一種膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種膠原蛋白的制備方法，具有如下步驟：①取動物尾，并對動物尾進行滅菌處理，手術剝離筋腱，并收集筋腱；②使用含尿素溶液筋腱浸沒，在溶液中將筋腱破碎，將已破碎的尾腱尿素混合液在2-25℃提取；③將混合溶液進行過濾處理，去除未溶解的雜質后獲得粗提液，對粗提液進行凝膠分離；④將粗提液進行去除鹽和去雜質處理后得到精制液；⑤取精制液用凍干機凍干，即可得到醫用級膠原蛋白。本發明可以大大節省提取和純化的時間，并且收率可以達到90%以上，大大提高了提取和純化的效率，同時，利用本發明所提供的方法所生產的膠原蛋白產品雜質少，純度高，避免了提取過程所引起的降解，保證了產品膠原蛋白的完整性和生物活性。
【專利說明】一種膠原蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及膠原蛋白純化【技術領域】，尤其是一種膠原蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是世界上應用最為廣泛的生物材料，目前國際年產量在2萬噸左右。在醫學領域，膠原蛋白作為高生物相容性、高生物活性材料被廣泛應用于創傷控制和轉化醫學。2011年，國際著名的商務測評機構Frost&SulIivan的市場調研數據也表明，膠原蛋白已經成為最有市場競爭力的生物醫學材料，用于再生醫學，并將進一步發展，成為器官替代
醫學兩大材料之一，其技術就緒水平-Technology readiness level (TRL)評分為8(最
高9)。美國醫藥食品管理局(FDA)預測，到2015年膠原蛋白將占有超過20%的生物醫學材料市場，年銷售額超過200億美元。
[0003]膠原蛋白是哺乳動物中含量十分豐富的蛋白，也是非常重要的一種蛋白質。膠原蛋白的類型、質量以及分布的改變直接影響動物體正常的機能，如導致透明軟骨的退行性關節炎、血管基質的動脈粥狀硬化、血管和腎膠原性基底膜的糖尿病、傷口愈合中異常的癱痕形成、角膜和晶狀體異常、結締組織遺傳性疾病等。且研究顯示膠原蛋白具有非常重要的生物學性能:
[0004](I)膠原的止血功能。天然的膠原聚集體本身就是很好的止血劑，它通過兩方面發揮作用:促進血小板凝聚和血漿結塊。膠原與血小板之間的作用機理還未完全清楚，但是有關其相互作用的許多現象已經得到證實。膠原使血小板凝聚的能力似乎來源于游離氨基，尤其是賴氨酸側鏈氨基。封閉膠原羧基，不會造成凝血能力的明顯下降，不過卻削弱了膠原促使血漿結塊的作用。所以，膠原的天然結構尤其是足夠發達的四級結構，是膠原具有凝聚能力的基礎。膠原的止血作用使其可以用作凝血材料，物理形態可以是粉狀、片狀、海綿狀
坐寸ο
[0005](2)低免疫原性。可溶性膠原的免疫原性很低，不溶性膠原的免疫原性更低。膠原蛋白雖是大分子物質，但其結構重復性大，與其它具有免疫原的蛋白質相比，膠原的免疫原性非常低，人們甚至一度認為膠原不具有抗原性。最近的研究表明，膠原有3種類型的抗原因子:第I類是由膠原肽鏈非螺旋的端肽引起的；第2類是由膠原三股螺旋的構象引起的；第3類是由a鏈螺旋區的氨基酸順序引起的。第2類抗原因子僅存在于天然膠原分子中，第3類只出現在變性膠原中，而第I類抗原因子在天然和變性膠原蛋白中均存在。
[0006](3)生物相容性。膠原蛋白作為細胞生長的依附和支架物，能誘導上皮細胞等增殖、分化和移行。膠原分子特有的三股螺旋結構及其交聯形成的纖維或網絡構成細胞重要組成成分，故膠原材料無論是在被吸收前作為形成新組織的骨架，還是被吸收同化進入宿主，成為宿主組織的一部分，都與細胞周圍的基質有著良好的相互作用，表現出相互影響的協調性，并成為細胞與組織正常生理功能整體一部分。
[0007]膠原蛋白的這些生物學性能使得其在醫學、食品、同用化學品、生物醫用材料等領域中占據十分重要的地位，被認為是值得永遠研究且具有多用途的生物高分子材料。[0008]在膠原蛋白的市場應用方面，國際知名醫療器械企業都在進行膠原蛋白醫學應用的研發，包括創傷包扎材料、特殊瘡口控制霜劑、膠原蛋白泡沫及海綿等。以膠原蛋白產品為基質材料，加入細胞乃至干細胞技術，開發新的細胞活性的器官移植及器官修復產品成為行業的新的技術趨勢。
[0009]近年來，國際大型企業(如法國羅賽洛(RUSSEL0T)集團)開始著手開發合成膠原蛋白及其類似物的研發，但受合成技術限制，水平較低，產量有限，價格昂貴(目前市面合成高純度膠原蛋白的售價高達3000美元/毫克)，僅能用于科研應用。
[0010]一直以來，膠原蛋白主要從動物的組織器官提取，如豬牛的皮、骨骼和筋腱等。膠原蛋白提取方法有傳統酸解法，中性鹽萃取法和酶法。所有方法都先將鼠尾清洗后置入萃取溶液進行溶解。離心后，粗提液可以作為產品儲存也可以進一步加工處理進行精提。中性鹽萃取法有著顯著的技術劣勢，主要是產率低下不足5 %，而且雜質蛋白含量高，基本被淘汰了。
[0011]目前，中國國內最常見的膠原蛋白提取工藝仍然基于傳統的酸解法，而且主要原料是牛筋腱(蹄筋)和鼠尾筋腱。由于技術局限，酸解法提取產率只能從鼠尾筋腱濕重計算，產率不超過60%。為了提高萃取率，很多情況下，還要用胰蛋白酶對筋腱進行預處理。雖然，動物筋腱超過90%的組分為膠原蛋白，但是其從動物體的剝離過程人力消耗大，且不易處理干凈，造成產品最后染雜，特別是動物血液和肌肉組織的污染很難去除。另外，很多動物組織的蛋白酶仍然存在，在酸解過程中，會和酸同時起作用于膠原蛋白，造成膠原蛋白的不規則水解，大大降低了流程的可控性與可重復性，直接影響到膠原蛋白的質量，特別是其特殊的生物學功能性。因此，需要一種簡單可行的方法來提取高純度的膠原蛋白。
【發明內容】
[0012]本發明要解決的技術問題是:克服現有技術中膠原蛋白的提取率低，品質不好及制備時間過長等技術問題，提供一種膠原蛋白的制備方法，該方法制備時間短，提取率高、得到的膠原蛋白品質好。
[0013]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:一種膠原蛋白的制備方法，具有如下步驟:
[0014]①動物尾腱的準備
[0015]取動物尾，并對動物尾進行滅菌處理后，手術剝離筋腱，并收集筋腱；
[0016]②膠原蛋白的提取
[0017]使用含尿素溶液將步驟①中得到的筋腱浸沒，在溶液中將筋腱破碎，將已破碎的尾腱尿素混合液在2-25°C°C混勻10-30h ；
[0018]③膠原蛋白的純化
[0019]將步驟②得到的混合溶液進行過濾處理，去除未溶解的雜質后獲得粗提液，對粗提液進行凝膠分離，根據紫外吸收選取合適體積段的溶液進行收集；
[0020]④精制
[0021]將步驟③收集的粗提液進行去除鹽和去雜質處理后得到精制液，精制液中含鹽量低于0.1% ；
[0022]⑤凍干[0023]取步驟④得到的精制液用凍干機凍干，即可得到醫用級膠原蛋白。
[0024]進一步的，步驟①中的滅菌方法為采用70%酒精擦拭若干遍。
[0025]進一步的，步驟①中手術剝離筋腱的方法為:將滅菌后的動物尾放入磷酸鹽緩沖液中保存，在磷酸鹽緩沖液中用手術刀去除外表皮，然后將動物尾中白色筋腱剝離抽出，避免帶出骨渣和碎肉，將動物尾腱放入磷酸鹽緩沖液中清洗若干遍直至濾液無血跡為止，用漏斗過濾，收集筋腱。
[0026]進一步的，步驟②中將動物尾腱與含尿素溶液進行混合時可以采用搖床進行混勻，搖床轉速50-320rpm ;也可以采用磁力攪拌器混勻，磁力攪拌器的轉速100_1200rpm。
[0027]進一步的，所述的含尿素溶液中含l-10mol/L的尿素和0_lmol/L的無機鹽。
[0028]進一步的，步驟③中所述的過濾處理為:取步驟②得到的混合溶液上層清液過
0.22-10 μ m醋酸纖維膜，獲得粗提液，然后使用蛋白質純化系統或蠕動泵對粗提液進行凝膠分離，根據濾液紫外吸收選取UV280>0.01部分體積段的溶液進行收集，分離體積:有效柱容積為1:10-1:100。作為優選，分離體積:有效柱容積為1:50。
[0029]第一種實施例，步驟④中所述的精制方法為:采用透析法，透析袋材質為醋酸纖維，孔徑為IOK道爾頓，經過若干次透析脫鹽，含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液。
[0030]第二種實施例，步驟④中所述的精制方法為:采用超濾法，濾膜采用管式抗污染膜，孔徑為IOK道爾頓，經過5-20倍連續洗濾，獲得高純度溶液，含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液。
[0031]具體的，步驟⑤中凍干時采用的凍干容器為離心管或者表面皿。
[0032]作為優選，步驟⑤中凍干的時間為48-72小時。凍干時間一般根據制取的量決定，量大則凍干時間延長，量小則凍干時間縮短。
[0033]采用了上述技術方案，本發明具有以下的有益效果:
[0034](I)制備時間短:本法采用尿素法提取只需要I天時間，后面采用超濾技術可以將純化時間縮短到幾小時。而傳統的酸解法和酶解法提取純化時間需要3天，甚至一周以上。
[0035](2)收率高:一般中性鹽提取法收率不到5%，酸提法或者酶解提取法收率可以達到60 %左右，本方法按尾腱干重計算，收率可以達到90 %以上。
[0036](3)品質好:酸提或者酶解提取法在提取過程中必然會使膠原蛋白的降解和變性，導致膠原蛋白失去其天然結構和活性。而本法避免了提取過程的降解，保證了膠原蛋白的完整性和生物活性。
[0037](4)處理過程簡單:采用溶劑尿素溶液具有很高的殺菌性能，并能進行病毒滅活，顯著降低了細菌基數，減少了內毒素含量。
[0038](5)應用廣泛:本發明涉及的膠原蛋白適用于生物醫學研究，也適合做醫療器械產品，特別適合制備細胞支架材料，還可以應用于體細胞的三維培養；也可以作為細胞貼壁
培養的培養基。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]圖1為本發明膠原蛋白的聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)分析圖；最左面為marker,中間不同條帶為不同濾出液的圖譜。[0040]圖2為本發明膠原蛋白的Wester-Blot分析圖譜。C:陽性對照，采用高純度膠原蛋白作為對照；水:目標股原蛋白的水溶液；股:其他股原蛋白；
[0041]根據sds-page分析和Wester-Blot,產品符合膠原蛋白的特征,且具有非常高的純度，無雜質蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]本發明的一種膠原蛋白的制備方法，具有如下步驟:
[0044]①動物尾腱的準備
[0045]取動物尾，可取大鼠尾、小鼠尾或者袋鼠尾，并對動物尾采用消毒酒精擦拭若干遍進行滅菌處理，將滅菌后的動物尾放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中保存，在磷酸鹽緩沖液中用手術刀去除外表皮，然后將動物尾中白色筋腱剝離抽出，避免帶出骨渣和碎肉，將動物尾腱放入磷酸鹽緩沖液中清洗若干遍直至濾液無血跡為止，用漏斗過濾，收集筋腱；
[0046]②膠原蛋白的提取
[0047]使用適量含尿素溶液將步驟①中得到的筋腱浸沒，在溶液中將筋腱破碎，將已破碎的尾腱尿素混合液在2-25°C混合均勻，一般需要10-30小時，將動物尾腱與含尿素溶液進行混合時可以采用搖床進行混勻，搖床轉速50-320rpm ;也可以采用磁力攪拌器混勻，磁力攪拌器的轉速100-1 200rpm ；
[0048]③膠原蛋白的純化
[0049]將步驟②得到的混合溶液進行過濾處理，取步驟②得到的混合溶液上層清液過
0.22-10μπι醋酸纖維膜，獲得粗提液，然后使用蛋白質純化系統(AKTA)或蠕動泵對粗提液進行凝膠分離，根據濾液紫外吸收選取UV280>0.01部分體積段的溶液進行收集，分離體積:有效柱容積為1:10-1:100。作為優選，分離體積:有效柱容積為1:50 ;
[0050]使用緩沖液為2M尿素的鹽溶液,流速為0.5-lmL/min,有效柱容積為50ml,經過100mL緩沖液之后，上樣Iml經過過濾的粗提液，收集UV280>0.01部分體積段的溶液。然后用50ml緩沖液洗脫，繼續上樣。
[0051]④精制
[0052]將步驟③收集的粗提液進行去除鹽和去雜質處理后得到精制液，采用透析法，透析袋材質為醋酸纖維，孔徑為IOK道爾頓，經過若干次透析脫鹽，含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液；
[0053]⑤凍干
[0054]取步驟④得到的精制液放入離心管或者表面皿等容器，用凍干機凍干48-72小時，即可得到醫用級膠原蛋白。
[0055]作為溶解筋腱的關鍵溶液，所述的含尿素溶液中含2mol/L的尿素和0.5mol/L的無機鹽。
[0056]實施例2
[0057]實施例2用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0058]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟②中所使用的含尿素溶液中尿素的濃度為5mol/L,氯化鈉的濃度為0.lmol/L,獲得膠原蛋白產品2。[0059]實施例3
[0060]實施例3用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0061]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟②所使用的含尿素溶液中尿素的濃度為lmol/L,氯化鈉的濃度為0.5mol/L,獲得膠原蛋白產品3。
[0062]實施例4
[0063]實施例4用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0064]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟②所使用的含尿素溶液中尿素的濃度為8mol/L,獲得膠原蛋白產品4。
[0065]實施例5
[0066]實施例5用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0067]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟②所使用的含尿素溶液中尿素的濃度為10mol/L,獲得膠原蛋白產品5。
[0068]實施例6
[0069]實施例6用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0070]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟②中溶解的溫度條件為4°C，溶解時間為48h，獲得膠原蛋白產品6。
[0071]實施例7
[0072]實施例7用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0073]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟中③過濾是采用100層無菌紗布過濾混合液獲得粗濾液，獲得膠原蛋白產品7。
[0074]實施例8
[0075]實施例8用于說明本發明所提供的膠原蛋白的制備方法。
[0076]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，步驟④的精制采用采用超濾法，濾膜采用管式抗污染膜，孔徑為1K道爾頓，經過5-20倍連續洗濾，獲得高純度溶液，含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液，獲得膠原蛋白產品8。
[0077]對比例I
[0078]采用與實施例1相同的方法制備膠原蛋白產品，不同的是，所使用的尿素溶液的濃度為0.5mol/L，獲得膠原蛋白產品9。
[0079]檢測實施例1-8和對比例I制得的膠原蛋白產品1-9的產品收率和膠原蛋白純度,結果列于表1。
[0080]表1膠原蛋白的收率和純度比較
[0081]
【權利要求】
1.一種膠原蛋白的制備方法，其特征是具有如下步驟: ①動物尾腱的準備 取動物尾，并對動物尾進行滅菌處理后，手術剝離筋腱，并收集筋腱； ②膠原蛋白的提取 使用含尿素溶液將步驟①中得到的筋腱浸沒，在溶液中將筋腱破碎，將已破碎的尾腱尿素混合液在2-25 °C提取； ③膠原蛋白的純化 將步驟②得到的混合溶液進行過濾處理，去除未溶解的雜質后獲得粗提液，對粗提液進行凝膠分離，根據紫外吸收選取合適體積段的溶液進行收集； ④精制 將步驟③收集的粗提液進行去除鹽和去雜質處理后得到精制液，精制液中含鹽量低于0.1% ； ⑤凍干 取步驟④得到的精制液用凍干機凍干，得到醫用級膠原蛋白。
2.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟①中的滅菌方法為采用70%酒精擦拭。
3.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟①中手術剝離筋腱的方法為:將滅菌后的動物尾放入磷酸鹽緩沖液中保存，在磷酸鹽緩沖液中用手術刀去除外表皮，然后將動物尾中白色筋腱剝離抽出，避免帶出骨渣和碎肉，將動物尾腱放入磷酸鹽緩沖液中清洗直至濾液無血跡為止，用漏斗過濾，收集筋腱。
4.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟②中將動物尾腱與含尿素溶液進行混合時可以采用搖床進行混勻，搖床轉速50-320rpm ;或者采用磁力攪拌器混勻，磁力攪拌器的轉速100-1200rpm。
5.如權利要求1或4所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:所述的含尿素溶液中含l-10mol/L的尿素和Ο-lmol/L的無機鹽。
6.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟③中所述的過濾處理為:取步驟②得到的混合溶液的上層清液過0.22-10 μ m醋酸纖維膜，獲得粗提液，然后使用蛋白質純化系統或蠕動泵對粗提液進行凝膠分離，根據濾液紫外吸收選取UV280>0.01部分體積段的溶液進行收集，分離體積:有效柱容積為1:10-1:100。
7.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟④中所述的精制方法為:采用透析法，透析袋材質為醋酸纖維，孔徑為IOK道爾頓，經過若干次透析脫鹽至含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液。
8.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟④中所述的精制方法為:采用超濾法，濾膜采用管式抗污染膜，孔徑為IOK道爾頓，經過5-20倍連續洗濾，獲得高純度溶液至含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液。
9.如權利要求1所述的膠原蛋白的制備方法，其特征是:步驟⑤中凍干的時間為48-72h。
【文檔編號】C07K1/34GK104017073SQ201410274732
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】高堅杰, 楊雙雙, 錢陳 申請人:常州藥物研究所有限公司