藥用融合體和綴合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及藥用融合體和綴合物，特別涉及具有改良的血清半衰期的藥用融合體。這些融合體和綴合物包含多肽、免疫球蛋白(抗體)單個可變結構域和GLP和/或Exendin分子。本發明另外涉及包含這樣的藥用融合體和綴合物的應用、制劑、組合物和裝置。
【專利說明】藥用融合體和綴合物
[0001]本申請是申請日為2010年3月24日的中國專利申請201080023261.5“藥用融合體和綴合物”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及具有改良的血清半衰期的藥用融合體和綴合物。這些融合體和綴合物包含免疫球蛋白(抗體)單個可變結構域和GLP和/或Exendin分子。本發明另外涉及包含這樣的藥用融合體和綴合物的應用、制劑、組合物和裝置。
【背景技術】
[0003]許多藥物具有能用于治療和/或診斷目的的活性，但由于給藥時，它們迅速地從機體清除，因此具有有限的價值。例如，許多具有治療用途活性的多肽通過腎臟迅速地從循環中清除。因此，為了獲得想要的治療效果，必須施用大劑量。需要具有改良的藥代動力學性質的改良的治療劑和診斷劑。
[0004]一類這樣的在體內或體循環中具有短半衰期的藥物是腸降血糖素激素諸如胰高血糖素-樣肽I或肽YY以及Exendin,例如Exendin-4。
[0005]胰高血糖素-樣肽(GLP)-1是腸降血糖素激素，具有有效的葡萄糖-依賴性的促胰島素和胰高血糖素抑制(glucagonostatic)作用、對胰腺β細胞的營養作用和對胃腸分泌和運動的抑制作用，這些結合起來來降低血漿葡萄糖和減小血糖波動幅度。此外，通過其提高飽腹感的能力，GLP-1會降低攝食量，因此限制體重增加，甚至可以引起體重減輕。總之，這些作用會賦予GLP-1獨特的特征，被認為用作抗糖尿病劑是相當理想的，特別是由于其抗高血糖作用的葡萄糖依賴性會使嚴重低血糖的任何風險最小化。然而，它的藥代動力學/藥效動力學特征使得天然GLP-1在治療上是無用的。因此，盡管連續給藥時GLP-1最有效，但是單次皮下注射具有短期效果。GLP-1對體內酶降解是高度敏感的，二肽基肽酶IV(DPP-1V)的裂解可能是最相關的，因為這快速發生，并產生非促胰島素的代謝物。因此，基于對影響其代謝穩定性和藥代動力學/藥效動力學特征的因素的理解，利用GLP-1的治療潛能的策略已經成為熱切研究的焦點。
[0006]已經進行了廣泛的工作，嘗試以使其降解減緩同時仍然保持生物活性的方式抑制肽酶或修飾GLP-1。W005/027978公開了具有延長作用特征的GLP-1衍生物。W002/46227公開了異種融合蛋白，其包括與GLP-1或類似物融合的多肽(例如，白蛋白)(這些類似物的公開內容通過弓I用并入本文，作為可用于本發明中的GLP-1類似物的實例)。W005/003296、W003/06007UW003/059934公開了氨基融合蛋白，其中GLP-1已經與白蛋白融合，以嘗試增加激素的半衰期。
[0007]然而，盡管這些努力，還是沒有產生長效活性的GLP-1。
[0008]因此，特別是在糖尿病和肥胖癥的領域中，存在對改良的GLP-1肽或其它藥劑(諸如Exendin-4或PYY)的極大需要，它們同樣具有促胰島素效果，特別適于糖尿病和肥胖癥的治療。因此，需要修飾GLP-UExendin-4和其它促胰島素肽，以提供更長的體內作用持續時間，同時維持它們的低毒性和治療優勢。
【發明內容】
[0009]本發明提供了一種組合物，其是融合體或綴合物，且其包含下述物質或由其組成:
(a)促胰島素藥劑或分子，或腸降血糖素藥物或分子，其可以是例如Exendin-4、PYY(例如3-26 PYY)或GLP-1 (例如GLP-1 (7-37) A8G突變體)，其作為與(b)的融合體或綴合物存在；(b)特異性地結合血清白蛋白(AlbudAbs TM)的dAb，其選自:(i)D0M 7h_14結構域抗體(dAb) (DOM 7h-14 的氨基酸序列如圖 1(h):SEQ ID NO 8 所示)，(ii)DOM 7h_14_10 結構域抗體(dAb) (DOM 7h-14-10的氨基酸序列如圖1(O):SEQ ID NO 26所示)，或與DOM7h-14-10 dAb的序列具有最多4個氨基酸差異的dAb ;和(iii)DOM 7h_ll_15 dAb (DOM7h-ll-15 的氨基酸序列如圖 l(p):SEQ ID NO 27 所示)，或(iv)DOM 7h_14_10 R108C 結構域抗體(dAb) (DOM 7h-14-10的氨基酸序列如圖1 (r)所示)。
[0010]氨基酸連接物或化學連接物也可以任選地存在，其連接促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如 Exendin-4 和 / 或 GLP-1 或 PYY)和 dAb (例如 D0M7h_14 dAb,DOM 7h_14_10dAb,DOM 7h-ll-15 dAb)。所述連接物可以是例如螺旋連接物，例如圖1 (k):SEQ ID NO 11所示的序列的螺旋連接物，或它可以是gly-ser連接物，例如具有在圖1(1):SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列。
[0011]在某些實施方案中，本發明的融合體(或綴合物)可以另外包含分子，例如其它肽或多肽。
[0012]促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如Exendin和/或GLP-1)可以作為與dAb的N-端或C-端的融合體(或綴合物)而存在。
[0013]在某些實施方案中，本發明提供了一種多肽，所述多肽包含選自下述的融合體分子或由其組成:
[0014](a)2xGLP-l(7-37)A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DATO114，氨基酸序列如圖1 (a):SEQID NO I所示)
[0015](b)Exendin4(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0115，氨基酸序列如圖1(b):SEQ ID NO 2 所示)，
[0016](c)Exendin4-D0M7h-14 dAb 融合體(DAT0116，氨基酸序列如圖1 (c):SEQ ID NO3所示)。
[0017](d)Exendin4、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb融合體(DAT0117，氨基酸序列如圖1(d):SEQ ID NO 4 所示)。
[0018](e) GLP-1 (7-37) A8G(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0118，氨基酸序列如圖 1(e):SEQ ID NO 5 所示)，
[0019](f) GLP-1 (7-37) A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0119，氨基酸序列如圖1 (f):SEQID NO 6 所示)，
[0020](g) GLP-1 (7-37) A8G、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0120，氨基酸序列如圖 1(g):SEQ ID NO 7 所示)，
[0021](h)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h-14_10 融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖l(m):SEQ ID NO 24 所示)，
[0022](i)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_ll_15 融合體(DMS7143，氨基酸序列如圖l(n):SEQ ID NO 25 所示)。
[0023]本發明也提供了綴合物分子，其包含上述那些(即具有SEQ ID NO 1-7和SEQ IDNO 24-25所示的氨基酸序列的那些)的氨基酸序列或由其組成。
[0024]在某些實施方案中，本發明提供了一種多肽，其包含綴合物分子或由其組成，所述綴合物分子是:
[0025]經由賴氨酸(導入在PYY的10位)和4個重復PEG連接物綴合到C-端酰胺化的PYY3-36上的DOM 7h_14_10 (R108C) AlbudAb。該肽綴合物的氨基酸序列和結構如圖14所
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[0026]本發明也提供了一種多肽，其包含下述氨基酸序列或由其組成:EXendin4、(G4S)3、連接物D0M7h-14-10融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖l(m):SEQ ID NO 24所示)，或與DMS7139的氨基酸序列具有最多4個氨基酸變化的融合體或綴合物分子，所述氨基酸序列如圖l(m)所示。
[0027]DOM 7h_14是結合血清白蛋白的人免疫球蛋白單個可變結構域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如圖1(h):SEQ ID NO 8所示。DOM 7h_14 dAb的CDR區在圖1(h):SEQ IDNO 8所示的氨基酸序列中標有下劃線。
[0028]DOM 7h-14_10是結合血清白蛋白的人免疫球蛋白單個可變結構域或dAb，且它的氨基酸序列如圖 1(0):SEQ ID NO 26 所示。DOM 7h_14_10 dAb 的 CDR 區在圖1 (o):SEQ IDNO 26所示的氨基酸序列中標有下劃線。
[0029]DOM 7h-ll_15是結合血清白蛋白的人免疫球蛋白單個可變結構域或dAb，且它的氨基酸序列如圖1(P):SEQ ID NO 27 所示。DOM 7h_ll_15 dAb 的 CDR 區在圖1 (p):SEQ IDNO 27所示的氨基酸序列中標有下劃線。
[0030]本文使用的“融合體”表示這樣的融合蛋白:其包含結合血清白蛋白的D0M7h_14dAb或D0M7h-14-10 dAb或DOM 7h_ll_15 dAb作為第一部分，且包含促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物作為第二部分。結合血清白蛋白的dAb和所述藥物或藥劑作為單個連續多肽鏈的離散部件(部分)存在。第一(dAb)和第二(腸降血糖素藥物或促胰島素藥劑)部分可以通過肽鍵直接互相鍵合，或通過合適的氨基酸或肽或多肽連接物相連。在適當時，可以存在其它部分，例如肽或多肽(例如第三、第四)和/或連接物序列。第一部分可以是在相對于第二部分的N-端位置、C-端位置或內部。在某些實施方案中，所述融合蛋白含有一個或超過一個(例如一個至約20個)dAb部分。
[0031]本文使用的“綴合物”表示這樣的組合物:其包含結合血清白蛋白的dAb，促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如GLP-1、Exendin-4、PYY例如PYY 3-36)與所述dAb共價地或非共價地鍵合。促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物可以直接地或通過合適的連接物部分(例如PEG連接物部分)間接地共價鍵合dAb。所述藥物或藥劑可以鍵合在dAb的任意合適的位置(諸如氨基-端、羧基-端)，或通過合適的氨基酸側鏈(例如，賴氨酸的ε氨基，或半胱氨酸的硫醇基)進行鍵合。或者，所述藥物或藥劑可以直接地(例如，靜電相互作用、疏水相互作用)或間接地(例如，通過互補的結合配偶體(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共價結合，其中一個配偶體共價地鍵合藥物或藥劑，且互補的結合配偶體共價地鍵合dAb)非共價地鍵合dAb。
[0032]本發明另外提供了本發明任一種綴合物或融合體(例如DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120、DMS 7139 或 DMS 7143 或 DMS 7143)的(基本上)純的單體。在一個實施方案中，它是至少98、99、99.5%純的或100%純的單體。
[0033]本發明也提供了編碼本文所述的融合體的核酸，例如編碼DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120、DMS 7139 或 DMS 7143 的核酸，例如其中所述核酸序列如圖2(SEQ ID NO 13-32)所示。也提供了包含這些核酸的宿主細胞。
[0034]本發明也提供了編碼dAb的氨基酸，所述dAb結合選自下述的血清白蛋白(AlbudAbs TM):D0M7h_14(SEQ ID NO 8)、D0M7h-14_10(SEQ ID NO 26)、D0M7h_ll_15(SEQID NO 27)和 DOM 7h-14_10R108C(SEQ ID NO 42)。
[0035]本發明也提供了編碼dAb的核酸，所述dAb結合選自下述的血清白蛋白:D0M7h-14(SEQ ID NO 23)、D0M7h-14_10 (SEQ ID NO 31)、D0M7h_ll_15 (SEQ ID NO 32)和DOM 7h-14-10R108C(SEQ ID NO 44)。
[0036]本發明另外提供了一種生產本發明的融合體的方法，所述方法包括:在適合表達所述重組核酸的條件下，維持宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼本發明的融合體的重組核酸和/或構建體，由此生產融合體。
[0037]本發明也提供了組合物(例如，藥物組合物)，其包含本發明的融合體或綴合物。
[0038]本發明也提供了一種治療個體的方法，所述個體具有疾病或障礙，諸如本文所述的那些，例如代謝病諸如高血糖癥、受損的葡萄糖耐受性、β細胞缺乏、糖尿病(例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖癥或特征在于進食過量的疾病，例如，所述方法可以用于抑制食欲，例如在帕-魏二氏綜合征中，且所述方法包括:給所述個體施用治療有效量的本發明的融合體或綴合物。
[0039]其它代謝障礙包括、但不限于:胰島素抗性、胰島素缺乏、超高胰島素血癥、高血糖癥、血脂異常、高脂血癥、高酮血癥、高血壓、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、腎衰竭、神經病(例如，自主神經病、副交感神經神經病和多神經病)、視網膜病變、白內障、代謝障礙(例如，胰島素和/或葡萄糖代謝障礙)、內分泌障礙、肥胖癥、體重減輕、肝障礙(例如，肝病、肝硬化和與肝移植有關的障礙)和與這些疾病或障礙有關的病癥。
[0040]另外，使用本發明的化合物可以預防或治療的與糖尿病有關的病癥包括、但不限于:高血糖癥、肥胖癥、糖尿病視網膜病變、單神經病、多神經病、動脈粥樣硬化、潰瘍、心臟病、中風、貧血、壞疽(例如，腳和手的壞疽)、陽痿、感染、白內障、腎功能減退、自主神經系統功能失常、受損的白細胞功能、腕管綜合征、Dupuytren攣縮和糖尿病酮癥酸中毒。
[0041]本發明也提供了用于治療或預防與高血糖有關的疾病的方法，所述方法包括:給患者或受試者施用至少一劑量的本發明的綴合物或融合體和/或藥物組合物。
[0042]本發明另外涉及:使用本發明的綴合物或融合體，調節患者中的胰島素響應性的方法，以及增加細胞的葡萄糖攝取的方法，和調節細胞的胰島素敏感性的方法。也提供了刺激胰島素合成和釋放的方法，增強脂肪、肌肉或肝組織對胰島素攝取的敏感性的方法，刺激葡萄糖攝取的方法，減慢消化過程的方法，或阻斷患者中胰高血糖素的分泌的方法，所述方法包括:給所述患者施用本發明的融合體或綴合物，例如施用至少一劑量的本發明的藥用綴合物或融合體和/或藥物組合物。
[0043]本發明的融合體或綴合物和/或藥物組合物可以單獨施用，或與其它分子或部分例如多肽、治療蛋白和/或分子(例如，胰島素和/或其它蛋白(包括抗體)、肽或小分子，它們調節患者中的胰島素敏感性、體重、心臟病、高血壓、神經病、細胞代謝和/或葡萄糖、胰島素或其它激素水平)組合施用。在具體實施方案中，本發明的綴合物或融合體與胰島素(或胰島素衍生物、類似物、融合蛋白或促分泌劑)組合施用。
[0044]本發明也提供了本發明的綴合物或融合體用于生產藥劑的應用，所述藥劑用于治療疾病或障礙，諸如上述那些中的任一種，例如代謝障礙諸如高血糖癥、糖尿病(I型糖尿病或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖癥。
[0045]本發明也涉及本文所述的融合體或綴合物用于治療、診斷或預防的應用。
[0046]本發明的融合體或綴合物(例如融合體的dAb組分)可以進一步格式化(formatted)成具有更大的流體動力學尺寸，以進一步延長半衰期，例如，通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白-結合部分、抗體Fe區域，或通過綴合抗體結構域。例如，結合血清白蛋白的dAb可以格式化成抗體的更大抗原結合片段(例如，格式化成 Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。
[0047]在本公開內容描述的本發明的其它實施方案中，作為在本發明的融合體中使用“dAb”的替代，預見到，技術人員可以使用這樣的結構域，其包含dAb的⑶R，例如結合血清白蛋白的DOM 7h-14、D0M 7h_14_10或DOM 7h_ll_15的CDR(例如，移植到合適的蛋白支架或骨架上的⑶R，例如affibody、SpA支架、LDL受體A類結構域或EGF結構域)。本公開內容作為整體應當相應地解釋，以提供這樣的替代dAb的結構域的公開。
[0048]在某些實施方案中，本發明提供了根據本發明的融合體或綴合物，其包含促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物和雙-特異性配體或多-特異性配體，所述配體包括根據本發明的第一 dAb (其結合血清白蛋白例如DOM 7h-14、DOM 7h_14_10或DOM 7h_ll_15)和第二dAb (其具有與第一 dAb相同或不同的結合特異性)和任選地在多-特異性配體的情況下的其它dAb。第二 dAb(或其它dAb)可以任選地結合不同的靶物，例如FgFr Ic或CD5靶物。
[0049]因而，在一個方面，本發明提供了用于通過腸胃外給藥來遞送的本發明的融合體或綴合物，所述腸胃外給藥例如通過皮下注射、肌肉內注射或靜脈內注射、吸入、鼻遞送、透粘膜遞送、經口遞送、遞送至患者的胃腸道、直腸遞送或眼遞送。在一個方面，本發明提供了本發明的融合體或綴合物在藥劑生產中的應用，所述藥劑用于下述遞送:皮下注射、吸入、靜脈內遞送、鼻遞送、透粘膜遞送、經口遞送、遞送至患者的胃腸道、直腸遞送或眼遞送。
[0050]在一個方面，本發明提供了通過皮下注射、肺遞送、靜脈內遞送、鼻遞送、透粘膜遞送、經口遞送、遞送至患者的胃腸道、直腸遞送或眼遞送來遞送給患者的方法，其中所述方法包括:給患者施用藥學有效量的本發明的融合體或綴合物。
[0051]在一個方面，本發明提供了口服的、可注射的、可吸入的、可霧化的或眼的制劑，其包含本發明的融合體或綴合物。所述制劑可以是片劑、丸劑、膠囊、液體或糖漿劑。在一個方面，所述組合物可以口服給藥，例如作為飲料，例如作為用于治療肥胖的體重減輕飲料來銷售。在一個方面，本發明提供了一種用于直腸遞送給患者的制劑，所述制劑可以提供為例如栓劑。
[0052]例如，可以如在WO 03/002136(通過引用并入本文)中所述，制備用于GLP-1化合物的腸胃外給藥的組合物。
[0053]例如，可以如在歐洲專利號272097 (授權給Novo Nordisk A/S)或在WO93/18785(都通過引用并入本文)中所述，制備用于某些肽的鼻給藥的組合物。
[0054]術語“受試者”或“個體”在本文中被定義為包括動物，如哺乳動物，包括但不限于，靈長類動物(例如人)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、馬科、犬科、貓科、哨齒動物科或鼠科物種。
[0055]本發明也提供了一種試劑盒，其用于將根據本發明的組合物(例如，本發明的綴合物或融合體)施用給受試者(例如，患者)，所述試劑盒包含組合物(例如，本發明的綴合物或融合體)、藥物遞送裝置和任選的使用說明書。所述組合物(例如，綴合物或融合體)可以提供為制劑，諸如冷凍干燥的制劑。在某些實施方案中，所述藥物遞送裝置選自:注射器、吸入器、鼻內或眼給藥裝置(例如，mister、眼或鼻滴管)和無針注射裝置。
[0056]本發明的組合物(例如綴合物或融合體)可以低壓凍干進行儲存，并在使用前在合適的載體中重構。可以使用任意合適的低壓凍干方法(例如，噴霧干燥、餅干燥)和/或重構技術。本領域技術人員會理解，冷凍干燥和重構可以導致不同程度的抗體活性損失，且可能必須調節使用水平來補償。在一個具體實施方案中，本發明提供了一種組合物，其包含本文所述的低壓凍干的(冷凍干燥的)組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)。優選地，低壓凍干的(冷凍干燥的)組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)在再水合時，其活性損失不超過約20%、或不超過約25%、或不超過約30%、或不超過約35%、或不超過約40%、或不超過約45%、或不超過約50% (例如,對血清白蛋白的結合活性)。
[0057]活性是在低壓凍干之前產生組合物效果所需要的組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)的量。例如，獲得并維持希望的血清濃度希望的時間段所需要的綴合物或融合體的量。可以在低壓凍干之前使用任意合適的方法測定組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)的活性，并可以在再水合之后使用相同方法測定活性，以測定損失的活性的量。
[0058]本發明也提供了包含本發明的融合體或綴合物的持續釋放制劑，這樣的持續釋放制劑可以包含與下述物質相組合的本發明的融合體或綴合物:例如玻璃酸、微球或脂質體和其它藥學上或藥理學上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。這樣的持續釋放制劑可以是例如栓劑形式。
[0059]在一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本發明的融合體或綴合物和藥學上或生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0060]本發明也提供了修飾的前導序列，其可以在它的C端末端處具有氨基酸序列AMA或AWA，其中所述前導序列不是野生型序列。所述修飾的前導序列可以是OmpA-AMA或-AWA ；或 OmpT-AMA 或-AWA ;或 GAS-AMA 或-AWA。
[0061]所述修飾的前導序列可以用于在宿主細胞中表達異源多肽。所述異源多肽可以包含促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物或由其組成。所述異源多肽可以包含結構域抗體(dAb)或由其組成，所述結構域抗體例如結合血清白蛋白的dAb。
[0062]由所述修飾的前導序列表達的異源多肽可以是包含下述物質或由其組成的融合體或綴合物:(a)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物，其作為與(b)的融合體或綴合物存在；
(b)dAb，例如結合血清白蛋白的dAb，例如選自下述的dAb:結合血清白蛋白且具有圖1(h)(SEQ ID NO 8)所示的氨基酸序列的DOM 7h_14 Vk結構域抗體(dAb)，具有圖1 (o) (SEQ IDNO 26)所示的氨基酸序列的DOM 7h-14-10 dAb，和具有圖1 (p) (SEQ ID NO 27)所示的氨基酸序列的DOM 7h_ll_15 dAb。
[0063]所述修飾的前導序列也可以用于表達這樣的異源多肽，其包含選自下述的融合體或由其組成:
[0064](a)2xGLP-l(7-37)A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DATO114，氨基酸序列如圖1 (a):SEQID NO I所示)
[0065](b)Exendin4(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0115，氨基酸序列如圖1(b):SEQ ID NO 2 所示)，
[0066](c)Exendin4-D0M7h-14 dAb 融合體(DAT0116，氨基酸序列如圖1 (c):SEQ ID NO3所示)。
[0067](d)Exendin4、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb融合體(DAT0117，氨基酸序列如圖1(d):SEQ ID NO 4 所示)。
[0068](e) GLP-1 (7-37) A8G(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DATO118，氨基酸序列如圖 1(e):SEQ ID NO 5 所示)，
[0069](f) GLP-1 (7-37) A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0119，氨基酸序列如圖1 (f):SEQID NO 6 所示)，
[0070](g) GLP-1 (7-37) A8G、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0120，氨基酸序列如圖 1(g):SEQ ID NO 7 所示)，
[0071](h)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h-14_10 融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖l(m):SEQ ID NO 24 所示)，
[0072](i)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_ll_15 融合體(DMS7143，氨基酸序列如圖l(n):SEQ ID NO 25 所示)。
[0073]要由所述修飾的前導序列表達的異源多肽也可以包含具有上述那些(即具有SEQID NO 1-7和SEQ ID NO 24-25所示的氨基酸序列的那些)的氨基酸序列的綴合物分子或由其組成。
[0074]要由所述修飾的前導序列表達的異源多肽也可以包含下述氨基酸序列或由其組成:Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_14_10 融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖1 (m) =SEQID NO 24所示)，或與DMS7139的氨基酸序列具有最多4個氨基酸變化的融合體或綴合物分子，所述氨基酸序列如圖1 (m)所示。
[0075]用于表達的宿主細胞可以是微生物宿主細胞、原核宿主細胞、革蘭氏陰性細菌宿主細胞或大腸桿菌宿主細胞。
[0076]也提供了一種生產下述物質的混合物的方法:(?)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物；和(ii)在促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的N-端減去2個氨基酸的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物；所述方法包括下述步驟:使用前導序列在宿主細胞中表達(i)，所述前導序列會導致在促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的I位之前裂解和3位之前裂解。促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物可以是例如與本文定義的結合血清白蛋白的dAb的融合體或綴合物的形式。本發明也提供了通過上述方法得到的或可得到的混合物。
[0077]所述前導序列可以是ompA、ompT、GAS或任一種上述修飾的序列。所述方法可以包括下述步驟:通過異源表達，在宿主細胞中生產混合物。所述宿主細胞可以是微生物宿主細胞、原核宿主細胞、革蘭氏陰性細菌宿主細胞或大腸桿菌宿主細胞。
[0078]促胰島素藥劑和腸降血糖素藥物(諸如GLP-1)具有多種治療效果，它們可以由GLP-1R(諸如刺激胰腺的葡萄糖依賴性的胰島素分泌的那些)介導。還已經提出，存在一類可以由DPPIV裂解產物GLP-19-36酰胺(或GLP-19-37)介導的作用。GLP-19-37不具有刺激胰腺的葡萄糖敏感的胰島素分泌的活性，但是已經提出它具有其它生物學效應，可能是通過非-GLP-1R驅動的機理。由于迄今為止GLP-1類分子的大多數臨床應用已經靶向糖尿病(通過胰腺GLP-1R)，已經將對DPPIV的穩定性工程化進肽中，這如下實現:通過使用非人GLP-1類似物諸如Exendin-4，或突變GLP-1中的氨基酸8或9，諸如用于Albiglutide (Syncria)中，或通過在肽的氨基末端處的化學修飾或合成修飾。另一個方案是，使用小分子DPPIV抑制劑諸如維格列汀(Galvus)和西他列汀(Januvia)，完全阻斷DPPIV活性，這會延長任何內源分泌的GLP-1的半衰期。這兩種方案均會有效地降低DPPIV代謝物GLP-19-36酰胺或GLP-19-37的水平。
[0079]然而，已經提出，DPPIV代謝物GLP-19-36酰胺或GLP-19-37具有希望的生物學效應。幾項研究已經證實，GLP-17-36酰胺的DPPIV裂解產物(即GLP-19-36酰胺，其在GLP-17-36分泌后快速地形成，且在正常條件下比GLP-17-37更豐富)可能具有生物學效應。已經為該機理提出了幾種不同的作用途徑，如下所列:
[0080]GLP-1 (9-37)是 GLP-1R 的拮抗劑二參見例如:Eur J Pharmacol.1996Dec 30;318(2-3):429-35。
[0081]胰高血糖素-樣肽-1-(9-36)酰胺是胰高血糖素-樣肽-1-(7-36)酰胺在體內施用給狗以后的主要代謝物，且它作為拮抗劑作用于胰腺受體(Knudsen LB7Pridal L.J B1lChem.1997 Aug 22 ；272 (34) =21201-6)，也是胰腺胰高血糖素-樣肽_1受體的高效價拮抗劑(Montrose-Rafizadeh C, Yang H, Rodgers BD, Beday A, Pritchette LA, Eng J.J B1lChem.1997Aug 22 ；272(34):21201-6)。
[0082]GLP-1 (9-37)通過不同機理向GLP-1 (7_37)發出信號，通過非胰島素依賴性的機理:(Am J Phys1l Endocrinol Metab.2002 Apr ；282 (4):Ε873_9.)
[0083]GLP-1-(9-36)酰胺會降低麻醉的豬的血糖，這是通過不涉及胰島素分泌的機理(Deacon CF, Plamboeck A MdIer S, Holst JJ.),
[0084]或通過在肥胖個體中起增加胰島素敏感性的作用:(Obesity (Silver Spring)。2008 Jul ；16(7):1501-9.Epub 2008 Apr 17。
[0085]GLP-1 (9-36)酰胺(即GLP-1 (7-36)酰胺的裂解產物)是一種糖調節肽(Elahi D，Egan JM, Shannon RP, Meneilly GS, Khatri A, Habener JF, Andersen DK)。
[0086]尚未證實Exendin的減去2個氨基酸形式的這種活性，因為這不是作為DPPIV裂解的結果而形成，但是對于Exendin-4的減去2個氨基酸形式的情況，這也可能的。還已經證實，在心臟作用和其它作用方面，Exendin-4通過依賴于和獨立于GLP-1R的途徑起作用(Circulat1n.2008 ;117:2340-2350:Card1protective and Vasodilatory Act1nsof Glucagon-Like Peptide I Receptor Are Mediated Through Both Glucagon-LikePeptide I Receptor-Dependent and-1ndependent Pathways Kiwon Ban, MSc ；M.HosseinNoyan-Ashraf, PhD ；Judith Hoefer, MD ；Steffen-Sebastian Bolz, MD, PhD ；DanielJ.Drucker, MD ；Mansoor Husain, MD)。這會增加下述可能性，即實際上可能存在全長和減去2個氨基酸形式的Exendin的類似的且平行的活性。
[0087]至少2個工藝途徑可用于生產促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物和減去2個氨基酸形式的混合物。
[0088]例如，可以分別生產全長GLP-17-36酰胺(以希望的半衰期延長形式諸如AlbudAb)和GLP-19-36酰胺(或希望的融合蛋白)。然后混合它們，得到具有希望比例的GLP-17-36和GLP-19-36分子的產物。可以使用2個平行的GMP工藝來生產藥物混合物。
[0089]一種替代方法是，選擇這樣的分泌信號:負責去除信號序列的信號肽酶對其不具有單個裂解位點，而是具有2個裂解位點。使用的分泌信號可以以確定的比例切割它們。因而，依賴于選擇的分泌信號，生成的比例可以是:
[0090]100% I位之前裂解，得到GLP-17_36(或其它促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物全長分子)；或100 % 3位之前裂解，得到GLP-19-36 (或其它促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物減去2個氨基酸序列)；或每種全長或減2形式在O至100之間的任意百分比。例如，所述比例可以是:
[0091 ] 90 %全長:10 %減去2個氨基酸；
[0092]80 %全長:20 %減去2個氨基酸；
[0093]75%全長:25%減去2個氨基酸；
[0094]50 %全長:50 %減去2個氨基酸；
[0095]25%全長:75%減去2個氨基酸；
[0096]20%全長:80%減去2個氨基酸；或
[0097]10%全長:90%減去2個氨基酸。
[0098]選擇適當的前導序列來產生希望的比例，將允許從一個單獨的宿主細胞進行生產。在GMP工藝方面，這是一個關鍵的優點。這允許開發兩種物質的潛在治療效果，同時保留對內源酶的穩定性。
[0099]還用氨基端二肽酶處理整個范圍的其它內源肽和類似物，產生最初的全長分子和/或二肽酶敏感的物質。因而，該方案可以用于生產任意肽和蛋白，其中單個生產運行可以產生長度相差幾個氨基酸的2種物質的確定的混合物，其中相差的氨基酸包含信號肽酶的識別位點的一部分。可能在哺乳動物、真核或原核宿主細胞中(例如在大腸桿菌中)利用該方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
:
[0100]圖1:是下述氨基酸序列的圖解:(a) DATOl 14 (SEQ ID NO I), (b) DATOl 15 (SEQ IDNO 2)， (c)DATOI16(SEQ ID NO 3)， (d)DATOl17(SEQ ID NO 4)， (e)DATOl18(SEQ ID NO 5)，(f)DATO119(SEQ ID NO 6)，(g)DATO120(SEQ ID NO 7)，(h)DOM 7h_14(SEQ ID NO 8) (dAb)(CDR 標有下劃線)，(i) GLP-17-37 A (8) G (SEQ ID NO 9)，(j) Exendin-4 (SEQ ID NO 10)，(k)螺旋連接物(SEQ ID NO 11)，(l)Gly-ser 連接物(SEQ ID NO 12)，(m)DMS 7139 (SEQID NO 24，(n)DMS 7143 (SEQ ID NO 25)，(o)DOM 7h_14_10(SEQ ID NO 26) (dAb) (CDR 標有下劃線)，(P)DOM 7h-l 1-15 (SEQ ID NO 27) (dAb) (CDR 標有下劃線)，(q) OmpT AWA 信號肽(前導序列)(SEQ ID NO 28)，(r) D0M7h-14-10R108C (SEQ ID NO 42)，(s)PYY 3-36 (具有在10位的賴氨酸)(SEQ ID NO 43)。
[0101]圖2:是下述核酸序列的圖解:(a)DAT0114(哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 13)，
(b)DAT0115(哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 14)，(c)DAT0115 (為大腸桿菌構建體優化)(SEQID NO 15)，(d) DATOl 16(哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 16)，(e)DAT0116 (為大腸桿菌構建體優化)(SEQ ID NO 17)，(f) DATOl 17 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 18)，(g) DATOl 17 (為大腸桿菌構建體優化)(SEQ ID NO 19)，(h) DATOl 18 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 20)，(i) DATOl 19 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO 21)，(j)DAT0120 (哺乳動物構建體)(SEQ ID NO22)，(k)Dom7h-14(SEQ ID NO 23)，(I)DMS 7139 (SEQ ID NO 29，(m)DMS 7143 (SEQ ID NO30)， (n)Dom7h-14-10(SEQ ID NO 31)(dAb)， (o)DOM7h_l1-15(SEQ ID NO 32)(dAb)， (p)OmpAWA 信號肽(SEQ ID NO 33)，(q) DOM 7h_14_10 R108C(dAb) (SEQ ID NO 44)，(r)食蟹猴的cDNA (SEQ ID NO 45)，(s)寡核苷酸 I (SEQ ID NO 47)，(t)寡核苷酸 2 (SEQ ID NO 48)，(u)用于在大腸桿菌中表達的DMS 7139的核酸序列(SEQ ID NO 50)。
[0102]圖3:(a)顯示了通過施用DAT0115造成的肥胖癥小鼠模型的劑量依賴性的體重減輕，(b)顯示了通過施用DAT0115造成的肥胖癥小鼠模型的每日攝食量。
[0103]圖4:顯示了 DATOl 15的DSC:實線-DATOl 15跡線，虛線-擬合非_2_態模型。
[0104]圖5:顯示了溶菌酶的DSC:實線-溶菌酶跡線，虛線-擬合非-2-態模型(跡線疊力口，所以不可看到虛跡線)。
[0105]圖 6:顯示了 DATOl 15 的 SEC MALLS。
[0106]圖7:顯示了 DATOl 17 的 SEC MALLS。
[0107]圖 8:顯示了 DATO120 的 SEC MALLS。
[0108]圖9:顯示了前導序列的氨基酸序列:(a) ompA(大腸桿菌來源的)(SEQ ID NO34)，(b) ompA-AMA (人工序歹丨J) (SEQ ID NO 35)，(c) ompA-AWA (人工序歹丨J) (SEQ ID NO 36)，
(d)ompT (大腸桿菌來源的)(SEQ ID NO 37)，(e) ompT-AMA (人工序列)(SEQ ID NO 38)，(f) GAS (釀酒酵母來源的)(SEQ ID NO 39)，(g) GAS-AMA (人工序列)(SEQ ID NO 40)，(h)GAS-AWA(人工序列)(SEQ ID NO 41)，(i)Pel B(胡蘿卜軟腐歐文氏菌)(SEQ ID NO 46)，(j)Mal E (人工序列)(SEQ ID NO 49)。
[0109]圖10:顯示了通過質譜法分析的純化的DMS7139。
[0110]圖11:顯示了血糖降低的統計顯著性的圖解，包括DAT0115和對照之間、DMS7139和對照之間、以及DMS7139和DAT0115之間的對比，(a)顯示了研究設計，(b)葡萄糖AUC的圖解表示。沒有覆蓋水平線的置信區間是顯著的。
[0111]圖12:表明，與D0M7h-14對照相比，重復劑量的DMS7139顯示出劑量-依賴性的HbAlc降低。
[0112]圖13:表明，在肥胖癥D1小鼠模型中，與D0M7h-14對照相比，DAT0115和DMS7139顯示出攝食量和體重的劑量-依賴性減少。在圖中，meg =微克。
[0113]圖14:顯示了一種肽綴合物，它是:通過賴氨酸(導入在PYY的10位)和4個重復PEG連接物綴合到C-端酰胺化的PYY3-36上的D0M7h_14_10 (R108C) AlbudAbs。線代表連接物，其共價地連接至D0M7h-14-10 (R108C) AlbudAb的游離C端半胱氨酸和在PYY序列的10位處的賴氨酸。該肽綴合物的氨基酸序列和結構如下。
[0114]圖15:表明，與媒介物對照相比，DMS7605表現出劑量依賴性的體重減輕。
【具體實施方式】
[0115]在本說明書中已經參照實施方案描述了本發明，描述方式使得本說明書能夠既清楚又簡明。但是應當理解，在不偏離本發明的情況下，可以對這些實施方案進行各種組合或分開。
[0116]除非另有說明，否則本文所用的所有科技術語都具有本領域(例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員公知的相同含義。將標準技術用于分子、遺傳和生化方法(一般參見Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular B1logy (1999)第 4 版，Johnffiley&Sons, Inc.,所述文獻通過引用并入本文)和化學方法。
[0117]本文使用的術語“促胰島素藥劑”是指，能夠刺激激素胰島素、或引起激素胰島素的刺激、合成或表達或活性的化合物。促胰島素藥劑的已知實例包括、但不限于:例如葡萄糖、GIP、GLP> Exendin (例如 Exendin-4 和 Exendin-3)、PYY 和 0XM。
[0118]本文使用的術語“腸降血糖素”是指一類胃腸激素，其在葡萄糖水平正常時或特別是升高時，會引起釋放的胰島素的量增加。作為實例，它們包括GLP-1、GIP、0XM、PYY(例如PYY 3-36)、VIP 和 PP (胰腺多肽)。
[0119]本文關于多肽所用的術語“類似物”是指修飾的肽，其中肽的一個或更多個氨基酸殘基已經被其它氨基酸殘基置換，和/或其中一個或更多個氨基酸殘基已經從肽刪除，和/或其中一個或更多個氨基酸殘基已經從肽刪除，和/或其中一個或更多個氨基酸殘基已經添加至肽。這樣的氨基酸殘基的添加或刪除可以發生在肽的N-端和/或肽的C-端，或它們可以在肽內部。使用簡單的系統來描述GLP-1的類似物:例如GLP-1 A8G(7-37個氨基酸)指定GLP-1類似物，其中在8位的天然存在的丙氨酸已經被甘氨酸殘基置換。使用根據IUPAC-1UB命名法所用的氨基酸標準單字母縮寫，描繪肽類似物及其衍生物的通式。
[0120]當提及多肽使用時，本文使用的“片段”是具有這樣氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與整個天然存在的多肽的一部分，但是并非其所有氨基酸序列相同。片段可以是“獨立的”，或被包含在更大多肽內，它們作為單個更大多肽中的單個連續區域，形成所述更大多肽的一部分或區域。作為實例，天然存在的GLP-1的片段包括天然存在的氨基酸1-36的氨基酸7-36。此外，多肽的片段也可以是天然存在的部分序列的變體。例如，包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-30的GLP-1片段也可以是在它的部分序列內具有氨基酸置換的變體。
[0121]本發明的合適的促胰島素藥劑的實例包括:GLP_1、GLP-1衍生物、GLP-1類似物、或GLP-1類似物的衍生物。另外，它們包括Exendin-4、Exendin-4類似物和Exendin-4衍生物或片段和Exendin-3、Exendin-3衍生物和Exendin-3類似物。
[0122]本文使用的術語“GLP-1” 是指 GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)、GLP-1 (7-35)、GLP-1 (7-38)、GLP-1 (7-39)、GLP-1 (7-40)、GLP-1 (7-41) ,GLP-1 類似物、GLP-1 肽、GLP-1 衍生物、或GLP-1類似物的突變體或片段或衍生物。這樣的肽、突變體、類似物和衍生物是促胰島素藥劑。
[0123]例如GLP-1可以是具有圖1⑴:SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的GLP-1 (7-37)A8G突變體。
[0124]在國際專利申請號90/11296 (The General Hospital Corporat1n)中描述了其它GLP-1類似物，該專利申請涉及包含GLP-1 (7-36)和其功能衍生物的肽片段，所述肽片段的促胰島素活性超過GLP-1 (1-36)或GLP-1 (1-37)的促胰島素活性，還涉及它們作為促胰島素藥劑的應用(通過引用并入本文，特別作為用于本發明中的藥物的實例)。
[0125]國際專利申請號WO 91/11457 (Buckley等人)公開了有活性的GLP-1肽7-34、7-35,7-36和7-37的類似物，它們也可以用作根據本發明的GLP-1藥物。
[0126]本文使用的術語“Exendin-4 妝”是指 Exendin-4 (1-39)、Exendin-4 類似物、Exendin-4肽的片段、Exendin-4衍生物、或Exendin-4類似物的衍生物。這樣的肽、片段、類似物和衍生物是促胰島素藥劑。Exendin-4(1-39)的氨基酸序列如圖1 (j):SEQ ID NO10所示。
[0127]在PCT 專利公開 WO 99/25728 (Beeley 等人)、TO 99/25727 Beeley 等人)、WO98/05351 (Young 等人)、WO 99/40788 (Young 等人)、WO 99/07404 (Beeley 等人)和 WO99/43708 (Knudsen等人)(都通過引用并入本文，特別作為用于本發明中的藥物的實例)中，描述了可用于本發明中的其它Exendin-類似物。
[0128]本文使用的“肽”表示通過肽鍵連接到一起的約2至約50個氨基酸。
[0129]本文使用的“多肽”表示通過肽鍵連接到一起的至少約50個氨基酸。多肽通常包含三級結構，并折疊成功能結構域。
[0130]本文使用的“展示系統”表示這樣的系統，其中對于基于希望的特性(諸如物理的、化學的或功能的特性)的選擇，可以得到多肽或肽的集合。所述展示系統可以是多肽或肽(例如，在溶液中，固定化在合適的支持物上)的合適集合。所述展示系統也可以是采用細胞表達系統(例如，在例如轉化的、感染的、轉染的或轉導的細胞中表達核酸文庫，和在細胞表面上展示編碼的多肽)或無細胞表達系統(例如，乳液區室化和展示)的系統。示例性的展示系統將核酸的編碼功能與所述核酸編碼的多肽或肽的物理的、化學的和/或功能的特性相關聯。當采用這樣的展示系統時，可以選擇具有希望的物理的、化學的和/或功能的特性的多肽或肽，并可以容易地分離或回收編碼選擇的多肽或肽的核酸。許多將核酸的編碼功能與多肽或肽的物理的、化學的和/或功能的特性相關聯的展示系統是本領域已知的，例如，曬菌體展示(曬菌體展示，例如曬粒展示)、核糖體展示、乳液區室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質粒上展示、共價展示等(參見，例如，EP 0436597 (Dyax)，美國專利號6，172，197 (McCafferty等人)，美國專利號6，489，103 (Griffiths 等人))。
[0131]本文使用的“有功能的”描述了具有生物活性(諸如特異性的結合活性)的多肽或肽。例如，術語“有功能的多肽”包括通過它的抗原-結合位點結合靶抗原的抗體或其抗原結合片段。
[0132]本文使用的“靶配體”表示被多肽或肽特異性地或選擇性地結合的配體。例如，當多肽是抗體或其抗原結合片段時，靶配體可以是任意希望的抗原或表位。與靶抗原的結合依賴于有功能的多肽或肽。
[0133]本文使用的“抗體”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab，)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙特異抗體)，無論是源自天然地產生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術制備；無論分離自下列哪種樣品:血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌。
[0134]本文使用的“抗體形式”表示任意合適的多肽結構，其中可以摻入一個或更多個抗體可變結構域，從而賦予該結構對抗原的結合特異性。多種合適的抗體形式是本領域已知的，例如，嵌合的抗體、人源化的抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性的抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體、任意前述物質的抗原-結合片段(例如，Fv片段(例如，單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、單個抗體可變結構域(例如，dAb、Vi^VmnV1J和任意前述物質的修飾形式(例如,通過共價連接聚乙二醇或其它合適的聚合物或人源化的Vhh進行修飾)。
[0135]短語“免疫球蛋白單個可變結構域”表示獨立于其它V區或結構域而特異性地結合抗原或表位的抗體可變結構域(VH、VHH, Vl)。免疫球蛋白單個可變結構域可以以含有其它可變區或可變結構域的形式(例如，同源多聚體或異源多聚體)存在，其中其它區域或結構域不是單個免疫球蛋白可變結構域的抗原結合所必需的(即其中免疫球蛋白單個可變結構域與抗原的結合獨立于另外的可變結構域)。“結構域抗體”或“dAb”與本文所用的術語“免疫球蛋白單個可變結構域”同義。“單個免疫球蛋白可變結構域”與本文所用的術語“免疫球蛋白單個可變結構域”同義。“單個抗體可變結構域”與本文所用的術語“免疫球蛋白單個可變結構域”同義。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域是人抗體可變結構域，但是也包括來自其它物種的單個抗體可變結構域，諸如嚙齒動物(例如，如在WO 00/29004中所公開的，其內容通過引用整體并入本文)、鉸口鯊和駱駝科(Camelid)VHHdAb。駱駝科Vhh是這樣的免疫球蛋白單個可變結構域多肽:其源自包括駱駝、美洲駝羊、羊駝、單峰駱駝和原駝在內的物種，且生產天然地缺少輕鏈的重鏈抗體。所述Vhh可以是人源化的。
[0136]“結構域”是折疊的蛋白結構，它具有獨立于蛋白的其余部分的三級結構。通常，結構域負責蛋白的離散的功能性質，并且在許多情況下可以添加、去除或轉移給其它蛋白，而不喪失該蛋白和/或該結構域的其余部分的功能。“單個抗體可變結構域”是折疊的多肽結構域，其包含抗體可變結構域特有的序列。因此，它包括完整的抗體可變結構域和修飾的可變結構域(例如，其中一個或更多個環已經被不是抗體可變結構域特有的序列所置換)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗體可變結構域，以及至少保留全長結構域的結合活性和特異性的可變結構域的折疊片段。
[0137]術語“文庫”表示異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員都具有單個多肽或核酸序列。就這一方面而言，“文庫”和“集合”同義。文庫成員之間的序列差異會造成文庫中存在的多樣性。文庫可以是多肽或核酸的簡單混合物的形式，或者可以是用核酸文庫轉化的生物體或細胞的形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等。在一個實施方案中，每個單個的生物體或細胞僅含有一個或有限數目的文庫成員。在一個實施方案中，將核酸摻入到表達載體中，以表達該核酸所編碼的多肽。因此，在一個方面，文庫可以是宿主生物體群體的形式，每個生物體含有一個或更多個表達載體拷貝，所述載體含有核酸形式的文庫的單個成員，該成員可以被表達而產生其相應的多肽成員。因此,宿主生物體群體具有編碼多種多肽的集合的潛力。
[0138]本文使用的術語“劑量”表示施用給受試者的融合體或綴合物的量，所述施用是一次性全部施用(單位劑量)，或在確定的時間段內的2次或更多次施用。例如，劑量可以表示在I天(24小時)(日劑量)、2天、I周、2周、3周或I個月或更多個月的過程中施用給受試者的融合體或綴合物的量(例如通過單次施用，或通過2次或更多次施用)。給藥之間的間隔可以是任何希望的時間量。
[0139]短語“半衰期”表示融合體或綴合物的血清或血漿濃度在體內降低50 %所需要的時間，例如因為天然機制所致降解和/或清除或隔離。本發明的融合體或綴合物在體內是穩定的，其半衰期因結合抵抗降解和/或清除或隔離的血清白蛋白分子(例如人血清白蛋白(HSA))而延長。這些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白，它們本身在體內的半衰期較長。如果分子的功能活性在體內的持續時間比對延長半衰期的分子不具有特異性的類似分子更長的話，則該分子的半衰期延長。例如，將本發明的包含對人血清白蛋白(HSA)特異性的dAb和腸降血糖素藥物或促胰島素藥劑(諸如GLP-1或Exendin)的融合體或綴合物與相同配體(其中不存在對HSA的特異性，即不結合HSA，但是結合另一種分子。例如，它可以結合細胞上第三靶物)相比較。通常，半衰期延長10%、20%、30%、40%、50%或以上。2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x、300x或以上的半衰期延長范圍是可能的。或者，或另外，最高達 30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x、200x、300x、400x 的半衰期延長范圍也是可能的。
[0140]本文使用的“流體動力學尺寸”表示，基于分子在水溶液中的擴散，分子(例如，蛋白分子、配體)的表觀尺寸。可以處理蛋白在溶液中的擴散或運動，以衍生出蛋白的表觀尺寸，其中所述尺寸由蛋白顆粒的“Stokes半徑”或“流體動力學半徑”給出。蛋白的“流體動力學尺寸”取決于質量和形狀(構象)，所以具有相同分子量的兩種蛋白可能具有不同的流體動力學尺寸(基于蛋白的總構象)。
[0141]如下進行兩個序列之間的“同源性”或“同一性”或“相似性”(這些術語在本文可互換使用)的計算。為了最佳比較目的，比對序列(例如對于最佳比對，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個或兩個中引入缺口，為了比較目的，非同源序列可以忽略不計)。在一個實施方案中，為了比較目的所比對的參照序列的長度是參照序列長度的至少30 %、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、80 %、90 %、100 %。然后，比較在相應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的某個位置被與第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，那么分子在該位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。兩個序列之間的同一性百分比隨考慮缺口數和各缺口長度后的序列共享的相同位置數而變化，需要引入這些缺口以進行兩個序列的最佳比對。使用采用默認參數的算法BLAST 2 Sequences (Tatusova, Τ.Α.等人，FEMS Microb1l Lett, 174:187-188 (1999)，可以準備和測定氨基酸和核苷酸序列比對以及如本文定義的同源性、相似性或同一性。
[0142]核酸、宿主細胞:
[0143]本發明涉及分離的和/或重組的核酸，它們編碼本文所述的本發明的融合體，例如由SEQ ID NO 13-23編碼的那些。
[0144]在本文中稱作“分離的”核酸是，已經與在它的原始環境中(例如，在細胞中，或在核酸的混合物諸如文庫中)的其它物質(例如，其它核酸，諸如基因組DNA、cDNA和/或RNA)分離的核酸。分離的核酸可以分離為載體(例如，質粒)的一部分。
[0145]在本文中稱作“重組的”核酸是，已經通過重組DNA方法生產的核酸，所述重組DNA方法包括依賴于人工重組的方法，諸如克隆進載體或染色體中(其中使用例如限制性酶、同源重組、病毒等)，以及使用聚合酶鏈式反應(PCR)制備的核酸。
[0146]本發明也涉及重組宿主細胞例如哺乳動物或微生物，其包含(一種或更多種)重組核酸或表達構建體，它們包含編碼本文所述的本發明的融合體的核酸。還提供了制備本文所述的本發明的融合體的方法，所述方法包括:在適合表達融合體多肽的條件下，維持本發明的重組宿主細胞，例如哺乳動物或微生物。如果需要，所述方法可以另外包括分離或回收融合體的步驟。
[0147]例如，使用任意適合選定的宿主細胞的方法(例如，轉化、轉染、電穿孔、感染)，可以將編碼本發明的融合體多肽的核酸分子(即，一個或更多個核酸分子)或包含這樣的核酸分子的表達構建體(即，一個或更多個構建體)導入合適的宿主細胞中，使得所述核酸分子可操作地連接至一個或更多個表達控制元件(例如，在載體中，在通過細胞中的過程建立的構建體中，整合進宿主細胞基因組中)，以制備重組宿主細胞。可以在適合表達的條件下(例如，在有誘導物存在下，在合適的動物中，在補充了適當的鹽、生長因子、抗生素、營養補劑等的合適的培養基中)，維持得到的重組宿主細胞，由此生產編碼的肽或多肽。如果需要，可以分離或回收編碼的肽或多肽(例如，從動物、宿主細胞、培養基、乳汁)。該方法包括在轉基因動物的宿主細胞中表達(參見，例加，WO 92/03918,GenPharm Internat1nal)。
[0148]也可以在合適的體外表達系統中生產本文所述的本發明的融合體多肽，例如通過化學合成，或通過任意其它合適的方法。
[0149]如本文所述和例證的，本發明的融合體或綴合物通常會以高親和力結合血清白蛋白。
[0150]例如，本發明的融合體或綴合物可以以約5微摩爾至約10pM (例如約I微摩爾至約 ΙΟΟρΜ，例如約 5-50nm，例如約 10_30nm，例如約 20_30nm)的親和力(KD ；KD = Koff (kd)/Kon(ka)[通過表面等離子體共振測定])結合人血清白蛋白。
[0151]可以在大腸桿菌中或在畢赤酵母物種(例如，巴氏畢赤酵母)中表達本發明的融合體或綴合物，也可以在任意酵母或真菌細胞中表達它們。在一個實施方案中，當在大腸桿菌中或在畢赤酵母物種(例如，巴氏畢赤酵母)中或在哺乳動物細胞培養物(例如CHO或HEK 293細胞)中表達時，以至少約0.5mg/L的量分泌融合體。盡管當在大腸桿菌中或在畢赤酵母物種中或在哺乳動物細胞中表達時，本文所述的融合體或綴合物可以是可分泌的，但是可以使用任意合適的方法來生產它們，所述方法例如合成化學方法或不采用大腸桿菌或畢赤酵母物種的生物生產方法。
[0152]在某些實施方案中，當施用有效量時，本發明的融合體和綴合物在動物模型中是有效的，所述動物模型例如在WO 2006/059106(例如在公開的WO 2006/059106的第104-105頁)中描述的那些，或在本文的實施例中描述的那些。一般而言，有效量是約0.0001mg/kg 至約 10mg/kg(例如，約 0.001mg/kg 至約 10mg/kg,例如約 0.001mg/kg 至約lmg/kg,例如約0.01mg/kg至約lmg/kg,例如約0.01mg/kg至約0.lmg/kg)。本領域技術人員公認所述疾病模型能夠預測在人類中的治療效能。
[0153]通常，本發明的融合體和綴合物以純化形式與藥理上或生理學上合適的載體一起使用。通常，這些載體可以包括水性溶液或醇/水溶液、乳劑或混懸劑，任一種包括鹽水和/或緩沖介質。胃腸外媒介物可以包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉以及乳酸化的林格液。如果需要在混懸劑中維持多肽復合物的話，則可以從增稠劑中選出合適的生理上可接受的輔料，這些增稠劑例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。
[0154]靜脈內的媒介物包括流體和營養補充劑和電解質補充劑，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 16 版)。各種合適的制劑都可米用，包括延長釋放制劑。
[0155]根據本發明的藥物組合物的給藥途徑可以為本領域普通技術人員公知的任何途徑。對于治療，可以根據標準技術，將本發明的藥用融合體或綴合物施用給任何患者。
[0156]可通過任何合適的方式進行施用，包括胃腸外、靜脈內、肌肉內、腹膜內、口服、透皮、通過肺途徑，或者在合適時用導管直接輸注。給藥的劑量和頻率取決于患者年齡、性別和狀況、同時施用的其它藥物、禁忌和臨床醫生要考慮的其它參數。按照指示，可以局部給藥或全身給藥。
[0157]在一個實施方案中，本發明提供了一種用于遞送給肺的肺制劑，其包含:(a)本發明的綴合物或融合體，和(b)藥學上可接受的緩沖液，其中所述組合物包含液滴，且存在于組合物中的約40%或更多(例如50%或更多)的液滴具有在下述范圍內的尺寸:小于約6微米，例如約I微米至約6微米,例如小于約5微米,例如約I至約5微米。這些組合物例如特別適合通過直接局部肺遞送來施用給受試者。這些組合物可以例如直接地施用給肺，例如通過吸入，例如通過使用噴霧器裝置。這些用于肺遞送的組合物可以包含生理上可接受的緩沖液，其具有約4至約8 (例如約7至約7.5)的pH范圍和這樣的粘度:其大致等于約2%至約10% PEG 1000在含有1.2% (w/v)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。
[0158]本發明的融合體或綴合物可以低壓凍干進行儲存，并在使用前在合適的載體中重構。已經證實，該技術對于常規免疫球蛋白是有效的，且可以采用本領域已知的冷凍干燥和重構技術。本領域技術人員會理解，冷凍干燥和重構可以導致不同程度的抗體活性損失(例如對于常規免疫球蛋白，IgM抗體傾向于具有比IgG抗體更大的活性損失)，且可能必須向上調節使用水平來補償。
[0159]對于預防應用而言，例如當施用給具有前驅糖尿病或胰島素抗性的個體時，也可以以類似或稍低的劑量施用含有本發明的融合體或綴合物的組合物，以預防、抑制或延遲疾病發作(例如，維持緩解或靜止狀態，或者預防急性期)。熟練的臨床醫生能夠確定合適的給藥間隔，以治療、抑制或預防疾病。當施用本發明的融合體或綴合物來治療、抑制或預防疾病時，可以施用最多每天4次、每周兩次、每周一次、每兩周一次、每月一次或每兩月一次，劑量為例如約0.0001mg/kg至約10mg/kg (例如，約0.001mg/kg至約10mg/kg,例如約0.00 lmg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0.0 lmg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0.0 lmg/kg 至約 0.1mg/kg)。
[0160]用本文所述的組合物進行的治療被視為“有效”的條件是:相對于治療前存在的所述癥狀，或者相對于未用所述組合物或其它合適對照治療的個體(人或模型動物)中的所述癥狀，一種或更多種癥狀減輕(例如減輕至少10%或在臨床評價量表中至少一個點)。盡管癥狀隨所針對的疾病或障礙的確切性質而明顯不同，但是可以由一般熟練的臨床醫生或技術人員進行測定。
[0161]類似地，如果相對于未經所述組合物治療的類似個體(人或動物模型)的所述癥狀，一種或更多種癥狀的發作或嚴重程度延遲、減少或消除，則用本文所述的組合物進行的預防是“有效”的。
[0162]本發明的融合體和綴合物可以作為單獨施用的組合物來使用，或它們可以與其它治療劑或活性劑(例如其它多肽或肽或小分子)結合施用。這些其它的藥劑可以包括各種藥物，例如二甲雙胍、胰島素、格列酮類(例如羅格列酮)、免疫抑制劑、免疫刺激劑。
[0163]本發明的融合體和綴合物可以與一種或更多種額外的治療劑或活性劑一起施用和/或配制。當本發明的融合體或綴合物與額外的治療劑一起施用時，可以在額外的藥劑之前、同時、一起或之后，施用所述融合體或綴合物。通常，以提供重疊的治療效果的方式，施用本發明的融合體或綴合物和額外的藥劑。
[0164]半衰期:
[0165]促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如GLP-1或Exendin配體)的增加的半衰期可用于體內用途中。本發明如下解決了該問題:通過提供促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如GLP和Exendin)的增加的體內半衰期,并從而提供這些分子的功能活性在體內的更長持續時間。
[0166]如本文所述，與單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，本發明的組合物(即包含本文所述的融合體或綴合物)可以具有顯著延長的體內血清或血漿半衰期和/或增加的AUC和/或增加的平均停留時間(MRT)。另外，在本發明的組合物(例如，綴合物或融合體)中，促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的活性通常基本上不改變。然而，與單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，本發明組合物的活性的某些變化是可接受的，且通常會被本發明的綴合物或融合體的改良的藥代動力學性質補償。例如，本發明的藥用綴合物或融合體可以以比單獨的藥物更低的親和力結合藥物靶物，但是與單獨的藥物相比具有大致等效或更優的效能，這是由于藥物組合物的改良的藥代動力學性質(例如，延長的體內血清半衰期。更大的AUC)。另外，由于本發明的綴合物或融合體的增加的半衰期，它們可以以比單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物更低的頻率施用，例如它們可以每月一次或每周一次地施用給患者，并且與施用單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，它們也達到促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物在血液中的更恒定的水平，從而實現希望的治療效果或預防效果。
[0167]藥代動力學分析方法和配體半衰期的測定方法是本領域技術人員所熟知的。細節可以參見:Kenneth, A 等人:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook forPharmacists,和Peters等人，Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(1996)。也參見:“Pharmacokinetics”，M Gibaldi&D Perron, Marcel Dekker 出版，2nd Rev.exedit1n (1982)，它描述了藥代動力學參數諸如t α和半衰期和曲線下面積(AUC)。
[0168]從配體相對于時間的血漿或血清濃度曲線，可以確定半衰期(tl/2a和tl/2i3)和 AUC 和 MRT。可以使用 WinNonlin 分析包(可從 Pharsight Corp.，Mountain View,CA94040，USA得到)，例如，建立曲線的模型。在第一階段(α階段)，配體主要進行在患者中的分布，具有一些消除。第二階段(β階段)是末期，這時配體已經分布，且血清濃度隨著配體從患者清除而降低。ta半衰期是第一階段的半衰期，半衰期是第二階段的半衰期。另外，本領域眾所周知的無分區擬合模型也可以用于確定半衰期。
[0169]在一個實施方案中，本發明提供了根據本發明的融合體或綴合物，其在例如人受試者中具有在下述范圍內的消除半衰期:約12小時或更長，例如約12小時至約21天，例如約24小時至約21天，例如約2-10天，例如約3-4天。
[0170]本發明的融合體或綴合物也可以進一步格式化成具有更大的流體動力學尺寸，例如，通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白-結合部分、抗體Fe區域,或通過綴合抗體結構域。
[0171]使用本領域眾所周知的方法，可以測定流體動力學尺寸。例如，可以使用凝膠過濾色譜法來測定配體的流體動力學尺寸。適用于測定配體的流體動力學尺寸的凝膠過濾基質(諸如交聯的瓊脂糖基質)是眾所周知的，且可容易地得到。
[0172]本發明的組合物(即包含本文所述的融合體和綴合物的那些)會提供幾個另外的優點。所述結構域抗體組分是非常穩定的，比抗體和抗體的其它抗原-結合片段更小，可以通過在大腸桿菌或酵母(例如，巴氏畢赤酵母)中表達來高產量地生產，且可以從人來源文庫或從任意希望的物種容易地選擇結合血清白蛋白的抗體的抗原-結合片段。因此，可以比通常在哺乳動物細胞中生產的治療劑(例如，人抗體、人源化的抗體或嵌合的抗體)更容易地生產本發明的包含結合血清白蛋白的dAb的組合物，且可以使用非免疫原性的dAb (例如，人dAb可以用于治療或診斷人的疾病)。
[0173]當促胰島素藥劑或腸降血糖素是含有結合血清白蛋白的dAb的藥物組合物的一部分時，可以降低促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的免疫原性。因此，本發明提供了一種融合體或綴合物組合物，其在含有結合血清白蛋白的dAb的藥物組合物的背景下，可以具有更低的免疫原性(例如相對于單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素)，或可以是基本上無免疫原性的。因而，這樣的組合物可以在一段時間內重復施用給受試者，且具有最小的由受試者的免疫系統產生抗-藥物抗體而引起的效能損失。
[0174]另外，與單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素相比，本文所述的綴合物或融合體組合物可以具有增加的安全性特性和更少的副作用。例如，作為dAb的血清白蛋白-結合活性的結果，本發明的融合體和綴合物在血管循環中具有增加的停留時間。另外，本發明的融合體和綴合物在全身給藥(例如，血管內給藥)后基本上不能穿過血腦屏障和積累在中樞神經系統中。因此，與單獨的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，本發明的融合體或綴合物可以以更大的安全性和更小的副作用來施用。類似地，與單獨的藥物相比，所述融合體或綴合物可以具有減小的對特定器官(例如，腎臟或肝臟)的毒性。
[0175]實施例:
[0176]實施例1:GLP-1 (A8G)或 Exendin-4 和 D0M7h_14 AlbudAb 的遺傳融合體的表達:
[0177]將Exendin-4或GLP-1 (7-37)(在8位的丙氨酸被甘氨酸替換([Gly8]GLP_l))作為與D0M7h-14(結合血清白蛋白的結構域抗體(dAb) (AlbudAb)，其具有下示的氨基酸序列)的融合體克隆進PTT-5載體(可從加拿大的CNRC得到)中。在每種情況下，GLP-1或Exendin-4是在構建體的5’末端處，dAb是在3’末端處。總之，制備了 7個構建體(DAT0114、DAT0115, DATOl 16, DAT0117、DATOl 18, DATOl 19, DAT0120)，它們具有圖1 (A-G)所示的氨基酸序列。沒有連接物，或具有gly-ser連接物(G4S)或螺旋連接物(Arai, R.,H.Ueda,等人(2001).“Design of the linkers which effectively separate domainsof a bifunct1nal fus1n protein.，，Protein Eng 14(8):529-32.456)或由 GLP-1 或Exendin-4和dAb之間的第二個GLP-1部分組成的連接物。所述連接物被包括作為間隔物，以使GLP-1或Exendin-4在空間上與dAb分離，從而防止GLP-1或Exendin-4和GLP-1受體之間的結合的位阻。構建體的序列如圖1(A-G)所示。
[0178]使用堿性裂解，在大腸桿菌中制備無內毒素的DNA(使用無內毒素的質粒Giga試劑盒，可從Qiagen CA得到)，并用于轉染HEK293E細胞(可從加拿大的CNRC得到)。每個燒瓶使用 333ul 293fectin(Invotrogen)和 250ug DNA,以 1.75xl06 細胞/ml,轉染進250ml/燒瓶的HEK293E細胞，并在30°C表達5天。通過離心，收獲上清液，并通過在蛋白L上的親和純化進行純化。使蛋白分批結合樹脂(填充在柱上)，并用10柱體積的PBS洗滌。用50ml 0.1M甘氨酸pH2洗脫蛋白，并用Tris pH8中和。在SDS-PAGE凝膠上鑒別預期尺寸的蛋白，尺寸如下面的表I所示。
[0179]表1:DAT0114、DATOl 15、DATOl 16、DATOl 17、DATOl 18、DATOl 19、DAT0120 的分子量
[0180]
融合蛋白 j預期的分子量
DATOl1418256
DATOl1516896
DATOl1615950
DATOl1719798
DATOl1815936
DATOl1915318
DAT012018895
[0181]實施例2:證實GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs融合體會結合血清白蛋白:
[0182]通過表面等離子體共振(Biacore AB,可從GE Healthcare得到)，分析GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs融合體，以得到關于親和力的信息。使用被血清白蛋白包被的CM5Biacore芯片(羧甲基化的葡聚糖基質)，進行分析。將每種要測試的血清白蛋白(人、大鼠和小鼠血清白蛋白)的約1000個共振單元(RU)在乙酸鹽緩沖液pH5.5中固定化。B1coreAB的流動池I是未包被的、阻斷的陰性對照，流動池2被人血清白蛋白(HSA)包被(815RU)，流動池3被大鼠血清白蛋白(RSA)包被(826 RU)，流動池4被小鼠血清白蛋白(MSA)包被(938 RU)。如上面的實施例所述，在哺乳動物組織培養物中表達測試的每種融合體分子。
[0183]如下制備融合體分子的濃度范圍(在16ηΜ-2 μ M范圍內):在BIACORE HBS-EP緩沖液(0.0lM HEPES, pH7.4,0.15M NaCl, 3mM EDTA，0.005% 表面活性劑 P20)中稀釋，并流過BIACORE芯片。
[0184]通過使結合速率(on-rate)和解離速率(off-rate)曲線擬合dAb在KD區域中的濃度所產生的跡線，從BIACORE跡線計算親和力(KD)。親和力(KD)總結在下面的表2中:
[0185]表2 =GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs對人、大鼠和小鼠血清白蛋白的結合
[0186]
GLP-1 (7-37)A8G，螺旋連 j 2xGLP-l (7-37) A8G
接物、DOM7h-14融合體DOM7h-14融合體
HSAIlOnM150nM
RSA800nM700nM
MSAIlOnM130nM
[0187]上面的結果證實，融合體分子保留結合所有類型的血清白蛋白的能力，這表明，它們可能具有延長的體內半衰期。
[0188]實施例3 =GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs融合體在GLP-1受體結合試驗(GLP-1RBA)中是有活性的:
[0189]將融合體緩沖液更換進10mM NaVl、20mM檸檬酸鹽pH 6.2中。同時，以2xl05細胞/mL，將CHO 6CRE GLPlR細胞(用6個驅動螢光素酶報告基因的cAMP反應元件以及用人GLP-1受體穩定轉染的CHO Kl細胞(可從美國典型組織保藏中心ATCC得到))接種進懸浮介質中。維持懸浮培養24小時。然后在含有2mM L谷氨酰胺的15mM HEPES緩沖液(可從Sigma得到)中稀釋細胞(2.5x10s細胞/ml)，并分配進含有1ul/孔的待測化合物的384-孔平板中。加入試驗對照以后，將平板返回培養箱，在37°C和5% CO2溫育3h。溫育后，如試劑盒所述，將穩定的glo螢光素酶底物(可從Promega得到)加入孔中，并用自粘合平板密封帶(Weber Marking Systems Inc.目錄號607780)密封平板。將平板放入讀數器(Viewlux，Perkin Elmer)中，并重新溫育5分鐘，然后讀出熒光和繪制結果。在有和沒有1uM白蛋白存在下，在濃度范圍內測定化合物，在有和沒有白蛋白存在下擬合劑量響應曲線。計算EC50，并總結在下面的表3中:
[0190]表3 =GLP-1 和 Exendin-4 AlbudAbs 融合體在 GLP-1 受體結合試驗(GLP-1R BA)
中的活性
[0191]
【權利要求】
1.一種融合體或綴合物組合物，其包含下述物質或由其組成:(a)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物，其作為與(b)的融合體或綴合物存在；(b)結合血清白蛋白的dAb，其選自:(i)DOM 7h-14結構域抗體(dAb) (DOM 7h_14的氨基酸序列如圖1 (h): SEQ ID NO 8所示)，(ii) DOM 7h-14-10結構域抗體(dAb) (DOM 7h_14_10的氨基酸序列如圖1 (o): SEQID NO 26所示)，或與DOM 7h_14_10 dAb的序列具有最多4個氨基酸差異的dAb ;和(iii)DOM 7h-ll-15 dAb (DOM 7h_ll_15 的氨基酸序列如圖1 (p): SEQ ID NO 27所示)，或(iv)DOM 7h-14-10 R108C結構域抗體(dAb) (DOM 7h_14_10的氨基酸序列如圖1 (r)所示)。
2.根據權利要求1所述的融合體或綴合物，其中所述藥物是EXendin-4、GLP-l分子或PYY分子、或它們的保留天然分子的結合活性的突變體或衍生物。
3.根據權利要求1或2所述的融合體或綴合物，其中所述藥物選自:(a)GLP-1 (7-37)A8G突變體，其具有圖1 (i) (SEQ ID NO 9)所示的氨基酸序列，或(b) Exendin-4分子，其具有圖1 (j) (SEQ ID NO 10)所示的氨基酸序列，或(c) PYY3-36或具有在10位的賴氨酸，且具有圖1s所示的氨基酸序列的PYY 3-36。
4.根據前述權利要求中任一項所述的融合體或綴合物，其包含連接藥物和dAb的氨基酸連接物或化學連接物。
5.根據權利要求4所述的融合體或綴合物，其中所述氨基酸連接物是具有圖1(k)(SEQ ID NO 11)所示的氨基酸序列的螺旋連接物，或具有圖1 (I) (SEQ ID NO 12)所示的氨基酸序列的gly-ser連接物。
6.根據前述權利要求中任一項的融合體，其中所述促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物作為融合體的一部分存在于dAb的N-端或C-端。
7.根據權利要求6所述的融合體或綴合物，其包含選自下述的氨基酸序列或由其組成 (a)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_14_10 融合體(DMS7139)
HG EC}T1:TSDL.SKQM E E E A V R L FiE WL KNCiG PSSGA PPPSGGCJGCiSGCi
GCiSGCSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVrrrCRASQWICjSQLSWYOOK
PGKAPKLLlMWRSSLQSGVPSRFSGSCiSCiTDFrLTiSSLQPEDFATYY
CAQCji^HPKTFGQGTKVIiIfCR
iSr.0 In NO 24)
(b)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_ll_15 融合體(DMS7143)
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<S1-:Q ID \Ol5) (c)肽綴合物，它是:經由賴氨酸(導入在PYY的10位)和4個重復PEG連接物綴合到 C-端酰胺化的 PYY3-36 上的 DOM 7h_14_10 (R108C) AlbudAb,如圖 14 所示。
8.根據前述權利要求中任一項所述的融合體或綴合物，其中所述dAb進一步格式化以增加它的流體動力學尺寸，這是通過連接選自下述的分子到dAb上:PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白-結合部分、抗體Fe區域，或通過綴合抗體結構域。
9.根據前述權利要求中任一項所述的融合體或綴合物，其包含額外的dAb部分，所述dAb部分具有與DOM 7h-14-10或DOM 7h_ll_15 dAb相同或不同的結合特異性。
10.根據前述權利要求中任一項所述的融合體或綴合物，其在人類中具有12小時或更長例如12-21天的消除半衰期。
11.根據前述權利要求中任一項所述的融合體或綴合物，其以在約5微摩爾至約I皮摩爾范圍內的KD結合人血清白蛋白。
12.—種藥物組合物，其包含根據前述權利要求中任一項所述的融合體或綴合物以及藥學上或生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
13.—種組合物，其包含:(a)根據權利要求1-12中任一項所述的融合體或綴合物，和(b)另外的治療劑或活性劑，用于單獨地、先后地或同時地施用給受試者。
14.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其用于治療或預防代謝疾病或障礙。
15.根據權利要求14所述的組合物，其中所述疾病或障礙選自:高血糖癥、受損的葡萄糖耐受性、β細胞缺乏、糖尿病(I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)、肥胖癥或特征在于進食過量的疾病。
【文檔編號】C07K16/18GK104127880SQ201410367609
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2010年3月24日 優先權日:2009年3月27日
【發明者】C.赫林, L.J.霍爾特, L.S.耶斯珀斯, S.邁爾, M.普佩卡-斯維德 申請人:葛蘭素集團有限公司