氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在dna測序中的用途
【專利摘要】本發明公開了一種氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途；所述合成方法包括如下步驟：式(Ⅲ)化合物在堿性條件下去保護基得式(Ⅱ)化合物；進一步去甲基得式(Ⅰ)化合物，即7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷；其中，R1為H或OH，R2為I、Br或Cl，R3為H或本發明的氮雜化鳥嘌呤核苷是用于DNA測序的新型試劑，與8位未取代氮的鳥嘌呤核苷相比，具有更好的堿基識別效果、更穩定的DNA鏈結構。同時，現有技術中8位氮取代鳥嘌呤核苷的合成方法復雜，產率低，尚未商業化生產，而本發明的合成方法所需原料簡單易得，采用常規化學合成反應，且收率較高，適用于廣泛推廣使用。
【專利說明】氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及化學合成和生物化學領域，具體涉及一種氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途。
【背景技術】
[0002]2001年人類基因組工作草圖的發表，標志著后基因組時代的到來，人們對測序技術的需求沒有減少反而增加，DNA測序技術依舊處于高速發展時期。近年來，人類基因組計劃促進了 DNA測序效率的提高和測序成本的下降，但是目前的DNA測序方法依然存在成本高和耗時長的問題，這影響了 DNA測序技術的市場化應用，阻礙了科學的發展。科學家們一直致力于發展高通量、低成本的測序技術，因此，三代高通量測序技術即單分子測序技術應運而生。
[0003]三代測序技術的核心是直接對單個DNA分子進行測序，不做任何的DNA擴增反應，從而減少成本，提高通量。單分子測序技術雖然已有商業化產品，但是都還存在技術上的難點，尚未達到規模化測序的要求。盡管如此，當前國內市場上的高通量測序平臺仍被進口產品所壟斷，產品范圍涵蓋了測序平臺中的硬件和試劑等配套產品。因此，國家863計劃、973計劃和“十二五”技術都將研發新一代測序技術及配套產品的研發列為重點發展方向，旨在改變目前的市場格局，建立我國自主的高通量測序平臺，是一項具有戰略性的意義工作。
[0004]DNA合成測序的可逆終端選取U，C，A，G四個堿基的核苷酸與敏感性連接單元和熒光標記化合物，通過化學合成方式得到。合成測序的首要工作是合成四個不同堿基核苷酸及其衍生物。文獻報道發現，四個不同堿基(U，C，A，G)的含取代基核苷及其衍生物，合成方式復雜且價格高昂。與此同時，8位取代氮的鳥嘌呤核苷被證明具有優良的生物活性和測序識別效果，但該種鳥嘌呤核苷及其衍生物的合成報道尚未報道。合成8位取代氮的鳥嘌呤核苷及其衍生物具有廣闊的理論研究價值和市場應用前景。我們在專利申請CN201310489397.0, CN201310489350.4中分別報道了鳥嘌呤核苷兩種不同的合成方法，本發明中8位取代氮的鳥嘌呤核苷包括7-去氮-7-鹵素-8-氮-2’ -脫氧鳥嘌呤核苷和7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷，其具有更佳的測序識別效果和生物活性，并且合成方法更高效而實用，反應條件溫和，反應過程有效且可控，適用于大規模生產。專利CN201310489350.4和專利CN201310489397.0中，糖苷化反應所需原料價格高昂，反應的產率很低，不適用于規模化生產。本專利中選取簡單易得的原料，高產率地首次合成了 7-去氮-7-鹵素-8-氮-2 ’ -脫氧鳥嘌呤核苷和7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷，進而合成得到可被聚合酶識別的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮_2’_脫氧鳥嘌呤核苷酸和7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鳥嘌呤核苷酸，從而參與DNA與RNA鏈延伸反應，達到單分子測序的效果。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種氮雜化鳥嘌呤核苷及其合成方法和在DNA測序中的用途。具體提供了氮雜化鳥嘌呤核苷酸的合成方法，中間體化合物7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷、7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2脫氧鳥嘌呤核苷酸以及化合物7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鳥嘌呤核苷酸的合成方法；本發明的方法合成原料簡單易得，反應條件溫和，作簡單，適用于規模化生產。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]第一方面，本發明涉及一種7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括如下步驟:
[0008]A、式(III)化合物在堿性條件下去保護基得式(II )化合物；
[0009]B、所述式(II )化合物在堿性條件下去甲基得式(I )化合物，即所述7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷；
【權利要求】
1.一種7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: A、式(III)化合物在堿性條件下去保護基得式(II)化合物； B、所述式(II)化合物在堿性條件下去甲基得式(I )化合物，即所述7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷；
2.如權利要求1所述的7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述式(III)化合物通過式(IV)化合物與式(VI)化合物發生糖苷化反應制備而得，
3.如權利要求2所述的7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷的合成方法，其特征在
于，所述式(IV )化合物通過在式(V)化合物
4.如權利要求3所述的7-去氮-7-鹵素-8-氮-鳥嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述式(V)化合物是通過如下步驟制備而得的: A、式(VDI)化合物的合成:2_氨基-4，6-二羥基嘧啶在三氯氧磷的作用下，反應得到式(VDI)化合物，
5.一種7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’ -脫氧鳥嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: A、化合物dG(8-aza)(AP3)的合成:在Cu1、Pd (PPh3) 4和TEA存在的條件下，三氟乙酰丙炔胺和由如權利要求1所述的方法合成得到的式(I )化合物反應，得化合物dG(8_aza)(AP3)，式(I )中 R1 為 H，
6.—種7-去氮-rJ-丙炔胺-8-氮-鳥嘌呤核苷酸的合成方法,其特征在于，所述方法包括如下步驟: A、化合物G(8-aza)(AP3)的合成:在Cul、Pd(PPh3)4和TEA存在的條件下，三氟乙酰丙炔胺和由如權利要求1所述的方法合成得到的式(I )化合物反應，得化合物G(8-aza)(AP3)，式(I )中 R1 為 0H，
7.—種如權利要求5所述的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’ -脫氧鳥嘌呤核苷酸在參與DNA鏈延伸反應中的用途。
8.—種如權利要求5所述的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’ -脫氧鳥嘌呤核苷酸在合成熒光素標記氮雜化鳥嘌呤核苷酸作為可逆終端中的用途。
9.一種熒光素標記氮雜化鳥嘌呤核苷酸可逆終端dG (8-aza) TP (AP3)-SS-Texas Red的合成方法，其特征在于，包括如下步驟: A、化合物dG(8-aza) (AP3) -SPDP的合成:在TEA存在的條件下，如權利要求5所述的化合物 dG (8-aza) (AP3)和 SPDP 反應，得化合物 dG(8_aza) (AP3) -SPDP,
10.一種如權利要求9所述的熒光素標記氮雜化鳥嘌呤核苷酸可逆終端dG(8_aza)TP (AP3) -SS-Texas Red 在 DNA 測序中的用途。
【文檔編號】C07H1/04GK103804447SQ201410055242
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月18日 優先權日:2014年2月18日
【發明者】沈玉梅, 魏曉飛, 龔兵, 胡蔚, 姜玉, 趙小東, 邵志峰, 李小衛, 伍新燕, 湯道年, 劉亞智 申請人:上海交通大學