⑶DH33親本比A12DHd親本萌 發顯著地（P〈0. 001)更快，證實萌發等位基因的正速度是由⑶DH33提供，如通過貝特艾 (Bettey)等人（2000)(圖 1)顯示的。存在 4 個跨越SOGlQTL(SL101、SL111、SL118、SL119) 的代換系，并且所有這些顯著（P〈〇.〇〇5)比A12DHd親本更快萌發。與A12DHd相比，代換系 SLlOl具有最小的提高萌發速度的滲入區域（l-9cM;瑞伊（Rae)等人，1999)并且占據這些 親本系（圖1)之間的萌發速度差異的大部分并因此被選擇用于SOGl的進一步研宄。
[0204] SOGl快速萌發表型不受母體基因型的影響
[0205] 萌發速度由胚胎確定，但還可被圍繞它的本源上是母體的組織顯著影響。進行 SLlOl和A12DHd之間以及⑶DH33和A12DHd之間的交互回交，以確定在SOGl基因座處的 母體和接合子的遺傳組分。記錄來自每次雜交的Fl種子以及來自同時產生的自交親本系 的種子的萌發。在SLlOl和來自與A12DHd(SL101為母本植物并且花粉來自A12DHd，并且 反之亦然）的交互回交的Fl中的萌發速度不存在顯著差異，但來自所有三種的種子比來自 A12DHd的種子顯著（P〈0. 01)萌發更快（圖2)。這顯示占主導的⑶DH33等位基因更快的 萌發對證實基于胚胎的性狀的繼承沒有遺傳母體影響。
[0206] 萌發速度中的差異導致大田中出苗時機的差異
[0207] 以上數據顯示⑶DH33和SLlOl種子的萌發速度比A12DHd的在恒定溫度條件下顯 著更大。在大田中，這導致來自⑶DH33和SLlOl的出苗比來自A12DHd的顯著更早（圖3)。
[0208] 成熟時內源ABA濃度在基因型之間不同
[0209] 使用GCMS測量ABA在這三種基因型的干燥和吸脹種子中的內源濃度。在SLlOl 和GD33的干燥種子中或在胚根露出之前吸脹到48小時過程中ABA內源濃度不存在顯著差 異。這兩個種子份中的ABA濃度在第一個24小時保持相同，并且然后通過48小時降低到 它的一半。相比之下，A12DHd的種子中的ABA的內源濃度初始為SLlOl和⑶DH33中的三 倍更高，并且然后經吸脹的48小時時間逐漸降低，但保持顯著高于其他兩個種子份（圖4)。 有趣地是，如果A12DHd中的ABA以相同速度繼續下降，在72小時之后它將達到與其他兩個 系萌發前看到的相同水平（萌發點）。
[0210] 此處呈現的⑶DH33、SL101和A12DHD系的結果顯示更高的內源ABA含量和更低的 萌發速度之間的清晰的遺傳確定關系，并且反之亦然。
[0211] 已進行甘藍中萌發速度性狀的數量遺傳學分析。
[0212] 通過以前述代換系SLlOl對QTL精細作圖，我們最終鑒定了QTL(萌發速度 (SOGl))下面的兩個基因。在甘藍中的緩慢萌發親本（A12,羽衣甘藍（Kale))的背景下，來 自快速萌發親本（⑶33,西蘭花（Broccoli))的Cl的端粒端處，該系SLlOl具有短滲。通過 使用橫跨SLlOl的這個滲入區域的標記，在1，300個系內鑒定了沿著此區域的30個重組， 這歸功于BAC耕種路徑策略。這一策略允許將這些系聚集到5個有區別的群組和這2個親 本系中。然后對這7個群組全部評價種子萌發，并且統計分析揭示更快的萌發與Cl的端粒 端處的2個標記相關聯。通過熒光原位雜交進一步評估這些標記與Cl的端粒端處的單BAC 的共定位。對BAC進行測序，并發現12個全長基因存在其中。
[0213] 在擬南芥中在染色體3的上臂（一個SOGlQTL位于此）處已經鑒定了這些蕓苔屬 基因的假定直系同源物（克列爾科斯（Clerkx)等人2004)基于甘藍中的Cl的端粒端和擬 南芥中的染色體3的上臂（參見以上和以下）之間的良好的遺傳共線性，有理由認為在蕓 苔屬和在擬南芥中鑒定的基因共享種子萌發中的常見功能。為了加強我們的假設，我們已 經鑒定了已在蕓苔屬中發現的那些的假定直系同源基因中的擬南芥敲除（KO)突變系。發 現這些KO系中的兩個具有顯著的萌發表型（與對照ColO系相比更快萌發），表明這些基因 充當萌發的負調節物（圖5)。有趣地，注意到使用至少兩個不同KO系來評估萌發表型，而 且這些有區別的KO系針對萌發速度顯示相似的結果。當在更有壓力的條件下產生種子后 評估時（圖6)，結果是非常可比的。
[0214] 因此，這種功能性研宄已證實Atg01060和Atg01150基因在調節種子活力、特別地 在調節萌發速度中的作用。這些基因BolC.VGLa和BolC.VGLb(已在甘藍中的SOGlQTL 內鑒定的）的蕓苔屬直系同源物可因此真正被認為是允許在十字花科中調節種子活力、更 特別地調節種子萌發速度的工具。
[0215] 證實了甘藍連鎖群Cl和擬南芥的染色體三的上臂之間的連鎖
[0216] 以上對SLlOl的研宄已經顯示在連鎖群Cl(LGCl)的端粒端處的單滲入區域包含 針對SOGl的QTL。在當前工作中我們目的在于在甘藍和擬南芥基因組中的這個區域之間 建立共線性，以使得能夠與在該模型物種中進行的廣泛QTL分析進行比較。先前已顯示在 蕓苔屬基因組和擬南芥之間有多個連鎖（科根（Cogan)等人，2004;帕金（Parkin)等人， 2005)〇
[0217] 特別地，LGCl和擬南芥之間的連鎖（科根（Cogan)等人，2004)被利用于促進其 他信息標記的開發。使用這種途徑，對30個擬南芥基因模型設計了引物對，其跨這個區域 分布。對這些引物進行測試來確定它們是否擴增了一個甘藍產物并且然后在SLlOl和親本 系A12DHd和⑶33DHd之間是否存在任何多態性（表1)。在SLlOl和⑶33DHd中相同但與 A12DHd中的不同的帶型表明在這個基因座中它的存在，并且因此表明它作為用于SOGl的 一個標記的有用性。用于三個基因模型的引物被鑒定為信息標記（At3g01190、At3g07130、 At3g02420,表1)，其錨定擬南芥染色體三的上臂和甘藍LGCl的SOGl區域之間的連鎖。對 共線性的證實證明了SOGl與對于定位于擬南芥基因組的這個區域的種子性能的QTL的比 較是合理的。
[0218]
【權利要求】
1. 一種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包括選自下組的一種核酸分子，該組由 以下各項組成： a. -種包括如在SEQ ID NO: I (BolC. VGL a的A12版本）中描述的核苷酸序列的核酸 分子； b. -種包括如在SEQ ID NO: 2 (BolC. VG2. a的A12版本）中描述的核苷酸序列的核酸 分子； c. 一種包括如在SEQ ID NO: 3 (BolC. VGL a的⑶33版本）中描述的核苷酸序列的核酸 分子； d. -種包括如在SEQ ID NO:4 (BolC. VG2. a的⑶33版本）中描述的核苷酸序列的核酸 分子； e. -種包括其互補鏈與a)_d)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核酸分 子； f. 一種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_e)中任一項所定義的核苷酸序列的核苷酸 序列的核酸分子； 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_f)中任一項所定義的核酸分子導 致修飾的種子活力。
2. 根據權利要求1所述的多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包括選自下組的一 種核酸分子，該組進一步由以下各項組成： a. -種包括如在SEQ ID NO: 5 (BolC. VG2.b的截短的A12等位基因）中描述的核苷酸 序列的核酸分子； b. -種包括如在SEQ ID NO: 6 (BolC. VG2.b的截短的⑶33等位基因）中描述的核苷酸 序列的核酸分子； c. 一種包括其互補鏈與a)_b)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核酸分 子； d. -種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_c)中任一項所定義的核苷酸序列的核苷酸 序列的核酸分子； 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_d)中任一項所定義的核酸分子導 致修飾的種子活力。
3. -種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包括選自下組的一種核酸分子，該組由 以下各項組成： a. 包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少60%序列一致性的核苷酸序列 的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ; b. 包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少80%序列一致性的核苷酸序列 的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ; c. 包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少90%序列一致性的核苷酸序列 的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ; d. 包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少95%序列一致性的核苷酸序列 的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ; e. 包括與如在下組中描述的序列中的任一項具有至少98%序列一致性的核苷酸序列 的核酸分子，該組包括：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 以及 SEQ ID NO:6 ; f. 包括其互補鏈與a)-e)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核酸分子； g. 包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_f)中任一項所定義的核苷酸序列的核苷酸序列 的核酸分子； 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_g)中任一項所定義的核酸分子導 致修飾的種子活力。
4. 根據權利要求1至3所述的多核苷酸，其中該修飾的種子活力表型由在下組中選擇 的一個另外的表型表征，該組包括：修飾的萌發速度、修飾的出苗速度、修飾的種子萌發均 一性、修飾的出苗均一性、修飾的種子萌發百分比、修飾的該種子相對于外部環境和/或母 體條件的耐受性、修飾的對ABA的敏感性或修飾的ABA含量。
5. -種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包括在下組中選擇的一種核酸分子，該 組包括： a. -種包括如在SEQ ID N0:3中描述的核苷酸序列的核酸分子； b. -種包括如在SEQ ID N0:4中描述的核苷酸序列的核酸分子； c. 一種包括如在SEQ ID N0:6中描述的核苷酸序列的核酸分子； d. -種包括其互補鏈與a)_c)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核酸分 子； e. -種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_d)中任一項所定義的核苷酸序列的核苷酸 序列的核酸分子； 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_e)中任一項所定義的核酸分子導 致增加的種子活力。
6. 根據權利要求5所述的多核苷酸，其中該增加的種子活力表型由在下組中選擇的一 個另外的表型表征，該組包括：增加的萌發速度、增加的出苗速度、增加的種子萌發均一性、 增加的出苗均一性、增加的種子萌發百分比、增加的該種子相對于外部環境和/或母體條 件的耐受性、降低的對ABA的敏感性或降低的ABA含量。
7. -種多核苷酸，特別地一種分離的多核苷酸，包括在下組中選擇的一種核酸分子，該 組包括： a. -種包括如在SEQ ID NO: 1中描述的核苷酸序列的核酸分子； b. -種包括如在SEQ ID N0:2中描述的核苷酸序列的核酸分子； c. 一種包括如在SEQ ID N0:5中描述的核苷酸序列的核酸分子； d. -種包括其互補鏈與a)至c)中任一項所述的核酸分子雜交的核苷酸序列的核酸分 子； e. -種包括由于簡并遺傳密碼而偏離a)_d)中任一項所定義的核苷酸序列的核苷酸 序列的核酸分子； 其中在一種植物或植物部分中表達后，所述的如a)_e)中任一項所定義的核酸分子導 致降低的種子活力。
8. -種表達盒，包括以上權利要求中任一項所述的多核苷酸。
9. 一種載體分子，包括根據權利要求8所述的表達盒。
10. 根據權利要求1至3所述的多核苷酸用于修飾種子活力的用途。
11. 用于修飾種子活力的一種方法，該方法包括：通過雜交或通過植物轉化技術將權 利要求1至10中任一項所述的多核苷酸、表達盒或載體分子滲入一種植物或植物部分中并 在其中表達。
12. 用于產生具有修飾的種子活力的種子的一種方法，包括： a. 獲得一種第一植物，該第一植物被證實包含權利要求1至7中任一項所述的多核苷 酸； b. 使所述第一植物與被證實缺乏所述多核苷酸的一種第二植物雜交；并且 c. 鑒定從該雜交中得到的一種植物種子，與由該第二植物產生的種子相比，該植物種 子展現修飾的種子活力。
13. -種植物或植物部分，該植物或植物部分在其基因組內包含包括權利要求1至9中 任一項所述的多核苷酸、表達盒或載體分子的滲入，并且與不包括所述多核苷酸、表達盒或 載體分子的一種植物或植物部分相比，展現種子活力的修飾。
14. 一種植物或植物部分，該植物或植物部分在其基因組內包含包括根據權利要求5 所述的多核苷酸的滲入，并且與由不包括所述多核苷酸的一種植物或植物部分產生的種子 相比，展現增加的種子活力。
15. -種植物或植物部分，該植物或植物部分在其基因組內包含包括根據權利要求7 所述的多核苷酸的滲入，并且與由不包括所述多核苷酸的一種植物或植物部分產生的種子 相比，展現降低的種子活力。
16. 用于選擇具有修飾的種子活力的植物或植物部分的一種方法，包括在待測的植物 或植物部分中檢測存在或不存在根據權利要求1至7中任一項所述的多核苷酸。
17. 用于選擇具有修飾的種子活力的植物或植物部分的一種方法，包括使候選植物或 植物部分接觸一種選自下組的選擇工具，該組包括權利要求1至7中任一項所述的多核苷 酸。
18. 根據以上權利要求中任一項所述的植物或植物部分，該植物或植物部分是栽培的 植物或栽培的植物部分，并且是在下組中選擇的，該組包括甘藍、甘藍型油菜、白菜型油菜、 蕓苔、芥菜、黑芥、大白菜、小白菜、塌棵菜、蕓芥、芝麻菜、蘿卜、家獨行菜、豆瓣菜、山葵。
19. 根據權利要求13至15或權利要求18所述的植物或植物部分，其中所述植物是一 種雜種植物。
20. 根據權利要求19所述的植物或植物部分，可從保藏于NCIMB的保藏號NCIMB 41951下的種子或其子代獲得。
21. 用于獲得具有修飾的種子活力的植物或植物部分的一種非生物方法，包括將根據 權利要求1至7中任一項所述的多核苷酸引入所述植物或植物部分的基因組中。
22. 根據權利要求16所述的方法，包括（a)獲得被證實包含權利要求1至7中任一項 所述的多核苷酸的一種第一植物；(b)使所述第一植物與被證實缺乏所述多核苷酸的一種 第二植物雜交；并且（C)鑒定從該雜交中得到的展現修飾的種子活力并包含所述多核苷酸 的一種植物。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中該多核苷酸的存在是通過使用一個分子標記， 特別地通過一種物理地定位于包含該多核苷酸的遺傳基因座的內部或外部的一個位置處 的分子標記來證實的。
24. 根據權利要求22所述的方法，其中該多核苷酸的存在是通過使用至少兩個分子標 記，特別地通過至少兩個物理地定位于包含該多核苷酸的遺傳基因座的側翼的一個位置處 的分子標記來證實的。
25. -種包括根據權利要求1至7所述的多核苷酸的種子，其中用任意類型的包衣對所 述種子進行包衣。
【文檔編號】C07K14/415GK104520312SQ201380011632
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年2月27日 優先權日:2012年2月29日
【發明者】W·E·芬奇薩維奇, K·莫里斯, G·C·貝克爾, T·G·布魯格金克, P·范登維金加德 申請人:先正達參股股份有限公司