專利名稱：可裂解連接單元及其合成方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于DNA合成測序的化合物的化學合成領域，尤其涉及一類新型可裂解連接單元及其合成方法與用途。
技術背景DNA測序技術是現代生物學研究中重要的手段之一。人類基因組計劃完成后，DNA測序技術得到了迅速發展。DNA測序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的排列方式。發展精確、高通量、低成本的DNA測序方法對于生物、醫藥科學等具有非常重要的意義。
合成法測序Sequencing By Synthesis, SBS)是新一代DNA測序技術之一。合成法測序方法通過把大量被測的模板DNA片段進行固定，并在固定化的DNA測序模板上雜交結合通用的DNA引物，分別控制四種核苷酸在DNA引物上的延伸。通過檢測延伸反應過程或延伸核苷酸，實現高通量并行的DNA序列信息的檢測。
在合成法測序中，首先要合成DNA鏈延長的四種核苷酸原料，又叫“可逆終端” (reversible terminator).這類核苷酸除了要求-羥基阻斷外，為了不影響下一個指示核苷酸的并入和識別，還要求通過一個可裂解的連接單元把核苷酸和指示分子，例如熒光素，連接起來。然后，在下一個指示核苷酸并入之前，在溫和條件下使這個連接單元斷裂， 繼續DNA鏈的延長，從而讀出DNA堿基的序列。該連接單元對合成法測序的讀長和效率有重要影響，因此，人們也一直致力于發展新的可裂解連接單元，來提高DNA測序的效率。目前已報道的連接單元有二硫鍵、光裂解、Pd催化裂解、氟化物可裂解等。
Robi D. Mitra Jay, Shendure Jerzy Olejnik, Edyta~Krζymanska-01ejnik and George Μ. Churcha. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies. Analytical Biochemistry 320 (2003) 55 - 65.該文獻中報道了一種二硫鍵連接單元， 通過該連接單元把熒光素和脫氧核苷酸連接起來，該核苷酸在聚合酶作用下并入并被檢測后，在2-巰基乙醇的作用下使二硫鍵斷裂，實現測序的循環。Gerardo Turcatti, Anthony Romieuj Milan Fedurco and Ana-Paula Tairi. A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis. Nucleic Acids Research, 2008， Vol. 36， No. 4 .該文獻中報道以二硫鍵作為可裂解連接單元，合成了一類新的熒光標記核苷酸作為可逆終端，用于DNA合成測序，但是，只能測定10個核苷酸序列，讀長太短。但是Pleasants， J. C·; Guo, W. ； Rabenstein, D. L. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6553—6558 禾口 Huyghues-Despointes, B. Μ. P. ； Nelson, J. W. Biochemistry 1992, 311476-1483 M 篇文獻中報道在某些條件下，二硫鍵不穩定，并且二硫鍵的形成和斷裂是一個可逆的過程。
Jingyue Ju 課題組在文獻 Zengmin Li，Xiaopeng Baij Hameer Ruparelj Sobin Kimj Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. A photocleavable fluorescent nucleotide for DNA sequencing and analysis. PNAS January 21, 2003 ，vol. 100 ，no. 2，414-419. Tae Seok Seoj Xiaopeng Baij Hameer Ruparelj Zengmin Li，Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. Photocleavable fluorescent nucleotides for DNA sequencing on a chip constructed by site-specific coupling chemistry. PNAS April 13，2004, vol. 101，no. 15，5488—54936. Tae Seok Seoj Xiaopeng Baij Dae Hyun Kimj Qinglin Mengj Shundi Shij Hameer Ruparelj Zengmin Li，Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. Four-color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides. PNAS April 26， 2005， Vol. 102， No. 17,5932-5937. Qinglin Mengj Dae Hyun Kim，Xiaopeng Bai，Lanrong Bi，Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. Design and Synthesis of a Photocleavable Fluorescent Nucleotide 3' -0-Allyl-dGTP-PC-Bodipy-FL-510 as a Reversible Terminator for DNA Sequencing by Synthesis. J. Org. Chem. 2006，71，3248-3252 中報道了一種光可裂解連接單元，并將其作為可逆終端應用于合成測序中，但是該連接單元應用于測序時讀長太短，這影響了合成測序的效率。
Jingyue Ju課題組在文獻Lanrong Bi，Dae Hyun Kimj and Jingyue Ju. Design and Synthesis of a Chemically Cleavable Fluorescent Nucleotide,3' -O-Allyl-dGTP-allyl-Bodipy-FL-510, as a Reversible Terminator for DNA Sequencing by Synthesis. J. AM. CHEM. SOC. 2006，128，2542 -2543. Jingyue Juj Dae Hyun Kimj Lanrong Bi， Qinglin Mengj Xiaopeng Baij Zengmin Li， Xiaoxu Li，Mong Sano Marmaj Shundi Shi，Jian Wuj John R. Edwards, Aireen Romuj and Nicholas J. Turro. Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. PNAS December 26， 2006， vol. 103 No. 52，19635—19640 和美國專利Intent No. US7883869 B2 (2011)中報道了兩種Pd催化可裂解連接單元，該連接單元根據3 ζ -羥基烯丙基阻斷衍生而來，但是應用于測序時，裂解條件不夠溫和，有時會破壞其它結構，同時讀長不夠長，影響合成測序的通量。
Diana C. Knappj Jennifer D'Onofrio, and Joachim W. EngeIs. Fluorescent Labeling of (Oligo)Nucleotides by a New Fluoride Cleavable Linker Capable of Versatile Attachment Modes. Bioconjugate Chem. 2010， 21， 1043 - 1055. 中報道了一種氟化物可裂解的連接單元。Dirna C. Knappj Saulius Servaj Jennifer D'Onofrio, Angelika Keller, Arvydas Lubysj Ants Kurgj Maido Remmj and Joachim W. Engels. Fluoride-Cleavablej Fluorescently Labelled Reversible Terminators: Synthesis and Use in Primer Extension. Chem. Eur. J. 2011，17，2903 - 2915.該文獻中進一步報到了利用這種氟化物可裂解的連接單元合成了四種熒光標記的核苷酸，作為合成測序中的可逆終端。但是在測序中，該連接單元的裂解需要的時間較長，這影響了測序的效率。
可裂解連接單元對合成法測序的讀長和效率有重要的影響，而現有的連接單元存在裂解條件不夠溫和、裂解效率不高，用于測序時讀長太短等缺點，因此，設計、合成新的可裂解連接單元，并探索合適的裂解條件對于提高測序的效率、發展新的測序方法有非常重要的意義。發明內容5
本發明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供一類新型可裂解連接單元及其合成方法與用途。本發明基于羥基保護的思想，首次設計并合成了一類新的可裂解連接單元，該類化合物合成原料簡單易得，合成過程均為常規化學反應，易于實現大量合成。該類化合物可與核苷酸和熒光素實現高效率的連接。通過研究該類化合物的裂解性能，發現該類化合物在溫和的條件下可以實現高效率的完全裂解，可應用于DNA測序。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的 本發明涉及一種可裂解連接單元，其結構式為
權利要求
1.一種可裂解連接單元，其特征在于，其結構式為
2.一種根據權利要求1所述的可裂解連接單元在DNA合成測序中的用途，其特征在于， 所述可裂解連接單元連接核苷酸和熒光素，用于DNA合成測序。
3.一種根據權利要求1所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η = 1時，包括以下合成步驟a、T-I的合成以L-谷氨酸為原料，加入鹽酸，在冰浴攪拌下滴加亞硝酸鈉溶液，滴加完畢后，繼續在冰浴下反應3 證，然后移至室溫下過夜；反應結束后，減壓蒸去水，加入乙酸乙酯溶解，過濾，濾液用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干溶劑得T-I ；b、T-2的合成取T-1，以無水四氫呋喃做溶劑，氮氣保護，在冰水浴下緩慢滴加硼烷/ 二甲硫醚溶液，滴加完畢后，繼續在室溫下反應4 證；反應結束后，加入甲醇淬滅反應，旋去溶劑，再加入甲醇，旋干得T-2 ；c、T-3的合成取T-2，以二氯甲烷做溶劑，加入咪唑，氮氣保護下和二甲基叔丁基氯硅烷在室溫下反應17 20h ；反應結束后，加入二氯甲烷稀釋，分別用2mol/L鹽酸、水和飽和碳酸氫鈉洗滌反應液，無水硫酸鈉干燥，旋干，柱層析得T-3純品；d、T-4的合成以二氯甲烷做溶劑，T-3在氮氣保護及冰鹽浴下和二異丁基氫化鋁反應，TLC跟蹤至反應完全.反應結束后，加入0.2mol/L HCl淬滅反應，二氯甲烷萃取，有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發除去溶劑得T-4 ；e、T-5的合成以二氯甲烷做溶劑，T-4在氮氣保護和冰鹽浴下，加入三乙胺，然后和甲磺酰氯反應30 50min，在40 50°C回流3 5h，反應結束后，二氯甲烷稀釋，水洗，無水硫酸鈉干燥，旋干，柱層析得T-5 ；f、T-6的合成以二氯甲烷做溶劑，T-5在對甲苯磺酸吡啶鹽作用下和原料A在室溫下反應，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后，旋干溶劑，加入水，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，柱層析得到T-6純品；所述原料A的結構式為 Ol^H6r,其中，m為0 20中的任意一個整數，k為1 20中的任意一個整g、T-7的合成以四氫呋喃做溶劑，在四丁基氟化胺作用下，T-6在室溫下脫羥基保護，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后，旋干溶劑，柱層析得到T-7 ；h、T-8的合成把T-7溶于過量的氨水，室溫下反應，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后，加乙醇，減壓旋去溶劑，得T-8，T-8即所述可裂解連接單元；當η = 2時，包括以下合成步驟a、X-l的合成以N，N-二甲基甲酰胺做溶劑，2-羥基-3，4-二氫吡喃在NaH的作用下，和氯化芐在室溫下反應，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后，滴加水除去未反應的NaH，用乙酸乙酯萃取，有機相分別用水、飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓旋去溶劑，柱層析得 X-I ；b、X-2的合成以二氯甲烷做為溶劑，把原料A溶于二氯甲烷，在對甲苯磺酸吡啶鹽作用下，和X-I在室溫下反應，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后，減壓旋去溶劑，之后加入水， 用乙酸乙酯萃取，有機相分別用水、飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓旋去溶劑，柱層析得X-2 ；所述原料A的結構式為ΗΟ^ Ι^Β,其中，m為0 20中的任意一個整數，k為1 20中的任意一個整c、X-3的合成以乙酸乙酯做溶劑，把X-2溶于乙酸乙酯，加入Pd/C并通入氫氣， 室溫下反應，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后，過濾，減壓旋去溶劑，得X-3 ；d、X-4的合成把X-3溶于過量的氨水，室溫下反應，TLC跟蹤至反應完全，反應結束后， 加乙醇，減壓旋去溶劑，得X-4，X-4即所述可裂解連接單元。
4.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 a中所述鹽酸為6 mol/L，加入的所述L-谷氨酸、鹽酸和亞硝酸鈉的摩爾比為1 :2 2. 5 1. 5 2。
5.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 b中加入的所述T-I和硼烷的摩爾比為1 :1. 1 1. 5。
6.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 c中加入的所述Τ-2、咪唑和二甲基叔丁基氯硅烷的摩爾比為1 :1. 1 1. 5 1. 1 1. 5。
7.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 d中加入的所述T-3和二異丁基氫化鋁的摩爾比為1 :1. 2 1. 5。
8.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 e中加入的所述T-4、三乙胺和甲磺酰氯的摩爾比為1 :3 5 :1. 3 1. 5。
9.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 f中加入的所述T-5、原料A和對甲苯磺酸吡啶鹽的摩爾比為1 :1. 5 2 :0. 2 0. 5。
10.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 1時，步驟 g中所述的四丁基氟化胺為含lmol/L四丁基氟化胺的四氫呋喃溶液，加入的所述T-6和四丁基氟化胺的摩爾比為1 :1. 5 2。
11.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 2時，步驟 a中加入的所述2-羥基_3，4-二氫吡喃、氫化鈉、和氯化芐的摩爾比為1 :3 5 :1. 5 2。
12.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 2時，步驟 b中加入的所述X-1、原料A和甲苯磺酸吡啶鹽的摩爾比為1. 5 2 :1 :0. 2 0. 5。
13.根據權利要求3所述的可裂解連接單元的合成方法，其特征在于，當η= 2時，步驟 c中加入的所述Χ-2和Pd/C的質量比為1 10% 20%。
全文摘要
本發明公開了一種可裂解連接單元及其合成方法與用途。可裂解連接單元的結構式為，其中，n為1或2，m為0～20中的任意一個整數，k為1～20中的任意一個整數。該可裂解連接單元可用于DNA合成測序。與現有技術相比，本發明的化合物合成原料簡單易得，合成過程均為常規化學反應，易于實現大量合成；該類化合物可與核苷酸和熒光素實現高效率的連接；通過研究該類化合物的裂解性能，發現該類化合物在溫和的條件下可以實現高效率的完全裂解，可應用于DNA測序。
文檔編號C08G65/00GK102516208SQ201110331659
公開日2012年6月27日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者伍新燕, 沈玉梅, 盛司潼, 邵志峰, 郭勛祥, 黎慶, 龔兵 申請人:上海交通大學, 華東理工大學, 深圳華因康基因科技有限公司