專利名稱：一種用新鮮螺旋藻生產螺旋藻多糖的方法
技術領域：
本發明屬于藻類分離精制生物提取技術領域，涉及ー種適用于以螺旋藻通過水煮-提取分離-濃縮制成螺旋藻多糖產品的方法，特別涉及ー種適合于以新鮮螺旋藻分離精制成聞品位螺旋操多糖的提取新方法。
背景技術：
螺旋藻(Spirulina)是ー種光合放氧、螺旋形的絲狀藍藻，屬于顫藻綱螺旋藻屬，被聯合國糧農組織和世界衛生組織分別譽為“21世紀最理想的食品”和“人類21世紀的最佳保健品”。在中國，已被列為保健食品。調查顯示，今后十年內螺旋藻的年消費量將達I萬噸，產品涉及藥品，保健食品，化妝品等領域。
螺旋藻多糖是ー種酸性雜多糖，是螺旋藻中極為重要的生理活性成分，在抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗輻射、抗凝血以及提高免疫力等方面具有獨特的功效，已成為當前螺旋藻開發研究領域的焦點。(鄧中日，游沛清，王小兵.螺旋藻多糖研究進展湖南城市學院學報2005年9月第14卷第3期63— 65.)國內外關于螺旋藻多糖的功能性研究較多。有報道研究指出，螺旋藻多糖可顯著抑制小鼠骨肉瘤180細胞的増殖和腹水型肝癌細胞DNA、RNA和蛋白質的合成，抑制作用在3 24小時內隨時間的延長而提高，不同的癌細胞對螺旋藻多糖的敏感性不一樣。廣州醫學院曾波航等在研究螺旋藻多糖對白血病病人的治療效果時發現，螺旋藻多糖在體外對正常人自然殺傷細胞(NK細胞)活性無影響，但能不同程度提高初發、復發期病人外周血NK細胞活性，且在白介素-2的激活下能提高白血病病人外周血淋巴因子激活殺傷細胞(LAK細胞)活性。對處于緩解期的急性白血病病人，螺旋藻多糖能使其NK細胞活性恢復正常。螺旋藻多糖提高腫瘤病人NK細胞活性作用與機體帶瘤狀態有夫，當腫瘤負荷小(緩解期)時作用明顯(《中國海洋藥物》雜志2000年第6期(總第78期))。張成武、龐啟深、許昌邵等的研究發現，螺旋藻多糖和糖蛋白均有抗輻射、抗氧化、提高機體免疫力、促進淋巴細胞轉化和抑制癌細胞増殖作用。在對螺旋藻多糖抗輻射機理研究中發現，其抗輻射作用與核酸內切酶的活性和DNA損傷修復酶的增強效應有關(營養學報，1996，18(3) :327.;遺傳學報，1988，15(5) :374.;中華放射醫學與防護雜志，1996，
(3):136一 138.)。螺旋藻多糖不但對細胞無毒性，而且具有增強骨髓細胞的増殖能力，促進骨髓造血功能，提高白細胞水平，提高巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數，増加T淋巴細胞的數量和消除免疫抑制劑的抑制作用等(薛志勇，螺旋藻多糖的研究及應用山東食品科技，2004. No. 8. 5-6)。同時，螺旋藻多糖與糖蛋白還能改善脂類代謝，降低血漿膽固醇水平，對胃及十二指腸潰瘍有一定的輔助療效。目前，我國螺旋藻產業化生產已獲得成功，其生產和發展過程中的突出問題是螺旋藻深加工產品處于初級階段，國內關于螺旋藻多糖提取與純化技術多停留在實驗室研究階段，應用于生產實踐較少。如賈少婷、殷文政在“天然螺旋藻多糖的提取純化及降血糖活性實驗研究”(農產品加工，2007年I月)中介紹的，是以螺旋藻干粉為原料來提取螺旋藻多糖的(取螺旋藻干粉，按固液比I :10加入質量分數為O. I %的焦磷酸鈉溶液破壁，采用熱水抽提，按固液比為I :9，溫度8(TC，抽提6h，抽提2次，經轉速4000r / min離心取上清液，定容到500mL，放入冰箱備用。取上述上清液50mL，濃縮至20%，將こ醇按4倍添加入濃縮液，在4°C冰箱放置12h取出，用4000r / min轉速離心20min。用蒸餾水將粗多糖充分溶解，按固液比為I :8制成溶液，調pH值為7. O，分別加人粗多糖質量3%的中性蛋白酶，在溫度50°C保溫2. 5h，待完全酶解后，采用Sevage法進行脫蛋白處理，提取粗多糖，計算多糖含量)。又如潘秋文、高向東、盛海林等在“螺旋藻多糖的提取エ藝研究”(醫藥導報2004年9月第23卷第9期)中提到的螺旋藻多糖提取方法也是以螺旋藻干粉為原料提取多糖。(將螺旋藻粉碎制得螺旋藻粉，堿水提取后，將提取液經3000r · min離心20min,留上清液，將殘渣進行2次提取，將提取液經3000r · min-離心20min。將兩次離心所得上清液合井，采用Sevage法去蛋白后得去蛋白多糖，經透析后將透析液用3倍こ醇沉淀，將沉淀物用五氧化ニ磷真空干燥，即得干品SP)。還有孫遠征、張學成、紀雷等在“鈍頂螺旋藻多糖提取エ藝的研究——三氯こ酸(TCA)法的正交實驗優化”中的提取方法也是以螺旋藻干粉為原料(海洋科學/ 2oo7年/第31卷/第4期)稱取IOOg螺旋藻粉，加入800mL95こ醇，浸泡過夜；3600r / rain離心20rain，37°C烘干藻粉按I : 12質量比例加雙蒸水，用NaOH將溶液pH值調至10 ;80°C水浴6h ；3600r / rain離心30min，取上清，加10%鹽酸將上清液pH值 調至7. O,后逐滴加入5%三氯こ酸沉淀蛋白，4で過夜；3 600r / rain離心20min,上清再加5%三氯こ酸沉淀蛋白，靜置3h ；3600r / rain離心20min，上清加5倍體積95%こ醇沉淀多糖，4°C過夜；3600r / min離心20min,取沉淀,用丙酮洗漆沉淀兩次,冷凍干燥。總之，由于不同種類的螺旋藻制備的多糖不同，加之提取分離純化方法的不同，同一螺旋藻制備的多糖也不同，因此，理論上講螺旋藻多糖的種類繁雜，基本上沒有規范的多糖種類名稱，妨礙多糖進ー步的研究和應用。(湖南城市學院學報(自然科學版)第14卷第3期，2005年9月)由于現在實驗室制備螺旋藻多糖多選用螺旋藻干粉作為原料，而螺旋藻在烘干過程中由于高溫一方面會破壞多糖結構，另一方面會產生烘焦的現象，影響多糖的產出率和質量。再者，螺旋藻多糖本身的結構屬于糖蛋白，組分較多，如果精制與純化(指去蛋白)方法不當很可能會降低其活性功能，實驗室提取技術步驟復雜涉及到的化學藥品多，缺少統ー標準，不適應エ業化生產需要，去除化學殘留、提高多糖活性、擴大多糖生產規模難度很大，從而限制了精制螺旋藻多糖的研究和開發。目前，螺旋藻深加工產品處于初級階段，國內有關螺旋藻多糖提取與純化技術多停留在實驗室研究階段，應用于生產實踐較少。尤其以新鮮螺旋藻為原料直接規模化生產螺旋藻多糖還存在以下一些問題有待解決I、現有多數科研教學単位的生化實驗室缺乏培養螺旋藻的技術以及大面積、エ廠化養殖的場所和設備。因此，新鮮螺旋藻不能自給自足，限制了用新鮮螺旋藻提取多糖的進一步試驗與研究。局限于用市面上可購買到的螺旋藻粉作為原料提取多糖。2、廣大的螺旋藻生產企業現主要是以螺旋藻粉的形式進行經營的，產品處于初級階段，缺乏用螺旋藻提取多糖的深加工技術與人才。3、通過對用螺旋藻藻粉與用新鮮螺旋藻為原料提取多糖的對比，已明確在技術上存在ー些提取參數的差異。主要反映在螺旋藻細胞壁的破壁、固液比例、提取溫度、提取時間、醇析脫色等方面。本申請通過以下(C-I)改進使得用新鮮螺旋藻為原料提取多糖成為可能。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種使用新鮮螺旋藻提取螺旋藻多糖的方法，以克服上述現有技術所存在的不足之處。本發明的目的是通過下述技術方案完成的藻泥直接加水熱煮提取螺旋藻多糖的方法，含有以下エ藝過程I、ー種用新鮮螺旋藻生產螺旋藻多糖的方法，A、濾去培養液將培養池中正常生長的螺旋藻撈起，倒在篩子上濾去培養液，B、清洗將濾去水分和培養液的螺旋藻藻泥用自來水清洗，濾干，反復3次，備用；
C、提取將制備好的螺旋藻藻泥放入不銹鋼加熱鍋內，加水并加熱，提取一段時間；D、分離將提取后的混合物注入離心機；E、濃縮將液體部分加熱濃縮，冷卻備用；F、醇析將冷卻后的濃縮液放入不銹鋼桶中加こ醇，棄去上清液，將沉淀物取出；G、洗滌將沉淀物繼續用こ醇洗滌，將洗滌后的沉淀物濾干；H、干燥將濾干后的沉淀物放入真空干燥器內干燥；I、粉碎、過篩將干燥后的多糖進行粉碎過篩(60— 80目)。其中，步驟C中，提取液(水)的用量為螺旋藻2 — 3倍，加熱至煮沸，提取3 — 4個小吋，步驟D中，分離機為碟片式離心機或三軸離心機配合管式離心機進行離心，步驟步驟E中，將液體濃縮至原體積1/3 — 1/5，步驟F中，酒精濃度為95%，加注量為濃縮后溶液的3 — 4倍，步驟G中，清洗液為95%—無水こ醇，次數為2 — 3次。本發明的有益效果是，采用新鮮螺旋藻作為提取螺旋藻多糖的原料，與技術背景所描述的提取方法相比有以下幾點益處(I)減少了螺旋藻烘干過程的設備添置、降低了能源消耗。(2)與用螺旋藻粉提取多糖的方法相比，本發明一方面避免了螺旋藻藻粉在高溫烘干過程中對多糖結構的破壞，另一方面避免了烘焦的現象，提高多糖的產出率和質量，減少脫色所需的酒精用量，可以大幅度降低生產成本提高品質。(3)本發明采用新鮮螺旋藻作為原料，無需添加任何化學試劑進行前處理，避免了化學殘留。
圖I是生產エ藝流程圖。
具體實施例方式實施例一將培養池中正常生長的螺旋藻撈起，倒在寬I米長5米孔徑200目的篩子上濾去培養液。積累至25公斤左右時，將濾去水分和培養液的螺旋藻藻泥用自來水清洗5分鐘，濾干，反復3次。將制備好的螺旋藻藻泥放入直徑65厘米高60厘米不銹鋼加熱鍋內，加水2倍(50公斤)煮沸，攪拌提取3小吋。(不銹鋼加熱鍋可根據生產規模定制大小及數量，并應具備攪拌功能，與用螺旋藻粉提取多糖的エ藝相比，省去了藻粉烘干的中間環節，節約了成本減少了烘干過程造成的藻粉炭化)。冷卻后將提取混合物注入碟片式離心機(我們選用的是南京綠洲機器廠生產的DBP-50型)進行固液分離，去除殘渣，(具體操作按廠家使用說明書中的規定執行)液體部分保留備用。將液體部分放入上述不銹鋼鍋內加熱或真空蒸餾器內去除多余水分，濃縮至I /3體積后(冷卻)備用。將冷卻后的濃縮液放入直徑50厘米高50厘米的不銹鋼桶中，加95%こ醇4倍，待凝聚物沉淀后(通常需24小吋)去除上清液，將沉淀物(螺旋藻多糖)取出濾去多余こ醇。繼續用95%こ醇洗滌2次，至上清液清澈無色為止，將洗滌后的沉淀物濾干。放入真空干燥器內干燥，將干燥后的多糖進行粉碎過篩(60-80目)。 實施例ニ生產過程如圖I所示。I、以藻泥為原料，步驟如實施例一C——將制備好的螺旋藻藻泥25公斤放入直徑65厘米高60厘米不銹鋼加熱鍋內，加水75公斤煮沸，攪拌提取4小吋。D——冷卻后將提取混合物注入碟片式離心機進行固液分離，去除殘渣，液體部分保留備用。共得多糖提取液35. 6公斤。E——將液體部分放入上述不銹鋼鍋內加熱(或真空蒸餾器內)去除多余水分，濃縮至I / 5體積后(冷卻)備用。共得多糖濃縮液7. I公斤。F——將冷卻后的濃縮液放入直徑50厘米高50厘米的不銹鋼桶中，加無水こ醇28升，沉淀24小時后去除上清液，將沉淀物(螺旋藻多糖)取出濾去多余こ醇。G——繼續用無水こ醇洗滌，至上清液清澈無色為止，(毎次28升，共3次)將洗滌后的沉淀物濾干。H——將多糖沉淀物放入真空干燥器內干燥24小吋。I—將干燥后的多糖進行粉碎過篩80目。(共得多糖粉236克)I、以藻粉為原料，步驟如實施例一C——將螺旋藻藻粉2. 5公斤放入直徑65厘米高60厘米不銹鋼加熱鍋內，加水100公斤煮沸，攪拌提取4小吋。D——冷卻后將提取混合物注入碟片式離心機進行固液分離，去除殘渣，液體部分保留備用。共得多糖提取液32. 3公斤。E——將液體部分放入上述不銹鋼鍋內加熱或真空蒸餾器內去除多余水分，濃縮至I / 5體積后(冷卻)備用。共得多糖濃縮液6. 5公斤。F——將冷卻后的濃縮液放入直徑50厘米高50厘米的不銹鋼桶中，加無水こ醇26升，沉淀24小時后去除上清液，將沉淀物(螺旋藻多糖)取出濾去多余こ醇。G——繼續用無水こ醇洗滌，至上清液清澈無色為止，(毎次26，共5次)將洗滌后的沉淀物濾干。H—將多糖沉淀物放入真空干燥器內干燥24小吋。
I—將干燥后的多糖進行粉碎過篩80目。(共得多糖粉192克)兩種原料對比實驗表
提取液上清液濃縮液乙醇用多糖產
(公斤)(公斤)(公斤)量(升) 量(克)
藻泥為UZL236ぼ
原料 u如35'6ks7lkg(28LX__
原料=5 10°k832.3蛣 …ノ 2“ 192 ^ 6)
提取時間:4h提取溫度:100 OIOkg藻泥得Ikg藻粉，從上表可以明顯看出，用藻泥作為原料進行提取多糖，產量上比用藻粉為原料高出23%，所用的こ醇量比藻粉為原料少40%。兩者之間差異極為顯著。兩種原料，4組重復所得的螺旋藻多糖產量如下表
\直復I234平均
原料\ 多糖產量多糖產量多糖產量多糖產量\
■螺旋藻泥 _ 235. 38 克_236. '17 克 235. 61 克 _ 236. 77 克 _ 236. 06 克 _
螺旋藻粉 _ 190. 88 克 _193. 06 克 _ 191. 64 克 _ 192. 22 克 _191. 95 克 _方差分析
變異來源~r~dfI-SS pMS Γ1F0.01
處理間 I3890.9431 3890.9431 6012. 1613. 74
誤差 63.8831 0.6472
總變異 73894.8262經方差分析結果為極顯著。
權利要求
1. ー種用新鮮螺旋藻生產螺旋藻多糖的方法，包括以下步驟A、濾去培養液將培養池中正常生長的螺旋藻撈起，倒在篩子上濾去培養液，B、清洗將濾去水分和培養液的螺旋藻藻泥用自來水清洗，濾干，反復3次,備用；C、提取將制備好的螺旋藻藻泥放入不銹鋼加熱鍋內，加水并加熱，提取一段時間；D、分離將提取后的混合物注入離心機；E、濃縮將液體部分加熱濃縮，冷卻備用；F、醇析將冷卻后的濃縮液放入不銹鋼桶中加こ醇，棄去上清液，將沉淀物取出；G、洗滌將沉淀物繼續用こ醇洗滌，將洗滌后的沉淀物濾干；H、干燥將濾干后的沉淀物放入真空干燥器內干燥；I、粉碎、過篩將干燥后的多糖進行粉碎過篩；其特征在于，步驟C中，提取液的用量為螺旋藻2 — 3倍，加熱至煮沸，提取3 — 4個小時，步驟D中，分離機為碟片式離心機或三軸離心機配合管式離心機進行離心，步驟步驟E 中，將液體濃縮至原體積1/3 — 1/5，步驟F中，酒精濃度為95%，加注量為濃縮后溶液的3 —4倍，步驟G中，清洗液為95%—無水こ醇，次數為2 — 3次。
全文摘要
本發明涉及一種提取螺旋藻多糖的方法，該方法包括濾去培養液、清洗、提取、分離、濃縮、醇析、洗滌、干燥、粉碎、過篩的步驟。本發明采用澡泥為原料加工減少了螺旋藻烘干過程的設備添置、降低了能源消耗。與用螺旋藻粉提取多糖的方法相比，本發明一方面避免了螺旋藻藻粉在高溫烘干過程中對多糖結構的破壞，另一方面避免了烘焦的現象，提高多糖的產出率和質量，減少脫色所需的酒精用量，可以大幅度降低生產成本提高品質。采用新鮮螺旋藻作為原料，無需添加任何化學試劑進行前處理，避免了化學殘留。
文檔編號C08B37/00GK102827303SQ201210343950
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者唐玉邦, 虞利俊, 韋金河, 嚴建民, 裴勤, 徐磊 申請人:江蘇省農業科學院