一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用。所述磁性親和納米顆粒包括：四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面螯合有鎳離子。本發明采用具有超順磁特性的四氧化三鐵納米顆粒作為載體，在其表面通過多巴胺自聚形成的聚多巴胺膜進行修飾得到與鎳離子高效螯合的磁性親和納米顆粒，最終實現對組氨酸標簽蛋白的快速、高效、簡便的純化以及對組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化。本發明所提供的磁性親和納米顆粒制備過程簡單、價廉，該材料用于組氨酸標簽蛋白的分離純化或固定化操作過程簡便有效，因此該技術具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地涉及一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]固定金屬離子親和色譜(IMAC)是近30年來發展起來的一種新型高效的蛋白質親和分離技術，它主要通過材料表面的配基螯合銅、鎳、鈷或鋅離子，利用蛋白質表面的一些氨基酸殘基，如組氨酸、色氨酸或半胱氨酸能和這些離子發生較強的配位作用從而實現分離蛋白的目的。和其他蛋白純化的方法相比，IMAC技術具有配基穩定性高、可重復使用且再生成本低、對目標蛋白選擇性好且吸附量大、吸附與洗脫條件溫和不影響蛋白活性等優點，尤其對帶有6個組氨酸標簽融合蛋白的分離純化具有很好的效果。因此該技術逐漸成為了蛋白質分離純化領域最有效、應用最廣的技術之一。
[0003]目前的IMAC多采用傳統的柱層析技術，仍然具有以下的缺點:樣品需要預處理去除固體顆粒以防堵塞層析柱，分離過程操作繁瑣、耗時長、成本高，此外存在擴散阻力導致分離效率下降。近年來快速發展的磁性親和納米技術給蛋白的分離純化帶來了革命性的發展，其特有的超順磁特性簡化了固液相分離過程，省去離心、過濾等繁雜的操作。納米尺寸的粒徑提供了極大的比表面積，提升目的蛋白的吸附量。在固定化酶研究領域，磁性親和納米材料可以作為載體實現酶的一步純化固定化，簡化了固定化酶制備過程。此外，將酶固定在磁性的材料上，在應用的過程中可以通過磁分離將催化劑從反應液中迅速分離，簡化連續操作過程，節省成本。
[0004]雖然現有技術中已公開了一種用于組氨酸標簽蛋白純化的磁性親和磁珠，但是這種材料的制備過程復雜，需要多步化學的修飾過程，此外，商品化的產品價格較高，導致實際應用并不廣泛。
[0005]近年來，多巴胺作為一種仿生粘附物質受到了密切的關注。研究發現多巴胺在弱堿性條件下能自聚形成聚多巴胺并包裹在幾乎任何材料的表面。此外，在多巴胺自聚的同時，其所含有的鄰苯二酚基團能與金屬離子形成穩定的絡合物。在生物【技術領域】，組氨酸標簽融合蛋白系統的應用更加廣泛，而到目前為止都還沒出現將多巴胺用于組氨酸標簽蛋白純化的相關研究。并且，在組氨酸標簽蛋白的固定化領域，到目前為止也還沒有出現一種可實現對組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化的簡單的方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用，從而解決現有技術中的用于組氨酸標簽蛋白純化的磁性親和材料制備過程復雜，產品價格較高的缺陷，以及現有技術中缺少一種簡單即可實現對組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化的方法。[0007]為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:
[0008]提供一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒，包括:四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面螯合有鎳離子。
[0009]所述磁性親和納米顆粒的粒徑為200-300納米。其中，四氧化三鐵納米顆粒的粒徑大約為150-250納米，聚多巴胺涂層包裹于四氧化三鐵納米顆粒外部，其厚度在25納米左右。
[0010]根據本發明所提供的磁性親和納米顆粒具有較大的比表面積，提高了蛋白的吸附效率和吸附量；利用四氧化三鐵納米顆粒超順磁的特性可簡化蛋白分離純化以及固定化的流程，同時可簡化固定化酶后續使用的流程；利用聚多巴胺富有的鄰苯二酚基團螯合鎳離子，可實現對組氨酸標簽蛋白的特異性結合。
[0011]本發明中四氧化三鐵納米顆粒優選的制備方法如下:將氯化鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉和乙二醇按照摩爾比1:0:17:36.5:89.5混合，攪拌溶解后，加熱至200°C，反應12小時，冷卻后通過磁分離，并用乙醇和水去清洗得到四氧化三鐵納米顆粒。
[0012]本發明中的磁性親和納米顆粒的制備方法包括以下步驟:1)提供Tris-HCl緩沖液配置多巴胺溶液，加入四氧化三鐵納米顆粒，攪拌，通過磁分離得到聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒；2)提供鎳離子溶液，將步驟I)中制備得到的聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒分散在所述鎳離子溶液中，攪拌，通過磁分離獲得所述磁性親和納米顆粒。
[0013]優選地，步驟I)中所述多巴胺溶液的濃度為0.l_5mg/mL，加入所述四氧化三鐵納米顆粒的濃度為0.5-5mg/mL (優選lmg/mL),反應時間為6_12小時,步驟2)中所述鎳離子溶液的鎳離子濃度20-200mM (優選IOOmM),加入聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒濃度為0.5-5mg/mL (優選lmg/mL),攪拌時間為l_6h。
[0014]本發明還提供了一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒的應用，包括用于組氨酸標簽蛋白的純化，以及用于組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化。
[0015]本發明所述的用于組氨酸標簽蛋白的純化的應用包括以下步驟:(I)將得到的螯合有鎳離子的磁性親和納米顆粒懸浮液進行磁分離后除上清，加入平衡緩沖液平衡后磁分離除去上清；(2)加入細胞裂解上清液，振蕩孵育，磁分離收集上清液標記為穿出液，再平衡緩沖液洗滌兩次，最后用洗脫緩沖液洗脫，收集洗滌液和洗脫液。用SDS-PAGE電泳檢測純化純度。其中，所述的細胞裂解液為重組大腸桿菌裂解液，重組表達帶有組氨酸標簽的紅色熒光蛋白。優選地，平衡緩沖液是指含有500mMNaCl的Tris-HCl緩沖液(pH7.5,50mM),洗脫緩沖液是指在所述的平衡緩沖液中添加300mM咪唑。
[0016]本發明所述的用于組氨酸標簽蛋白的純化的應用，所述的材料可重復使用，連續用于純化4批次之后，其純化效果沒有顯著下降。
[0017]本發明所述的用于組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化中的應用包括以下步驟:1)提供如上所述的磁性親和納米顆粒，加入平衡緩沖液平衡后磁分離除去上清；2)向步驟I)中平衡后的磁性親和納米顆粒中加入細胞裂解上清液，振蕩孵育，磁分離收集所述磁性親和納米顆粒，獲得固定化酶；其中，所述細胞裂解上清液含有組氨酸標簽蛋白，所述組氨酸標簽蛋白通過所述磁性親和納米顆粒得到了一步純化固定化。
[0018]優選地，所述細胞裂解上清液為重組大腸桿菌裂解上清液。[0019]所述重組大腸桿菌重組表達帶有組氨酸標簽的轉氨酶。
[0020]優選地，平衡緩沖液是指含有500mMNaCl的Tris-HCl緩沖液(pH7.5，50mM)。
[0021]所述固定化酶的比活相對所述細胞裂解上清液的比活提高了兩倍。
[0022]所述固定化酶具有良好的熱穩定性和酸堿耐受度，并且具有良好的重復使用性，反復使用10批次之后，其活力仍保留在79%以上。
[0023]本發明提供了一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用。所提供的磁性親和納米顆粒的粒徑為200-300納米，具有較大的比表面積，提高了蛋白的吸附效率和吸附量；采用具有超順磁特性的四氧化三鐵納米顆粒作為載體，在其表面通過多巴胺自聚形成的聚多巴胺膜進行修飾得到可以與鎳離子高效螯合的磁性親和納米顆粒，最終實現對組氨酸標簽蛋白的快速、高效、簡便的純化以及對組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化。并且該磁性納米親和顆粒制備過程簡單，成本低，采用該材料用于純化組氨酸標簽蛋白操作流程簡便，特異性高，采用該材料用于組氨酸標簽蛋白的固定化選擇性好，吸附量高，固定化酶穩定性好，便于重復使用。因此本發明要求保護的技術方案具有廣泛的應用前景。
[0024]此外，本發明通過如此簡單的方法對載體進行修飾，進而實現了組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化，在生物催化領域具有重要的應用價值，為實現酶的固定化開拓了一種新思路。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是將本發明的磁性親和納米顆粒用于分離純化組氨酸標簽融合紅色熒光蛋白的電泳圖結果，其中，M:蛋白質分子量標準；1:細胞裂解液；2:穿出液；3:洗脫液；
[0026]圖2是將本發明的磁性親和納米顆粒用于多批次分離純化組氨酸標簽融合紅色熒光蛋白的電泳圖結果，其中，M:蛋白質分子量標準；1:細胞裂解液；2:穿出液；3:第一批洗脫液；4:第二批洗脫液；5:第三批洗脫液；6:第四批洗脫液；7:第五批洗脫液；
[0027]圖3是將本發明的磁性親和納米顆粒用于一步純化固定化組氨酸標簽融合轉氨酶蛋白的電泳圖結果，其中，M:蛋白質分子量標準；1:細胞裂解液；2:固定化上清液；3:固定化酶；
[0028]圖4是根據本發明制備得到的固定化轉氨酶連續10批次催化反應活力的變化圖。【具體實施方式】
[0029]以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限制本發明的范圍。
[0030]實施例1磁性親和納米顆粒的制備
[0031]稱取3.25g FeCl3和1.0g Na3Cit.2H20加入到IOOmL乙二醇中，攪拌溶解后加入60g NaAc,攪拌30分鐘后置于油浴鍋內，加熱至200°C,反應12小時。冷卻后用磁鐵分離黑色固體顆粒除去上清，用乙醇和水洗滌材料數遍后得到四氧化三鐵納米顆粒。
[0032]取0.1g上述四氧化三鐵納米顆粒分散在IOOmL Tris-HCl緩沖液中(IOmM,pH8.5),超聲分散15分鐘,加入0.1g鹽酸多巴胺。室溫攪拌反應6小時后,通過磁鐵分離得到聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒。[0033]配置濃度為IOOmM的NiSO4溶液，加入上述的聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒，室溫攪拌反應2小時后，磁分離得到鎳離子螯合的磁性親和納米顆粒。
[0034]通過SEM、XPS、FT-1R、EDX等分析方法對材料合成步驟進行了表征分析，結果表明所合成的四氧化三鐵納米顆粒大小在200納米左右，通過多巴胺修飾后顆粒大小增加至250納米左右，說明聚多巴胺涂層的厚度在25納米左右。此外，XPS和EDX的分析結果表明，鎳離子能有效的螯合到材料表面。
[0035]根據本發明所制備的磁性親和納米顆粒粒徑實際并不局限于250納米，理論上粒徑越小其吸附能力越大，但是粒徑太小又會引起飽和磁強度降低，也就是說通過磁分離的效率低，甚至會因回收不徹底而損失，通過實驗摸索，本申請的發明人發現該磁性親和納米顆粒的粒徑在200-300納米范圍內時其吸附性能和磁強度均較好，其中最優選為250納米。
[0036]實施例2組氨酸標簽融合的紅色熒光蛋白的分離純化
[0037]本實施例選用產紅色突光蛋白重組大腸桿菌,具體可參見Kaisa Hakkila, MikaelMaksimow, Matti Karp, Marko Virta,Reporter Genes lucFF,luxCDABE, gfp, and dsredHave Different Characteristics in Whole-Cell Bacterial Sensors, Analytical Biochemistry, Volume301, Issue2, Pages235 - 242。通過發酵技術,誘導表達離心得到重組大腸桿菌菌體，重懸于平衡緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5,500mMNaCl)中，通過超聲破碎后離心收集上清液，得到含有重組紅色熒光蛋白的細胞裂解液。通過Bradford法測定上清液中總蛋白濃度，用平衡緩沖液稀釋成0.5mg/mL待用。
[0038]取IOmg實施例1中制備的螯合鎳離子的磁性親和納米顆粒，通過磁分離除去上清，加入ImL平衡緩沖液平衡鹽離子后磁分離去除上清。加入ImL上述制備的細胞裂解液，室溫搖床振蕩孵育5分鐘后收集上清，標記為穿出液。用平衡緩沖液清洗材料2遍后，加入ImL洗脫緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5, 500mMNaCl, 300mM咪唑)進行洗脫，清洗和洗脫過程可適當進行攪拌或振蕩，收集洗脫液。
[0039]通過SDS-PAGE對上述純化過程中的穿出液、洗脫液進行了檢測，結果如圖1所示。相對于細胞裂解液(泳道I)而言，穿出液(泳道2)中目的蛋白的條帶顯著減少，而其他的蛋白條帶變化不明顯，通過洗脫后，得到了目的蛋白的單一條帶(泳道3)。上述的結果說明實施例I中制備的磁性親和納米顆粒對組氨酸標簽蛋白的特異性好，能有效地用于組氨酸標簽蛋白的分離純化。
[0040]實施例3磁性親和納米顆粒連續重復純化重組紅色熒光蛋白
[0041]為了考察所合成的磁性親和納米顆粒在純化組氨酸標簽蛋白應用中的穩定性，我們采用實施例1中制備的磁性親和納米顆粒連續多批次的分離純化重組紅色熒光蛋白。分離純化的過程如實施例2所述，在每次純化完成后，用平衡緩沖液平衡該磁性親和納米顆粒三次，用于下一批次的分離純化過程。將每次收集的洗脫液通過SDS-PAGE進行檢測，結果如圖2所述。結果表明直至第五批次都能洗脫得到目的蛋白的單一條帶，也就是說多批次的使用對該磁性親和納米顆粒的特異性沒有明顯的改變，只是隨著重復次數的增加，會略微降低對目的蛋白的吸附量。
[0042]實施例4組氨酸標簽融合的轉氨酶的一步純化固定化
[0043]本實施例選用產重組轉氨酶的重組大腸桿菌,可參見Ni K, Zhou X, Zhao L, Wang
H,Ren Y, et al.(2012)Magnetic Catechol-Chitosan with Bioinspired AdhesiveSurface:Preparation and Immobilization of ω-Transaminase.PloS one7:e41101.X通過發酵技術，誘導表達離心得到重組大腸桿菌菌體，重懸于PBS緩沖液中，通過超聲破碎后離心收集上清液，得到含有重組紅色熒光蛋白的細胞裂解液。通過Bradford法測定上清液中總蛋白濃度，用平衡緩沖液稀釋成0.5mg/mL待用。
[0044]取3mg實施例1中制備的螯合鎳離子的磁性親和納米顆粒,通過磁分離除去上清，加入0.5mLPBS平衡后磁分離去除上清。加入0.5mL上述制備的細胞裂解液，室溫振蕩孵育30分鐘后收集上清，測定上清中的蛋白濃度，通過如下公式計算固定化率為48%。通過SDS-PAGE對固定化上清和固定化酶進行了直接的檢測，結果如圖3所示，在固定化后的上清液中(泳道2)，目的蛋白的條帶幾乎消失，而在固定化酶的電泳條帶中(泳道3)，則觀察到了單一的蛋白條帶。結果說明雖然固定化率只有48%，但是細胞裂解液中帶有組氨酸標簽的目的蛋白已經全部被固定在材料上，而其他的雜蛋白則沒有被固定。
[0045]
【權利要求】
1.一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒，其特征在于，包括:四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面螯合有鎳離子。
2.根據權利要求1所述的磁性親和納米顆粒，其特征在于，所述磁性親和納米顆粒的粒徑為200-300納米。
3.一種根據權利要求1所述的磁性親和納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提供Tris-HCl緩沖液配置多巴胺溶液，加入四氧化三鐵納米顆粒，攪拌，通過磁分離得到聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒； 2)提供鎳離子溶液，將步驟I)中制備得到的聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒分散在所述鎳離子溶液中，攪拌，通過磁分離獲得所述磁性親和納米顆粒。
4.一種根據權利要求1所述的磁性親和納米顆粒在組氨酸標簽蛋白的純化中的應用。
5.一種根據權利要求1所述的磁性親和納米顆粒在組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟: 1)提供根據權利要求1所述的磁性親和納米顆粒，加入平衡緩沖液平衡后磁分離除去上清； 2)向步驟I)中平衡后的磁性親和納米顆粒中加入細胞裂解上清液，振蕩孵育，磁分離收集所述磁性親和納米顆粒，獲得固定化酶； 其中，所述細胞裂解上清液含有組氨酸標簽蛋白，所述組氨酸標簽蛋白通過所述磁性親和納米顆粒得到了一步純化固定化。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述細胞裂解上清液為重組大腸桿菌裂解上清液。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述重組大腸桿菌重組表達帶有組氨酸標簽的轉氨酶。
9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述固定化酶的比活相對所述細胞裂解上清液的比活提高了兩倍。
10.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述固定化酶具有良好的熱穩定性和酸堿耐受度，并且具有良好的重復使用性。
【文檔編號】C12N11/08GK103887030SQ201410136643
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】任宇紅, 魏東芝, 倪克奉, 楊劍冰 申請人:華東理工大學