一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法
【專利摘要】本發明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，分離純化過程為：將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1∶8?12g/ml的料液比加入NaOH溶液超聲浸提30?50min，之后加入HC1溶液調pH<2，室溫靜置,離心收集得到膠狀沉淀；純化過程為：將收集到的膠狀沉淀懸浮于15?25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2?4h，冷卻后離心收集固體顆粒；將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進行多次沉淀，得到黑色素顆粒。所述分離純化方法操作簡單，黎豆種皮黑色素的分離純化量高并且純度高，黑色素氧化程度低，分離純化周期短，此外成本低廉，適合用于進行黎豆種皮黑色素的大規模分離純化，提高了黎豆的經濟價值，拓寬了黎豆的應用領域。
【專利說明】
一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法
技術領域
[0001]本發明涉及分離純化工藝技術領域，尤其涉及一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]黑色素是廣泛存在于動物、植物和微生物中的棕黑到黑色難溶性色素的總稱，具有重要的生理特征。在動植物體內黑色素具有防御、保護的功能。現有資料表明，黑色素一般為兩種類型，即H引噪型(Eumelanin)和鄰苯二酸型(Pheomelanin)。認為動物黑色素多屬口引噪型(Eumelanin)，而植物源黑色素多屬鄰苯二酸型(Pheomelanin)。
[0003]黑色素可為生物體提供結構性強度或保護生物免紫外線、電離輻射、重金屬污染、低溫和高溫等環境脅迫的傷害。它不僅是一類光保護劑、抗輻射劑、螯合劑、生物抗氧化劑和免疫促進劑，而且還是一類生物半導體材料。近年來的研究還發現，黑色素具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒復制、治療帕金森癥等作用，具有廣泛的開發應用潛力。在食品方面的開發利用最為常見，可以將黑色素制成的食品添加劑，不僅無毒無害，還能對人體其保健作用。在保健功能食品上，可利用黑色素的功效成分生產口服液、營養保健片、多維膠囊等。
[0004]黎豆(Stizolobium capitatum Kuntze)又名貓貓豆、毛毛豆、龍爪豆、毛狗豆、小狗豆、狗爪豆、貍豆、虎豆、八升豆，是豆科黎豆屬一年生草本植物。原產亞洲南部，分布于熱帶和亞熱帶(美洲除外)，我國四川、云南、廣西、貴州、湖南、湖北、安徽等省均有栽培，日本也廣為栽培。我國對黎豆種皮黑色素的研究開發尚未見報道，目前常用的分離純化工藝無法從黎豆種皮中有效分離純化黑色素。
[0005]因此，現有技術還有待于進一步改進。
【發明內容】
[0006]鑒于現有技術的不足，本發明在于提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，旨在解決目前無相應技術能從黎豆種皮中有效分離純化黑色素的問題。
[0007]本發明的技術方案如下:
一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，所述方法為:
提取過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:8-12g/ml的料液比加入NaOH溶液超聲浸提30_50min，之后加入HCl溶液調pH〈2，室溫靜置，離心收集得到膠狀沉淀；
純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15-25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2-4h，冷卻后離心收集固體顆粒；
將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進行多次沉淀，得到黑色素顆粒。
[0008]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中按照1:10g/ml的料液比加入NaOH溶液。
[0009]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，所用NaOH溶液的質量分數為4%。
[0010]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中浸提時間為40min。
[0011]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中浸提溫度條件為60°C。
[0012]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中利用濃度為0.5mol/LHCl溶液調pH為I。
[0013]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，純化過程中將收集的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的HCl溶液中水解。
[0014]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，純化過程中沸水浴中水解并冷卻后在4000-5000r/min離心1min后，收集固體顆粒。
[0015]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，將純化過程中對固體顆粒的洗滌方法為:依次用固體顆粒質量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0016]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，所述利用NaOH溶液和HCL溶液進行多次沉淀具體為:將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調節pH I?2，沉淀I?2 h后離心，然后再次加入NaOH調節至pH 11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復沉淀。
[0017]有益效果:本發明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，所述分離純化方法操作簡單，黎豆種皮黑色素的分離純化量高并且純度高，黑色素氧化程度低，分離純化周期短，此外成本低廉，適合用于進行黎豆種皮黑色素的大規模分離純化，提高了黎豆的經濟價值，拓寬了黎豆的應用領域。
【具體實施方式】
[0018]本發明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0019]本發明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，所述分離純化方法為:
分離純化過程包括如下步驟:
S1:將黎豆種皮進行水煮除雜:稱取黎豆種皮，將其放入錐形瓶中，加入蒸餾水煮沸15min后過濾，以除去水溶性雜質和排除材料中的氣體，有利于后續實驗。
[0020]S 2:按照質量比1: 8 -12 g /m I的料液比向溶液中加入Na OH溶液，并超聲浸提3 O -50mino
[0021]由于黑色素具有溶于堿性溶液而在酸性溶液中沉淀的性質，并且堿液對黑色素的選擇性高，溶解力強，萃取率也高，因此堿溶酸沉法是黎豆種皮黑色素的有效分離純化方法。而堿液中，NaOH溶液的堿性強，對黑色素的溶解力更強，分離純化效果好。當NaOH溶液的質量分數為4%時，黑色素的溶解力最強，分離純化效率最高。
[0022]在一定范圍內，黎豆種皮黑色素的分離純化量隨NaOH溶液的量增加而提高，但是當NaOH溶液的量過多時，黎豆種皮黑色素的分離純化量基本不再改變，此時過多的NaOH溶液會提高分離純化的成本，造成浪費。當按照質量比1: 8-12g/ml的料液比向溶液中加入NaOH溶液時，黎豆種皮黑色素的分離純化效率高，成本較低。優選地，當料液比為比I: 1g/ml時，黎豆種皮黑色素的分離純化量達到最高，并且消耗NaOH溶液的量最少。
[0023]浸提的時間越長，黑色素分離純化的量越多，但是時間過長時，容易由于微生物的滋生而污染分離純化物。當浸提時間控制在30-50min，黑色素分離純化效率高，并且品質好。優選地實施例中，在分離純化過程中浸提時間為40min，此時能保證最大程度地分離純化黎豆種皮黑色素。
[0024]由于隨著分離純化溫度的升高，黑色素得率不斷上升。但是60°C后，黑色素的氧化程度進一步加深，抗氧化能力不斷降低，黑色素含量明顯呈下降趨勢，粗提物中雜質含量提高，黑色素含量下降，，這將對下一步的純化帶來不便，因此，在分離純化過程中，浸提溫度條件為60°C時，黑色素的分離純化率最高，有利于后續的純化。
[0025]S3:向溶液中加入HCl溶液直至將溶液的pH〈2.0，收集得到膠狀沉淀。當溶液的PH調為小于2時，溶液中黑色素溶解度低，極易沉淀下來。優選地，分離純化過程中利用濃度為
0.5mol/L HCl溶液調PH為I，溶液中黎豆種皮黑色素溶解度達到最低，分離純化量最高。
[0026]純化方法包括以下步驟:
S4:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15-25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2_4 h，冷卻后離心收集固體顆粒。這能有效分離膠狀沉淀與黑色素結合的雜質，并去除一部分能溶于酸的雜質。
[0027]由于HCl濃度越大，黑色素純度越高，當HCl濃度過高時，黎豆黑色素的生物活性會受到破壞，而且還會帶來不必要的能源損耗，提高成本。優選地，所用HCl溶液濃度為1.5mol/L，此種條件下分離和溶解雜質的效果最好。
[0028]優選地，純化過程中將收集的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的HCl溶液中水解，此種條件下分離和溶解雜質的效果最好。
[0029]優選地，純化過程中沸水浴中水解并冷卻后在4000-5000r/min離心1min后，收集固體顆粒。此種條件下獲得的固體顆粒的得率最高。
[0030]S5:將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌。這個步驟是用于高效去除固體顆粒中的脂溶性雜質。
[0031]具體地，將純化過程中對固體顆粒的洗滌方法為:依次用固體顆粒質量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。這種條件下，洗滌效果最好，去除脂溶性雜質效率最尚O
[0032]S6:并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進行多次沉淀，得到黑色素顆粒。
[0033]上述步驟具體為:將洗滌后的固體顆粒首先用0.5mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調節pH I?2，沉淀I?2 h后離心，然后再次加入NaOH調節至pH 11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復沉淀。
[0034]由于黎豆種皮黑色素在pHI?2的環境下溶解度最低，以沉淀形式最大程度地析出，而在pH 11時溶解度最高，溶解在溶液上清中。因此，采用上述的條件利用NaOH溶液和HCL溶液進行反復沉淀，能最大程度的去除黎豆種皮黑色素中的剩余雜質，獲得高純度的黎豆種皮黑色素。
[0035]在純化后，還可對純化產物進行以下的處理，進一步提高產物的品質。
[0036]S7:將得到的黑色素顆粒進行冷凍，得到的冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl一定性檢測為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。由于多次沉淀，獲得的黑色素顆粒中存在Cl—，為避免Cl 一影響黎豆種皮黑色素的純度及品質，需要蒸餾水洗滌沉淀去除Cl—雜質。
[0037]為了更詳盡的描述本發明的制備方法，以下列舉幾個實施例更進一步的說明。
[0038]實施例1
本發明提供的黎豆種皮黑色素的分離純化方法如下:
分離純化過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:10g/ml的料液比加入質量分數為4%的NaOH溶液，60°C條件下超聲浸提40min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液調PH為I，離心收集得到膠狀沉淀。
[0039]純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解2 h，冷卻后在5000r/min條件下離心1min后，收集固體顆粒。
[0040]依次用固體顆粒質量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0041 ]將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調節pH I，沉淀Ih后離心，然后再次加入NaOH調節至pH11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復沉淀，最后得到黑色素顆粒。
[0042]將得到的黑色素顆粒冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl 一定性檢測為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。
[0043]實驗結果顯示，黎豆種皮黑色素的得率有3.2%，黑色素含量純度為89%。
[0044]實施例2
本發明提供的黎豆種皮黑色素的分離純化方法如下:
分離純化過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照I: 8g/ml的料液比加入質量分數為4%的NaOH溶液，50°C條件下超聲浸提30min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液調PH為I，離心收集得到膠狀沉淀。
[0045]純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于20倍體積的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解3 h，冷卻后在4000r/min條件下離心1min后，收集固體顆粒。
[0046]依次用固體顆粒質量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0047]將洗滌后的固體顆粒首先用0.5mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調節pH I，沉淀Ih后離心，然后再次加入NaOH調節至pH11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復沉淀，最后得到黑色素顆粒。
[0048]將得到的黑色素顆粒冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl 一定性檢測為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。
[0049]實驗結果顯示，黎豆種皮黑色素的得率有3.0%，黑色素含量純度為85%。
[0050]實施例3
本發明提供的黎豆種皮黑色素的分離純化方法如下:
分離純化過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:12g/ml的料液比加入質量分數為4%的NaOH溶液，70°C條件下超聲浸提50min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液調PH為2，離心收集得到膠狀沉淀。[0051 ]純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于25倍體積的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解4h，冷卻后在5000r/min條件下離心1min后，收集固體顆粒。
[0052]依次用固體顆粒質量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0053]將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調節pH I，沉淀Ih后離心，然后再次加入NaOH調節至pH11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復沉淀，最后得到黑色素顆粒。
[0054]將得到的黑色素顆粒冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl 一定性檢測為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。
[0055]實驗結果顯示，黎豆種皮黑色素的得率有3.15%，黑色素含量純度為86%。
[0056]本發明提供的一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法不僅操作簡單，黎豆種皮黑色素的分離純化量高并且純度高，黑色素氧化程度低，分離純化周期短，此外成本低廉，適合用于進行黎豆種皮黑色素的大規模分離純化，提高了黎豆的經濟價值，拓寬了黎豆的應用領域。
[0057]應當理解的是，本發明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【主權項】
1.一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，所述方法為: 提取過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:8-12g/ml的料液比加入NaOH溶液超聲浸提30_50min，之后加入HCl溶液調pH〈2，室溫靜置，離心收集得到膠狀沉淀； 純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15-25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2 -4h，冷卻后離心收集固體顆粒； 將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進行多次沉淀，得到黑色素顆粒。2.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中按照1:10g/ml的料液比加入NaOH溶液。3.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，所用NaOH溶液的質量分數為4%。4.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中浸提時間為40min。5.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中浸提溫度條件為60°C。6.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中利用濃度為0.5mol/L HCl溶液調pH為I。7.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，純化過程中將收集的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的HCl溶液中水解。8.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，純化過程中沸水浴中水解并冷卻后在4000-5000r/min離心1min后，收集固體顆粒。9.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，將純化過程中對固體顆粒的洗滌方法為:依次用固體顆粒質量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。10.根據權利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，所述利用NaOH溶液和HCL溶液進行多次沉淀具體為:將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調節pH I?2，沉淀I?2 h后離心，然后再次加入NaOH調節至pH 11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復沉淀。
【文檔編號】C09B67/54GK106009768SQ201610411427
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】董華強, 麥釗鍵
【申請人】佛山科學技術學院