專利名稱：Hib莢膜多糖純化工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及莢膜多糖純化技術領域，特別是一種Hib莢膜多糖純化工藝。
背景技術：
b 型流感嗜血桿菌 Hib (Hamephilus influenzae type b, Hib)是引起 3 月齡至5周歲嬰幼兒腦膜炎、敗血癥和肺炎等傳染病的主要致病菌之一，而且75%以上的Hib感染發生在2歲以下嬰幼兒，侵襲性b型流感嗜血桿菌通常引起肺炎、蜂窩組織炎、化膿性關節炎和菌血癥，發病率高，致死率高。WHO統計顯示，每年Hib在全球可引起至少300萬嚴重病例和大約38. 6萬死亡病例。接種疫苗是預防絕大多數Hib嚴重病例的唯一公共衛生措施。全球各區域已經有90多個國家將Hib疫苗納入兒童常規免疫規劃。但是在低收入國家，僅有小部分兒童能享受Hib疫苗接種服務。Hib莢膜多糖(polyribosylribitol phosphate, PRP)的提取純化，是生產結合疫苗關鍵環節。研究發現，很多因素影響Hib的培養、PRP產生和提取純化。本研究通過研究提取純化PRP多糖，為進一步研究開發Hib多糖結合疫苗奠定基礎。b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽(PRP)。PRP具有抗原性，能在人體中誘發保護性免疫力。PRP是一種非胸腺依賴性抗原，雖然可以產生較弱的IgM型抗體，但不產生免疫記憶。18個月齡以下的嬰兒，其B淋巴細胞尚未成熟到足以產生自我保護能力，為了獲得免疫反應，PRP必須結合到一種載體蛋白上，使得多糖成為胸腺依賴性抗原。這樣就可激活T輔助淋巴細胞輔助B細胞產生特異性IgG抗體。當重復注射疫苗時，可產生明顯的免疫增強效果，標志著免疫記憶反應的建立。常規的去除蛋白質的方法是將Hib粗制多糖溶解于飽和中性醋酸鈉溶液中，然后用冷酚溶液抽提，根據粗制多糖中含有的蛋白的情況，此步驟通常需要重復數次。該工藝的缺點是會使用大量的苯酚，苯酚是一種強腐蝕性的高毒性物質，對人的皮膚和粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經或損害肝、腎功能。皮膚接觸可致灼傷。同時，該工藝會產生大量的廢棄苯酚，對水體和大氣可造成污染，對環境有嚴重危害。在Hib疫苗制備的過程中，莢膜多糖的制備是關鍵的步驟。在我國多采用和流行性腦膜炎球菌以及傷寒Vi多糖提取相似的工藝來提取Hib莢膜多糖。此工藝采用超濾透析去除核酸、蛋白質，進一步采用色譜分離可以大大提高純度，但粗多搪的蛋白和核酸含量較高時，也會影響色譜純化效果效果。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種安全有效、減輕對人體和環境危害的Hib莢膜多糖純化工藝，解決現有的Hib制備工藝中核酸、蛋白不易去除的問題。本發明的目的通過以下技術方案來實現Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過夜，15000 20000rpm離心30 60min去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過濾，收集透過液；C、透過液通過選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為20% 25%，搖勻后4°C過夜；e、6000 8000rpm離心15 30min棄除沉淀，向上清液內補加95%乙醇至70%終濃度，搖勻后，4°C下6000 8000rpm離心40 50min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至80% 85%終濃度，混勻后，4°C靜置3 4h ; g、靜置后的溶液6000 8000rpm離心15 30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000 8000rpm離心15 30min去除不溶物質；h、上清液用12 14KD透析膜對水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,6000 8000rpm離心15 30min收集上清,上清用O. 45um濾膜過濾，濾液依次通過AKTA explorer,CL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣品。本發明具有以下優點
I、本發明解決了現有的Hib制備工藝中核酸、蛋白不易去除的困難。2、本發明避免使用十六烷基三甲基溴化銨沉淀復合多糖以及苯酚抽提蛋白過程中對人體健康和環境造成的危害。3、本發明降低了處理難度，提高了處理質量，且處理穩定性好，使得人工純化的Hib多糖在連續的生產批次內各個指標都能符合藥典標準，且產生的雜質殘留量少又易去除。
4、本發明大大提高了純化PRP的純度，純化樣品檢測合格，免疫雙擴散實驗證實抗原性良好，為進一步制備Hib PRP多糖蛋白結合疫苗奠定了基礎。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述實施例I :Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過夜，20000rpm離心30min
去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過濾，收集透過液；C、透過液通過選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為20%，搖勻后4°C過夜；e、6000rpm離心30min棄除沉淀，向上清液內補加95%乙醇至70%終濃度,搖勻后，4°C下6000rpm離心50min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至83%終濃度，混勻后，4°C靜置3h ；
g、靜置后的溶液SOOOrpm離心15min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液8000rpm離心15min去除不溶物質；h、上清液用13KD透析膜對水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,8000rpm離心15min收集上清,上清用O. 45um濾膜過濾,濾液依次通過AKTAexplorerXL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣
品O本實施例得到的樣品的檢測結果如下取樣并按中國藥典方法檢測核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本實施例制備的3批Hib莢膜多糖純化樣品進行檢測，其檢測結果如表I所示。
實施例2 Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過夜，15000rpm離心50min
去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過濾，收集透過液；C、透過液通過選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為22%，搖勻后4°C過夜； e、7000rpm離心20min棄除沉淀，向上清液內補加95%乙醇至70%終濃度，搖勻后，4°C下7000rpm離心40min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至80%終濃度，混勻后，4°C靜置3. 5h ；g、靜置后的溶液7000rpm離心20min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液7000rpm離心20min去除不溶物質；h、上清液用12KD透析膜對水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,7000rpm離心20min收集上清,上清用O. 45um濾膜過濾,濾液依次通過AKTAexplorerXL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣
品O本實施例得到的樣品的檢測結果如下取樣并按中國藥典方法檢測核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本實施例制備的3批Hib莢膜多糖純化樣品進行檢測，其檢測結果如表I所示。實施例3 Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過夜，18000rpm離心60min
去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過濾，收集透過液；C、透過液通過選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為25%，搖勻后4°C過夜；
e、8000rpm離心15min棄除沉淀，向上清液內補加95%乙醇至70%終濃度,搖勻后，4°C下8000rpm離心45min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至85%終濃度，混勻后，4°C靜置4h ；g、靜置后的溶液6000rpm離心30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000rpm離心30min去除不溶物質；h、上清液用14KD透析膜對水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,6000rpm離心30min收集上清,上清用O. 45um濾膜過濾,濾液依次通過AKTA explorer, CL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣品。
本實施例得到的樣品的檢測結果如下取樣并按中國藥典方法檢測核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本實施例制備的3批Hib莢膜多糖純化樣品進行檢測，其檢測結果如表I所示。表I實施例樣品的核糖、蛋白、核酸、磷含量檢測結果
權利要求
1. Hib莢膜多糖純化工藝，其特征在于它包括以下步驟 a、在發酵液中加入終濃度為0.8%的甲醛溶液，4°C攪拌過夜，15000 20000rpm離心30 60 min去除菌體，收集上清液； b、離心上清液用0.22um的中空纖維膜過濾，收集透過液； C、透過液通過選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置，進行超濾濃縮,用PBS緩沖液反復清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達到恒定，收集濃縮洗滌液； d、向濃縮洗滌液中加入95%こ醇至終濃度為20% 25%，搖勻后4°C過夜； e、6000 8000rpm離心15 30min棄除沉淀，向上清液內補加95%こ醇至70%終濃度，搖勻后，4°C下6000 8000rpm離心40 50min,收集上清液； f>向上清液中加入95%こ醇至80% 85%終濃度，混勻后，4°C靜置3 4h ; g、靜置后的溶液6000 8000rpm離心15 30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000 8000rpm離心15 30min去除不溶物質； h、上清液用12 14KD透析膜對水透析，即得粗提PRP透析液； i、粗提PRP透析液，6000 8000rpm離心15 30min收集上清,上清用0.45um濾膜過濾，濾液依次通過AKTA explorer,CL-4B層析柱，收集Kd彡0. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣品。
全文摘要
本發明公開了Hib莢膜多糖純化工藝，包括以下步驟a、加入甲醛溶液，4℃攪拌過夜，離心，收集上清液；b、中空纖維過濾；c、超濾濃縮，用PBS清洗濃縮液；d、加入乙醇，過夜；e、離心，向上清液補加乙醇，離心，收集上清液；f、加入乙醇，靜置；g、離心，收集沉淀，沉淀用水溶解，離心，去除不溶物質；h、用透析膜對水透析；i、離心，濾膜過濾，依次通過AKTAexplorer、CL-4B層析柱，收集Kd≤0.5的目的峰。本發明的有益效果是解決了現有的Hib制備工藝中核酸、蛋白不易去除的困難，避免了對人體健康和環境造成的危害，降低了處理難度，提高了處理質量，且處理穩定性好。
文檔編號C08B37/00GK102731670SQ20121022240
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者伍長華, 關曉峰, 吳強, 樊紹文, 羅力心, 陳庚 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司