專利名稱：一種螺旋藻多糖的提取方法
技術領域：
本發明涉及同時獲得多種分子量范圍的螺旋藻多糖的提取方法。所制的不同規格的多糖可用于藥品、食品、保健品及化妝品等。
背景技術：
螺旋藻是海洋中古老的單細胞藻類，含有大量的氨基酸、藍藻素、類胡蘿卜素、Y亞麻酸、肌醇等營養物質。螺旋藻多糖是從螺旋藻藻體、螺旋藻培養液中提取分離出來的一類具有促進細胞生長、提高免疫力、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等功能的重要天然生物活性物質，有防治多種疾病同時還能顯著增強機體免疫力的雙重作用。螺旋藻中存在大量的蛋白質，和多糖一樣均屬于高分子物質，部分水溶性蛋白質和多糖一起被溶劑提取出來。去掉蛋白質是螺旋藻多糖提純的關鍵步驟，常利用氯仿正丁醇的二元溶劑體系或三氯乙酸使蛋白質變性析出。前者使用的溶劑有一定毒性且具強揮發性，給環境和操作人員一定的危害；后者使用的三氯乙酸有一定毒性，脫蛋白后生產的鹽與多糖類似的溶解性，去除困難，也有一定的毒性，因此該方法得到的粗品運用受到限制。常利用多糖不溶于乙醇的特性對螺旋藻多糖粗提物進行精制，但該法所得到的多糖純度不高，無法除盡蛋白質，還會摻雜色素、膠質等其他雜質，而且所得物分子量范圍較寬。還有利用DEAE纖維素柱離子交換層析法、葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠的凝膠柱層析等分離得純度高的、不同分子量范圍的多糖。但由于柱填料價格昂貴，大批量生產需要較多根柱子，生產成本超高，分離操作無法自動化 ，生產周期較長。而且柱層析需耗費大量的酸堿再生樹脂，造成二次污染，能耗大、成本高。該法不太適合大規模的多糖原料制備，僅適合實驗室和中小試運用。大多數提取方法為了提高多糖的收率，會采取偏堿性條件下進行提取，之后再通過調酸中和，如1994年公開的專利“螺旋藻多糖的提取方法”(授權公告號為CN1056852C)中采用氫氧化鈉、氫氧化鉀等強堿進行提取；2012年公開的專利“螺旋藻多糖的應用”(申請號201210134354.6)中S180小鼠移植模型的藥效學試驗中研究過螺旋藻水提多糖的相對腫瘤增值率T/C (%)高于螺旋藻堿提多糖，也就是說中性條件下提取得到的多糖對腫瘤的抑制作用優于堿性條件下。雖然堿性溶劑的提取方法可以提高提取的收率，PH值較高時破壞多糖的結構，最終得不到活性最強的多糖，不能全完發揮螺旋藻多糖的優勢。1994年公開的專利“從螺旋藻中提取蛋白質和多糖的方法”(授權公告號為CN1036067C)中使用低溫浸泡提取同時得到藍藻蛋白和螺旋藻多糖，該方法雖然簡單，但是低溫浸泡提取提取效率低，所得的螺旋藻含量較低。2008年公開的專利“一種水溶性螺旋藻多糖的提取方法”(公開號為CN101575626A)中使用冷凍離心法，調酸和酶解的方法獲得螺旋藻多糖，該方法通過酶水解蛋白質，提高多糖的收率。但是酶價格昂貴，生產成本增高。酶解會造成蛋白質水解為水溶性的多肽或是水溶性氨基酸。由于分子量接近，而且與多糖同樣溶于水，無法有效分離，導致多糖純度降低。而且酶提取法要求的條件苛刻，容易失活，對實驗設備要求高，不適合大規模工業化生產。
所報道的螺旋藻多糖的方法雖然很多，各有利弊。但目前沒有一種可以保證產品雜質少、純度高、高生物活性、低成本的，且可以實際運用于大生產的工藝路線。對于食品和藥品安全性意識益增的今天，質量和成本都是企業的生命線。一種可以運用于工業化生產中，能有效保證螺旋藻多糖的活性、生產操作簡單、對環境和產品無污染的、產品收率和純度高的提取方法，是保證產品品質和成本所必須的，也是企業迫切需要的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種經濟、節約能源、無環境污染、安全無毒、提取率高、純度高、保留生物活性成分的高效價的，可進行工業化生產的螺旋藻多糖提取方法。本發明的技術方案為:
同時獲得多種純度規格的螺旋藻多糖的提取方法按以下步驟進行:
(一)螺旋藻粗多糖的制備
(1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4-20倍量，提取I飛次，每次2 10小時，提取溫度為6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min轉速下離心,上清液合并,備用；
(2)取上述(I)得到上清液合并液，過<1.5μπι的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬以上分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機流出液和超濾機內的濃縮液，干燥，得到I種以上的水提螺旋藻粗多糖，總糖含量> 10%，分子量為
0.5萬以上；
(二)高純度螺旋藻多糖的制備
(1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4-20倍量，提取I飛次，每次2 10小時，提取溫度為6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min轉速下離心,上清液合并,備用；
(2)取上述(I)得到上清液合并液，濃縮，除雜處理，處理后的溶液于彡15000r/min轉速下離心，取上清液，過<1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬至20萬分子量間的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機流出液和超濾機內的濃縮液，干燥，得到I種以上的水提螺旋藻多糖，總糖含量> 40%，分子量為0.5萬 20萬。(3)上述的濃縮，可以是利用加熱使上清液合并液體積減少至螺旋藻投料量的5倍以下。或將上清液合并液通過<1.5μπι的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量以上的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。(4)上述的除雜處理，可以是在濃縮物中加入50 95%的乙醇至醇度達到40_90%，攪勻，靜置12 72小時，于彡15000 r/min轉速下離心，收集沉淀，加水溶解。也可以在濃縮物中加入蛋白沉淀劑，加熱0.5^3小時，于彡5°C下冷藏12 72小時，于彡15000 r/min轉速下離心分離沉淀，上清液中再加入蛋白沉淀劑，加熱，冷藏，此除雜操作重復多次至無明顯沉淀析出。上清液加入20%的氫氧化鈉水溶液或10%鹽酸溶液調pH值至中性。所述的蛋白沉淀劑，可使用1-50%三氯乙酸水溶液或0.1-50%的硫酸銨溶液或是0.1-10%的氫氧化鈉水溶液其中的一種或幾種。 上述的超濾，可根據產品所需不同分子量范圍，將超濾得到的濃縮液再反復進行超濾。2次以上連續超濾操作時，超濾機流出液即為前后兩種分子量間的濃縮成分。超濾機內的濃縮液即為選用分子量以上的多糖成分。本發明步驟(I)為提取工藝:利用乙醇回流提取去除脂溶性成分，提高多糖的提取率。利用水直接提取，不改變溶劑的酸堿度，不影響多糖的結構，獲得活性最強的多糖。步驟(2)利用離心和微孔濾膜過濾去除溶液中的固體物質，有效提高超濾的效率。通過第一道的離心、微孔過濾和超濾的聯用，獲得總糖含量> 10%，分子量為0.5萬以上的多糖和水溶性蛋白質混合物，該部分中的蛋白質也有一定的生理活性，因此該混合物可作為要求成分營養豐富的食品、保健品、化妝品等產品的原料。相比其他傳統的粗提方法，該方法操作簡單，不需要加熱也不需要加入試劑，盡可能的保持了多糖和水溶性蛋白質的活性。另外提取過程中還可獲得低分子量的如水溶性維生素等其他水溶性附加產物。如果需要進一步對多糖純度分級，將含有粗品的溶液，通過除雜處理，去除蛋白質，提高螺旋藻多糖的含量。除蛋白質的過程中會生成三氯乙酸鈉、氯化鈉等鹽，還有留有過量的三氯乙酸、硫酸銨等蛋白沉淀劑。離心、微孔過濾去除不溶性雜質或是變性的大分子蛋白質膠體。利用超濾濾材膜不同分子量的截留范圍，從水和其他液體中分離出很小的膠體和大分子。借此除去三氯乙酸鈉、氯化鈉、三氯乙酸、硫酸銨等低分子量的水溶性雜質，起到脫鹽的作用。被截住的大分子量的濃縮物，還可以使用分子量更大的的膜材繼續超濾，起到分級和濃縮作用，最終獲得總糖含量> 40%，多分子量范圍的高純度多糖。該工藝可生產作為對原料純度要求高的保健品和藥品的原料。本發明與現有技術相比，有以下優點:1、傳統分離方法獲得的多糖需要檢測才能知道大概的分子量范圍，而且是各種分子量的混合體；而且本發明可以根據對產品純度不同的需求，在工藝路線不同的階段選擇合理的處理措施，不需要檢測即可獲得預定分子量規格的高純度多糖，而且可以同時獲得多種規格。這是其他傳統方法所不可能達到的優勢。2、利用乙醇回流提取去除螺旋藻中的脂溶性成分的前處理，保證了水提取多糖時，雜質減少，更利于多糖的提取。利用水從螺旋藻中提取多糖，通過溫度的控制，保證了螺旋藻多糖不被破壞。提取階段的收率與堿法提取率接近，并遠高于低溫提取方法。獲得的多糖活性高于堿水提取的。3、將螺旋藻水提取液通過離心、微濾、超濾的聯用處理后，得到含蛋白質較多的多糖粗提物:相比傳統的粗提取，操作過程中無高溫，無化學變化，盡可能保證提取過程中多糖和蛋白質活性沒有被破壞，保持活性不變，并成分高度富集。同時還可獲得其他低分子水溶性成分的附加產物。4、螺旋藻水提取液濃縮后，利用乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、亞硫酸銨使蛋白質變性，通過離心、微濾、超濾的聯用，先離心、微孔過濾去除不溶性雜質或是變性的大分子蛋白質膠體。利用超濾濾材膜不同分子量的截留范圍，去除除蛋白質過程過產生的小分子量的鹽，如三氯乙酸鈉、氯化鈉等鹽，甚至將分子量較低的多余的蛋白質沉淀劑如三氯乙酸、亞硫酸銨等也一并去除。除雜效果徹底，過程安全、無污染、無殘留。也不增加新的雜質，也沒有傳統有機溶劑法的試劑殘留問題。所獲得多糖純度高、規格多、不破壞多糖的生物活性。該發明方法有效彌補了常規化學除蛋白質方法留有殘留物不易除盡的缺陷。
5、傳統分離方法由于柱子填料貴，柱層析操作不連續，難以工業化生產。本發明通過離心、微濾、超濾的聯用，由于受滲透壓的阻礙作用小，所以在相當低的壓力差下，仍具有高流通率。因此，生產連續自動化操作，耗能低，生產周期短。超濾膜材本身無毒，具有孔徑分布率窄，分離精度高，抗微生物能力強，化學穩定性好，機械強度大，膜易再生，使用壽命長，清潔方便等優點，因此降低了生產成本，給生產操作帶來便捷，還可彌補其他方法的諸多缺點。6、 本發明可以選擇不同分子量截流值的超濾濾材，實現多糖的進一步分級純化，具有分離效率高、無副作用、設備簡單、操作簡便等優點，分級可連續進行:如先進行I萬分子量的超濾，超濾濃縮液再通過2萬分子量的超濾，再將超濾濃縮液通過5萬分子量的超濾，再將超濾濃縮液通過8萬分子量的超濾，再將超濾濃縮液通過10萬分子量的超濾，最終可以得到1-2萬、2-5萬、5-8萬、8-10萬這四種分子量范圍的多糖提取物。本發明可同時獲得多種分子規格的高純度的螺旋藻多糖，這是以往提取分離方法所不具備的。7、本發明中化學除蛋白與離心-微孔過濾-超濾技術聯用，使得分離所得的多糖收率高、純度高、保留生物活性成分的高效價。相比凝膠柱層析和離子交換樹脂層析等常用精制方法，生產周期明顯縮短、成本和能耗更低、設備簡單、無污染、無殘留。生產操作簡單，可連續自動化生產，更適合工業化生產的需要。8、螺旋藻游浮于水體中生產，吸收了較多水中的微生物，雖然提取過程中也會使部分微生物滅活。但殘留部分會使提取液容易變質，甚至殘留到產品中使產品很快微生物超標。傳統工藝制的多糖需要通過高溫、紫外線、輻射等手段來減少微生物。而本發明不需要單獨對產品進行滅菌，微孔濾膜和超濾過程本身可以有效去除產品中微生物，可以抑制環境中的病毒、細菌、熱源、內毒素的產生，降低最終產品被微生物污染的機會，增強的產品穩定性，延長保存期限 。這是其他提取分離方法所不具備的。總之，從經濟、清潔、環保的生產環境要求及可獲得多層次、高質量產品兩方面來看，本發明的方法非常適合螺旋藻多糖粗提物或精提物的大生產運用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但本發明不限于實施例。實施例1
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4倍量，提取I次，提取2小時，提取溫度為60°C，提取液于15000 r/min轉速下離心，上清液，過1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，干燥，得到水提螺旋藻粗多糖17kg,總糖含量12%,分子量為0.5萬以上。實施例2
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小時，提取溫度為100°C，合并提取液，于9000 r/min轉速下離心，上清液合并，過1.2 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇I萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到分子量5萬以上的水提螺旋藻粗多糖8kg，總糖含量15% ;分子量1-5萬間的水提螺旋藻粗多糖10kg，總糖含量25%。
實施例3
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小時，提取溫度為100°C，合并提取液，于15000 r/min轉速下離心，上清液合并，加熱使其體積減少至螺旋藻投料量的5倍。在濃縮液中加入50%的乙醇至醇度達到40%，攪勻，靜置12小時，吸走上清液，收集沉淀，加水溶解。于15000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇
0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，干燥，得到水提螺旋藻多糖1.7kg,總糖含量彡55%,分子量為0.5萬以上。實施例4
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4倍量，提取I次，提取2小時，提取溫度為60°C，提取液于3000 r/min轉速下離心，上清液合并，加熱使其體積減少至螺旋藻投料量的I倍。在濃縮液中加入95%的乙醇至醇度達到90%，攪勻，靜置72小時，吸走上清液，收集沉淀，加水溶解。于9000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過1.2 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%，分子量為0.5萬-5萬間的水提螺旋藻多糖Ikg ;總糖含量72%，分子量為5萬以上的水提螺旋藻多糖0.6kg。實施例5
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4倍量，提取4次，每次2小時，提取溫度為60°C，合并提取液，于3000 r/min轉速下離心，上清液合并，加熱使其體積減少至螺旋藻投料量的3倍。在濃縮物中加入50%的三氯乙酸水溶液，加熱0.5小時，于1°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入10%的三氯乙酸水溶液加熱攪拌I小時，于1°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，無沉淀析出，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液調pH值至中性。溶液于9000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過0.05 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用10萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%，0.5萬-5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.8kg ;總糖含量85%, 5-10萬分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;總糖含量75%,分子量為10萬以上的水提螺旋藻多糖0.56kg。實施例6
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小時，提取溫度為100°C，合并提取液，于9000 r/min轉速下離心，上清液合并，加熱使其體積減少至螺旋藻投料量的2倍。在濃縮物中加入50%的硫酸銨溶液，加熱3小時，于5°C下冷藏12小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入30%的硫酸銨溶液，加熱2小時，于5°C下冷藏12小時，9000r/min轉速下離心，無沉淀析出，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液調pH值至中性。溶液于9000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過0.05 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中,選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用10萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%，0.5萬-5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量80%，5-10萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量65%，分子量為10萬以上的水提螺旋藻多糖
0.6kg。實施例7
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小時，提取溫度為100°C，合并提取液，于9000 r/min轉速下離心，上清液合并，加熱使其體積減少至螺旋藻投料量的4倍。在濃縮物中加入20%的氫氧化鈉水溶液，加熱0.5小時，于I°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液，加熱I小時，于1°C下冷藏48小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入0.1 %的氫氧化鈉水溶液,加熱3小時,于1°C下冷藏24小時，9000r/min轉速下離心，無沉淀析出，上清液加入10%鹽酸溶液調pH值至中性。溶液于9000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用8萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。再使用10萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%，0.5萬-5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量80%，5-8萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量80%，8-10萬分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg，總糖含量65%，分子量為10萬以上的水提螺旋藻多糖0.2
kg ο實施例8
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4倍量，提取3次，每次2小時，提取溫度為60°C，合并提取液，于3000 r/min轉速下離心，上清液合并，通過0.05 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾膜進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。在濃縮物中加入1%的三氯乙酸水溶液，加熱0.5小時，于1°C下冷藏12小時，15000r/min轉速下離心，上清液加入1%的三氯乙酸水溶液加熱0.5小時，于1°C下冷藏12小時，15000r/min轉速下離心，無沉淀析出，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液調pH值至中性。溶液于15000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用10萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%，0.5萬-5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.6kg;總糖含量80%, 5-10萬分子量的水提螺旋藻多糖0.4kg ;總糖含量65%,分子量為10萬以上的水提螺旋藻多糖0.6kg。
實施例9
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小時，提取溫度為100°C，合并提取液，于9000 r/min轉速下離心,上清液合并，通過1.5 μ m的微孔濾膜過濾,將濾液加入超濾機中,選擇0.5萬分子量的濾膜進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。在濃縮物中加入0.1%的硫酸銨溶液，加熱3小時，于5°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入0.1 %的硫酸銨溶液,加熱3小時,于5 °C下冷藏72小時,9000r/min轉速下離心,無沉淀析出，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液調pH值至中性。溶液于9000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過1.2μπι的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用10萬分子量以上的濾材對濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%, 0.5萬-5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量80%,5-10萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量65%,分子量為10萬以上的水提螺旋藻多糖0.6kg。實施例10
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小時，提取溫度為100°C，合并提取液，于9000 r/min轉速下離心,上清液合并，通過1.5 μ m的微孔濾膜過濾,將濾液加入超濾機中,選擇0.5萬分子量的濾膜進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。在濃縮物中加入20%的氫氧化鈉水溶液，加熱I小時，于5°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液，加熱2小時，于5°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，上清液加入0.1%的氫氧化鈉水溶液，加熱3小時，于5°C下冷藏72小時，9000r/min轉速下離心，無沉淀析出，上清液加 入10%鹽酸溶液調pH值至中性。溶液于9000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇I萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用8萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。再使用10萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液和流出液。分別干燥，得到總糖含量78%, I萬_5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量80%，5-8萬分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;總糖含量80%，8-10萬分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;總糖含量65%,分子量為10萬以上的水提螺旋藻多糖0.2 kg。實施例11
取螺旋藻100kg，加8倍量的95%乙醇，回流提取2次，每次2小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水12倍量，提取3次，每次6小時，提取溫度為80°C，合并提取液，于6000 r/min轉速下離心，上清液合并，通過0.45 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇I萬分子量的濾膜進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。將濃縮液的一半，干燥，得到總糖含量20%，I萬分子量以上的水提螺旋藻粗多糖9.0kg ；
在另外一半的濃縮液中加入10%的氫氧化鈉水溶液，加熱I小時，于2°C下冷藏24小時，6000r/min轉速下離心，上清液加入10%的氫氧化鈉水溶液，加熱I小時，于2°C下冷藏24小時，6000r/min轉速下離心，無沉淀析出，上清液加入10%鹽酸溶液調pH值至中性。溶液于6000r/min轉速下離心，取上清液，合并，過0.8 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇I萬分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用8萬分子量以上的濾材對部分濃縮液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液，再使用5萬分子量以上的濾材對超濾機的流出液進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機 內的濃縮液。分別干燥各部分濃縮液，得到總糖含量78%，I萬-5萬分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;總糖含量80%, 5-8萬分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;總糖含量65%,分子量8萬以上的水提螺旋藻多糖0.2 kg ο
權利要求
1.一種螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于按以下步驟進行: (1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4-20倍量，提取I飛次，每次2 10小時，提取溫度為6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min轉速下離心,上清液合并,備用； (2)取上述(I)得到上清液合并液，過<1.5μπι的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬以上分子量的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機流出液和超濾機內的濃縮液，干燥，得到I種以上的水提螺旋藻粗多糖，總糖含量> 10%，分子量為0.5萬以上； 一種螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于按以下步驟進行: (1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小時，傾去乙醇，固體物晾干，加入水4-20倍量，提取I飛次，每次2 10小時，提取溫度為6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min轉速下離心,上清液合并,備用； (2)取上述(I)得到上清液合并液，濃縮，除雜處理，處理后的溶液于彡15000r/min轉速下離心，取上清液，過<1.5 μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬至20萬分子量間的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機流出液和超濾機內的濃縮液，干燥，得到I種以上的水提螺旋藻多糖，總糖含量> 40%，分子量為0.5萬 20萬。
2.根據權利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于所述的濃縮是加熱使上清液合并液體積減少至螺旋藻投料量的5倍以下。
3.根據權利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于所述的濃縮是將上清液合并液通過<1.5μ m的微孔濾膜過濾，將濾液加入超濾機中，選擇0.5萬分子量以上的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機內的濃縮液。
4.根據權利要求4中所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于根據產品所需不同分子量范圍，將超濾得到的濃縮液再反復進行超濾，2次以上連續超濾操作時，超濾機流出液即為前后兩種分子量間的濃縮成分，超濾機內的濃縮液即為選用分子量以上的多糖成分。
5.根據權利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于除雜處理是在濃縮物中加入50 95%的乙醇至醇度達到40-90%，攪勻，靜置12 72小時，于彡15000 r/min轉速下離心，收集沉淀，加水溶解。
6.根據權利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于除雜處理是在濃縮物中加入蛋白沉淀劑，加熱0.5^3小時，于彡5°C下冷藏12 72小時，于彡15000 r/min轉速下離心分離沉淀，上清液中再加入蛋白沉淀劑，加熱，冷藏，此除雜操作重復多次至無明顯沉淀析出，上清液加入20%的氫氧化鈉水溶液或10%鹽酸溶液調pH值至中性。
7.根據權利要求7所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于所述的蛋白沉淀劑是1-50%三氯乙酸水溶液或0. 1-50%的硫酸銨溶液或是0.1-20%的氫氧化鈉水溶液其中的一種或幾種。
全文摘要
本發明是一種螺旋藻多糖的提取方法。取螺旋藻經提取工藝得到提取液，將該提取液經微孔濾膜過濾、超濾、濃縮液，干燥，得到1種以上的水提螺旋藻粗多糖，總糖含量≥10%，分子量為0.5萬以上；或將提取液濃縮，除雜處理，處理后的溶液于≤15000r/min轉速下離心，微孔濾膜過濾，超濾，選擇0.5萬至20萬分子量間的濾材進行超濾，至超濾機出口無液出時，收集超濾機流出液和超濾機內的濃縮液，干燥，得到1種以上的水提螺旋藻多糖，總糖含量≥40%，分子量為0.5萬~20萬。本發明根據對產品純度不同的需求，在工藝路線不同的階段選擇合理的處理措施，不需要檢測即可獲得預定分子量規格的高純度多糖，而且可以同時獲得多種規格的螺旋藻多糖。這是其他傳統方法所不可能達到的優勢。
文檔編號C08B37/00GK103073652SQ201210582368
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者梅艷, 李俊 申請人:昆明振華制藥廠有限公司