一種用于分離純化gst標簽融合蛋白的磁性親和納米材料及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于分離純化GST標簽融合蛋白的磁性親和納米材料及其制備方法和應用。所述磁性親和納米材料包括：四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面固定有還原型谷胱甘肽。本發明所提供的磁性親和納米材料具有較大的比表面積，提高了該納米材料和蛋白分子之間的結合速率和結合量，具有的超順磁特性同時簡化了分離過程的操作強度，并且該磁性親和納米材料的制備方法簡單、價廉，用于分離純化GST融合蛋白的過程簡便、快速、有效，在生物【技術領域】具有廣泛的應用前景和實用價值。
【專利說明】一種用于分離純化GST標簽融合蛋白的磁性親和納米材料及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物材料【技術領域】，更具體地涉及一種用于分離純化GST標簽融合蛋白的磁性親和納米材料及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]在生物技術研究領域，蛋白質的分離純化是一個非常重要的環節，尤其在蛋白質組學的研究中，復雜的組成以及極低的蛋白含量更增加了蛋白分離純化的難度。融合標簽技術的發展為蛋白質的分離純化提供了一條更加簡便的途徑。融合標簽技術主要通過重組DNA技術在目標蛋白編碼基因的3’或5’端融合特定標簽的編碼基因并在合適的表達宿主中表達重組蛋白。利用固定化特異配體和重組蛋白的融合標簽之間的親和作用，能夠快速有效實現目標蛋白的分離純化。其中，谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)融合標簽是目前應用廣泛的融合標簽之一，該標簽能與還原型谷胱甘肽(GSH)發生酶-底物的特異性結合，因此將GSH固定在特定的載體上能實現GST融合蛋白的分離純化。
[0003]通常而言，采用GST融合標簽的純化系統多采用柱層析法，但是這種方法存在操作過程繁瑣，耗時長等缺點。近年來發展的磁性親和納米材料技術得到密切關注，該技術大大簡化了純化的流程，通過磁性分離的方法有效縮短了純化時間，此外該技術還能從極低濃度的樣品中對目標蛋白進行富集分離。雖然目前國內外已經報道了多種用于純化GST融合蛋白的磁性親和納米材料,例如，Pan等人在2011年在Chemical Science發表了 一 篇文章 “Glutathione (GSH)-decorated magnetic nanoparticles for bindingglutathione-S-transferase (GST) fusion protein and manipulating live cells，，,其中記載了先通過兩步化學反應將GSH和多巴胺連接，然后用于修飾磁性四氧化三鐵納米材料制備得到磁性親和材料用于GST標簽蛋白的分離。但是這種材料的合成和修飾過程復雜，成本高。因此,開發一種特異性高、合成過程簡單,成本低的GST融合標簽磁性親和納米材料一直是本領域當前的研究熱點。
[0004]近幾年來研究者通過對海洋貽貝類生物粘附蛋白結構組成剖析研究發現多巴胺能在弱堿性條件發生自聚，并在幾乎任何材料的表面形成涂層，更為重要的是該涂層能進一步與其他生物大分子發生粘連。深入的研究發現這種粘連優先通過聚多巴胺中的鄰苯二酚官能團和生物大分子的巰基之間反應產生。利用該特性，聚多巴胺涂層修飾的材料可以用于生物大分子例如酶、細胞、DNA、抗體的固定化，但是，到目前為止，還沒有出現將聚多巴胺用于GST融合蛋白分離純化的相關研究。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種用于分離純化GST標簽融合蛋白的磁性親和納米材料及其制備方法和應用，從而解決現有技術中的用于GST標簽融合蛋白純化的磁性親和納米材料合成與修飾過程復雜，成本價格較高的缺陷，以及現有技術中缺少一種簡單即可實現對GST標簽融合蛋白的分離純化方法。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:
[0007]提供一種用于分離純化GST標簽融合蛋白的磁性親和納米材料，包括:四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面固定有還原型谷胱甘肽。
[0008]所述還原型谷胱甘肽通過所述聚多巴胺涂層表面富含的鄰苯二酚基團固定。
[0009]還提供一種如上所述的磁性親和納米材料的制備方法，包括以下步驟:1)提供多巴胺溶液，向所述多巴胺溶液中加入四氧化三鐵納米顆粒，攪拌，磁性分離獲得聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒；2)提供還原型谷胱甘肽溶液，將步驟I)中制備的所述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒分散到所述還原型谷胱甘肽溶液中，攪拌，磁性分離獲得所述磁性親和納米材料。
[0010]步驟I)中所述多巴胺溶液濃度為0.l-5mg/mL,加入的所述四氧化三鐵納米顆粒濃度為0.5-5mg/mL(優選為lmg/mL)，攪拌時間為0.5_5h，步驟2)中所述還原型谷胱甘肽溶液濃度為1-lOmg/mL，加入的所述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒的濃度為0.5_5mg/mL (優選為lmg/mL),攪拌時間為6_12h。
[0011 ] 優選地，所述還原型谷胱甘肽與所述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒的比例為 2:1。
[0012]其中，所述四氧化三鐵納米顆粒采用以下方法制備:將FeCl3.6Η20和FeCl2.4Η20按照摩爾比2:1的比例在氮氣保護下溶解于超純水中，用NaOH調節溶液pH至9.0左右，40°C攪拌2小時后采用磁性分離獲得所述四氧化三鐵納米顆粒。
[0013]該方法的主要原理是通過多巴胺在弱堿性條件下在四氧化三鐵納米顆粒表面包裹形成聚多巴胺涂層，通過聚多巴胺富含的鄰苯二酚基團將還原型谷胱甘肽固定在材料表面，利用GSH和GST標簽之間的特異性結合實現GST融合蛋白的分離純化。
[0014]還提供一種如上所述的磁性親和納米材料在GST標簽融合蛋白的分離純化中的應用。
[0015]該應用包括以下步驟:1)提供根據權利要求1所述的磁性親和納米材料，加入細胞裂解液，振蕩孵育，磁分離回收所述磁性親和納米材料；2)提供洗滌緩沖液，向步驟I)中回收的所述磁性親和納米材料中加入所述洗滌緩沖液，通過磁分離反復清洗回收所述磁性親和納米材料；3)提供洗脫緩沖液，向步驟2)中清洗后的所述磁性親和納米材料中加入所述洗脫緩沖液，振蕩孵育，通過磁分離獲得洗脫液，所述洗脫液中含有經過分離純化的GST標簽融合蛋白。
[0016]優選地，所述細胞裂解液為重組大腸桿菌裂解液，表達GST標簽融合的綠色熒光蛋白或GST標簽融合的脂肪酶。
[0017]優選地，步驟I)中的所述細胞裂解液的總蛋白濃度為0.5_2mg/mL，加入的所述磁性親和納米材料濃度為1-lOmg/mL，孵育的時間為0.5_lh。
[0018]優選地，步驟2)中的所述洗滌緩沖液成分為50mM、pH7.4的Tris-HCl緩沖液、Triton X-100 (0.5%w/v)、500mM NaCl，步驟3)中的所述洗脫緩沖液成分為50mM、pH8.0的Tris-HCl 緩沖液、Triton X-100 (0.5%w/v)、500mM NaCl、50mM 還原型谷胱甘肽。
[0019]本發明利用多巴胺在弱堿性條件下自聚的特性將其修飾在四氧化三鐵納米顆粒的表面，利用聚多巴胺膜富含的鄰苯二酚官能團與還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基反應制備得到表面修飾有GSH的磁性親和納米材料，所提供的磁性親和納米材料具有較大的比表面積，提高了材料和蛋白分子之間的結合速率和結合量，四氧化三鐵納米顆粒的超順磁特性簡化了分離過程的操作強度，利用材料表面固定的GSH實現對GST融合蛋白的選擇性結合，通過高濃度GSH溶液與GST之間的競爭作用實現了材料結合GST融合蛋白的洗脫。本發明所提出的磁性親和納米材料制備方法簡單、廉價，該材料用于分離純化GST融合蛋白的過程簡便、快速、有效，因此該技術在生物【技術領域】具有廣泛的應用前景和實用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是采用本發明的技術方案分離純化GST融合綠色熒光蛋白的電泳圖結果，其中，1:蛋白質分子量標準；2:細胞裂解液；3:穿出液；4:洗滌液；5:洗脫液；
[0021]圖2是采用本發明的技術方案分離純化GST融合脂肪酶的電泳圖結果，其中，1:蛋白質分子量標準；2:細胞裂解液；3:穿出液；4:洗滌液；5:洗脫液。
【具體實施方式】
[0022]以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限制本發明的范圍。
[0023]實施例1磁性親和納米材料的制備
[0024](I)稱取 2.7g FeCl3.6H20 和 0.99g FeCl2.4H20 在氮氣保護下溶解在 250ml 超純水中，通過加入5M NaOH調節pH至9左右，40 V攪拌2小時，通過磁鐵分離得到四氧化三鐵納米顆粒。然后將其溶解于超純水中配置成lmg/ml的磁性四氧化三鐵納米顆粒溶液。
[0025](2)取50mg四氧化三鐵納米顆粒分散在50mL Tris-HCl緩沖液中(10mM，ρΗ8.5)，超聲分散15分鐘，加入50mg多巴胺鹽酸。室溫攪拌I小時后，通過磁鐵分離得到聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒。
[0026](3)將上述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒分散在50mL的超純水中，加入IOOmg還原型谷胱甘肽，室溫攪拌反應6小時后，通過磁鐵分離得到GSH修飾的磁性親和納米材料。
[0027]通過XPS、FT_IR、DLS、TEM等分析方法對最終合成的材料進行鑒定表征，結果表明合成的四氧化三鐵納米顆粒大小在15nm左右。通過聚多巴胺的修飾后得到了平均粒徑在580nm左右的納米復合顆粒，XPS和FT-1R的結果確認了 GSH對材料的修飾。
[0028]實施例2GST融合的綠色熒光蛋白(GST-GFP)的分離純化
[0029]本實施例所選用的產GST-GFP重組大腸桿菌為本實驗室以原始的綠色熒光蛋白基因為模板通過基因工程手段融合GST標簽構建而成(關于未添加GST標簽的原始的綠色熒光蛋白基因，可參見Kaisa Hakkila, Mikael Maksimow, Matti Karp, Marko Virta, ReporterGenes lucFF, luxCDABE, gfp, and dsred Have Different Characteristics in Whole-CellBacterial Sensors, Analytical Biochemistry, Volume301, Issue2, Pages235 - 242)。其中，含有該綠色熒光蛋白基因的質粒通過現有的商業途徑即可購買得到，通過PCR將該綠色熒光蛋白基因進行擴增，所用的正向引物為:5 ’ -GGACTAGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’；反向引物為:5’-CGGGATCCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-3’。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分離，利用膠回收試劑盒回收目標大小的片段。通過SpeI和BamHI對片段進行雙酶切，連接到同樣經過雙酶切的pET42a質粒上。利用pET42a質粒所攜帶的GST標簽融合到綠色熒光蛋白的N端。將構建好的質粒轉化到E.coli DH5 α，經過測序正確后，抽取質粒轉化表達宿主Ε.coli BL21中進行表達。將重組大腸桿菌接種到發酵培養中，37°C培養至0D600到0.6-0.8之間，加入IPTG至濃度為0.lmM，25°C誘導培養16小時后離心收集菌體，將其重懸在生理鹽水中，通過超聲破碎離心后得到細胞裂解液，裂解液中的總蛋白濃度通過Bradford法進行測定。取100 μ L細胞裂解液(總蛋白濃度2mg/mL)加入400 μ L磁性親和納米材料(10mg/mL)，振蕩孵育30分鐘后，通過磁鐵對材料進行分離，除去上清。加入500μ L 洗滌緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4,0.5%Triton X-100，500mMNaCl)對材料進行清洗除去非特異性結合，通過磁分離除去上清，反復清洗三次。最終加入500 μ L洗脫緩沖液(50mMTris-HCl, pH8.0, 0.5%Triton X-100, 500mMNaCl, 50mM GSH),室溫振蕩孵育 30 分鐘，通過磁分離得到洗脫液。
[0030]通過SDS-PAGE對上述純化過程中的穿出液、洗滌液、洗脫液進行了檢測，結果如圖1所示。將細胞裂解液(泳道2)和磁性親和納米材料混合之后，大部分目的蛋白由于GST的特異性作用結合到了材料的表面，而其他的蛋白則留在穿出液(泳道3)中。此外，利用綠色熒光蛋白的熒光特性，通過熒光顯微鏡測定加入材料前后溶液的熒光吸收值變化計算出細胞裂解液中超過80%的目的蛋白結合到了材料上。三次的洗滌過程除去了一些非特異性結合的蛋白(泳道4)，而目的蛋白脫落的量較少，通過熒光定量總共少于8%。最后通過高濃度的GSH洗脫液進行洗脫后得到了單一條帶的目的蛋白(泳道5)。
[0031]實施例3GST融合的脂肪酶(GST-Lip)的分離純化
[0032]本實施例所選用的產GST-Lip重組大腸桿菌為本實驗室以脂肪酶基因為模板通過基因工程手段融合GST標簽構建而成(關于未添加GST標簽的原始的脂肪酶基因，可參見 Bei Gao, Erzheng Su, Jinping Lin, Dongzhi We1.Development of recombinantEscherichia coli whole-celI biocatalyst expressing a novel alkalinelipase-coding gene from Proteus sp.for biodiesel production.Journal of Biotechnology.2009, 139 (2): 169-175)。其中，帶有脂肪酶LipK107基因的質粒通過現有的商業途徑即可購買得到，以此作為模板，通過PCR對脂肪酶LipK107基因進行擴增，所用的正向引物為:5’ -GGACTAGTATGTCAACGAAATATCCTATC-3’ ；反向引物為:5’ -GGAATTCTTAAAGTTGCTTACTCGCTAAG-3’。通過膠回收對目的基因片段進行回收，利用SpeI和EcoRI限制性內切酶對片段進行雙酶切，連接到同樣經過雙酶切的pET42a質粒中。利用pET42a中所帶的GST標簽融合到蛋白的N端。將構建成功的質粒轉化到E.coli BL21中進行表達。按照實施例2中所述的方法用磁性親和納米材料對GST-Lip進行分離純化，結果如圖2所示，在穿出液(泳道3)中幾乎觀察不到目的蛋白的條帶，說明對GST-Lip具有很高的結合能力。雖然洗滌的過程中存在部分目的蛋白的脫落(泳道4)，然而通過洗脫能得到大量高純度的目的蛋白(泳道5)。
[0033]以上所述的，僅為本發明的較佳實施例，并非用以限定本發明的范圍，本發明的上述實施例還可以做出各種變化。即凡是依據本發明申請的權利要求書及說明書內容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發明專利的權利要求保護范圍。本發明未詳盡描述的均為常規技術內容。
【權利要求】
1.一種用于分離純化GST標簽融合蛋白的磁性親和納米材料，其特征在于，包括:四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面固定有還原型谷胱甘肽。
2.根據權利要求1所述的磁性親和納米材料，其特征在于，所述還原型谷胱甘肽通過所述聚多巴胺涂層表面富含的鄰苯二酚基團固定。
3.一種根據權利要求1所述的磁性親和納米材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提供多巴胺溶液，向所述多巴胺溶液中加入四氧化三鐵納米顆粒，攪拌，磁性分離獲得聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒； 2)提供還原型谷胱甘肽溶液，將步驟I)中制備的所述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒分散到所述還原型谷胱甘肽溶液中，攪拌，磁性分離獲得所述磁性親和納米材料。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述多巴胺溶液濃度為0.l-5mg/mL,加入的所述四氧化三鐵納米顆粒濃度為0.5-5mg/mL,攪拌時間為0.5_5h,步驟2)中所述還原型谷胱甘肽溶液濃度為1-lOmg/mL，加入的所述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒濃度為0.5-5mg/mL，攪拌時間為6_12h。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述還原型谷胱甘肽與所述聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒的比例為2: I。
6.一種根據權利要求1所述的磁性親和納米材料在GST標簽融合蛋白的分離純化中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，包括以下步驟: 1)提供根據權利要求1所述的磁性親和納米材料，加入細胞裂解液，振蕩孵育，磁分離回收所述磁性親和納米材料； 2)提供洗滌緩沖液，向步驟I)中回收的所述磁性親和納米材料中加入所述洗滌緩沖液，通過磁分離反復清洗回收所述磁性親和納米材料； 3)提供洗脫緩沖液，向步驟2)中清洗后的所述磁性親和納米材料中加入所述洗脫緩沖液，振蕩孵育，通過磁分離獲得洗脫液，所述洗脫液中含有經過分離純化的GST標簽融合蛋白。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述細胞裂解液為重組大腸桿菌裂解液，表達GST標簽融合的綠色熒光蛋白或GST標簽融合的脂肪酶。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，步驟I)中的所述細胞裂解液的總蛋白濃度為0.5-2mg/mL，加入的所述磁性親和納米材料濃度為1-lOmg/mL，孵育的時間為0.5_lh。
10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，步驟2)中的所述洗滌緩沖液成分為50mM、pH7.4 的 Tris-HCl 緩沖液、Triton X-100 (0.5%w/v)、500mM NaCl，步驟 3)中的所述洗脫緩沖液成分為 50mM、pH8.0 的 Tris-HCl 緩沖液、Triton X-100C0.5%w/v)、500mM NaCl,50mM還原型谷胱甘肽。
【文檔編號】C07K1/22GK103877956SQ201410136632
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】任宇紅, 魏東芝, 倪克奉, 楊劍冰 申請人:華東理工大學