一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，將干燥后的杏鮑菇菌絲浸漬于蒸餾水溶劑容器中，將容器放置超聲波粉碎設備中利用超聲波粉碎杏鮑菇菌絲的細胞壁結構，獲得杏鮑菇菌絲混合液，再將杏鮑菇菌絲混合液采用熱水浸提法加熱使杏鮑菇菌絲體胞內多糖滲出，獲得浸提液，然后將浸提液進一步離心、濃縮、醇沉、離子交換層析后得到杏鮑菇多糖。本發明所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝利用超聲波空化產生的極大壓力造成被破碎菌絲體細胞壁破裂，加速菌絲體中的有效成分進入溶劑，無需反復多次浸提，多糖得率高，簡化了提取工藝，多糖提取效率高。
【專利說明】一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種杏鮑菇多糖提取工藝，尤其涉及一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝。
【背景技術】
[0002]現代醫學研究發現，食用菌中能顯著增強癌癥患者抵抗力的生理活性物質即為食用菌多糖。食用菌多糖具有多種生物活性，包括:抗腫瘤、調節免疫、降血壓、降血脂、降血糖、健胃保肝、抗病毒，除此之外它還具有抗氧化、延緩衰老、抗感染、抗輻射、抗水腫、抗疲勞和修復損傷組織細胞等方面的功效。目前，食用菌多糖已廣泛應用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和腫瘤等疾病的臨床治療及醫藥領域的其它用途，如制備醫用透析膜、藥物緩釋劑、血漿代用品及疫苗等。
[0003]杏鮑菇又名刺芹側耳，是一種品質優良的名貴珍稀食用菌，有較高的食用價值和藥用價值，具有潤腸、美容、抗腫瘤等作用，是聯合國糧農組織向，世界各國推薦的食用菌新品。杏鮑菇中含有豐富的多糖物質，多糖又稱多聚糖，是由單糖縮合成的多聚物，廣泛存在于高等植物、動物和微生物中，它是生物體內除蛋白質和核酸以外的又一類重要的信息分子。杏鮑菇中所含的真菌多糖能增強肌體免疫功能，具有抗病毒，降低機體膽固醇含量，防止動脈硬化等功能。以杏鮑菇子實體為材料，分離純化了杏鮑菇多糖，并利用MDA(丙二醛)、GSHOPX (谷膚甘膚過氧化物酶)活力、血清GBT (谷丙轉氨酶)活力、COT (谷草轉氨酶)活力、CK(肌酸激酶)活力等指標研究杏鮑菇多糖對力竭小鼠自由基代謝及心肌、肝臟、骨骼肌損傷的影響，以觀察杏鮑菇多糖抗氧化、抗損傷功效。
[0004]傳統的杏鮑菇多糖提取采用熱水浸提法，以水作為溶劑浸提多糖，溫度通常控制在50~100°C，在恒溫水浴上回流浸提2~4h，過濾后得濾液和濾渣。濾渣再用水在相同條件下反復浸提3~5次，合并濾液，將`濾液濃縮使大部分水分揮發，然后加入2~5倍體積的95%的乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，而大部分蛋白質和其它成分保留在溶液中，離心分離多糖，用適量的無水乙醇或丙酮洗滌脫水，然后采用真空干燥或冷凍干燥即可得到粗多糖。此法操作簡便、有機溶劑使用量少、對多糖活性破壞小。但水作為溶劑難以完全溶出其中的多糖物質，所以需要多次浸提，操作時間長，收率較低。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題和提出的技術任務是對現有技術進行改進，提供一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，解決目前技術中杏鮑菇多糖提取采用傳統熱水浸提法需要多次浸提，多糖得率低的問題。
[0006]為解決以上技術問題，本發明的技術方案是:
[0007]—種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，采用如下步驟:(I)將干燥后的杏鮑菇菌絲浸潰于蒸餾水溶劑容器中，將容器放置在功率為500~700W、溫度控制在25°C~55°C的超聲波粉碎設備中利用超聲波粉碎杏鮑菇菌絲的細胞壁結構，獲得杏鮑菇菌絲混合液；(2)將杏鮑菇菌絲混合液采用熱水浸提法加熱使杏鮑菇菌絲體胞內多糖滲出，獲得浸提液；(3)將浸提液離心，獲得殘渣后再將殘渣采用熱水浸提并離心，合并兩次的上清液，將上清液濃縮，獲得多糖提取液；(4)然后將多糖提取液進行醇沉加工，將其中的粗多糖分離出來，一方面脫除部分雜質，同時得到粗多糖粉；(5)利用離子交換層析技術將粗多糖粉分離純化去除其中的游離蛋白質，除蛋白后的多糖再經過脫色及透析，將少量色素及小分子雜質去除，最終獲得杏鮑菇多糖。
[0008]杏鮑菇菌絲體的胞內多糖主要存在與細胞壁和細胞間質中，所以胞內多糖的提取率與細胞壁的破壞程度有很大關系。超聲波指頻率高于20KHz，人的聽覺閾以外的聲波。超聲波在傳播時，使彈性介質中的粒子產生振蕩，并通過彈性介質按超聲波的傳播方向傳遞能量。超聲波傳時可以產生空化效應、機械效應和熱效應。
[0009]液體或多或少溶有微氣泡，超聲的作用亦使液體內產生無數微小空腔，且尺寸不一。當一定頻率的超聲波作用于液體時，只有尺寸適宜的小氣泡能發生共振現象，大于共振尺寸的小泡被驅出液體外，小于共振尺寸的小泡在超聲作用下逐漸長大。接近共振尺寸時，在聲波的稀疏階段，小泡迅速脹大；在聲波的壓縮階段，小炮又突然被絕熱壓縮，直至湮滅，這瞬間在氣泡及其周圍微小空間內出現熱點，形成高溫高壓區，溫度達5000K以上，強大的微激波壓力達500atm，因此超聲作用可使植物細胞壁及整個生物體破裂，有利于有效成分在液體媒介中溶出。穴閉合或氣泡崩塌之后，其內“熱點”驟然冷卻，冷卻速度可達108K/S。這相當于將金屬熔漿放入液氮中的急劇冷卻速度。由于這種吸收聲能引起的藥物組織內部溫度的升高是瞬時的，因此可以使被提取的成分的結構和生物活性保持不變。
[0010]同時超聲波的高頻振動及輻射壓力可在液體中形成有效的攪動與流動，使媒質質點在其傳播空間內進入振動狀態，從而可加速細胞內物質的釋放、擴散及溶解過程。由于超聲波可給予介質和懸浮體以不同的加速度且介質分子的運動速度遠大于懸浮體分子的運動速度，從而在兩者之問產生摩擦，這種摩擦力可使生物細胞壁上的有效成分更快地溶解于溶劑之中。
[0011]進一步的，所述的步驟( 1)中杏鮑菇菌絲溶液的超聲波粉碎處理加工時間8~IOmin0超聲處理時間過短就無法完全使杏鮑菇菌絲的細胞結構破碎，從而多糖得率會很低；但超聲處理時間過長，多糖得率也會有下降的趨勢，這是由于超聲波處理時間過長，導致多糖結構發生變化，糖鏈斷裂使多糖得率下降所致。
[0012]進一步的，所述的步驟(2)中熱水浸提法加熱的杏鮑菇菌絲混合液的液料比為8:11111/^，加熱溫度保持在971:，浸提時間為2小時。從熱力學角度上講，溫度越高，加熱時間越長，對菌絲體細胞壁的破壞作用越大，多糖的提取率會越高。但是溫度過高，加熱時間太長，有可能引起多糖結構的變化和破壞。從這兩方面考慮，在提取多糖時，應選擇合適的加熱溫度和加熱時間。液料比是影響多糖提取的另一個重要因素，從濃度梯度考慮，加水量越多，菌絲體胞內多糖會滲出的越多，但加水量過多，會加大續濃縮工藝的加工難度。杏鮑菇菌絲的細胞結構已被超聲波完全破壞，絕大部分的多糖已從細胞中溶出，因此無需重復多次熱水浸提才能將大部分的多糖浸提出來，顯著提高了多糖得率并簡化提取工藝。
[0013]進一步的，所述的步驟(3)中對上清液采用真空濃縮，并將上清液濃縮至濃縮前的1/10。液體物質在沸騰狀態下溶劑的蒸發很快，其沸點因壓力而變化，壓力增大，沸點升高，壓力小，沸點降低。由于在較低溫度下蒸發，所以可以節省大量能源。同時，由于物料不受高溫影響，避免了熱不穩定成分的破壞和損失，更好地保存了原料的營養成分。同時為了保證醇沉時盡量出去雜質，同時減少有效成分的損失，就需要將上清液濃縮到一定的濃度。多糖提取液濃度過高，則其粘稠度較大，醇沉溶液與多糖提取液難以充分接觸，所產生的沉淀容易包裹提取液，造成有效成分損失；而多糖提取液濃度過低，則需要消耗大量醇沉溶液造成成本增加。[0014]進一步的，所述的步驟(4)中采用3倍多糖提取液體積的乙醇溶液對多糖提取液進行醇沉加工獲得粗多糖粉，沉淀時間為6小時。通過超聲波輔助提取得到的杏鮑菇多糖提取液中含有很多雜質，可以通過醇沉的方法將其中的粗多糖分離出來，一方面可以脫除部分雜質，同時也可以得到粗多糖粉，為杏鮑菇多糖的進一步分離、純化作為原料。
[0015]進一步的，所述的步驟(4)中乙醇溶液的濃度為95%。醇沉精制過程中乙醇總量低于某一臨界乙醇總量時，醇溶物的量隨乙醇用量增加而增加；高于臨界總量時，增加趨勢減緩直至不再增加。
[0016]進一步的，所述的步驟(5)中采用離子交換樹脂吸附去除游離蛋白質，樹脂采用對多糖的吸附量小、同時對蛋白質的吸附量大并且呈網狀結構的D315大孔樹脂。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。所以選擇交換樹脂既要看樹脂的極性大小，又要看其對多糖和蛋白質的吸附量的大小。
[0017]進一步的，所述的步驟(5)中對粗多糖粉液的洗脫速度為l.0ml/min流速。隨著洗脫液流速的增大，樹脂對蛋白質的吸附量減少，多糖的純度降低，這是因為流速過快，樹脂與蛋白質分子之間沒有足夠的接觸；流速過小，有利于吸附，但會延長吸附時間。
[0018]與現有技術相比，本發明優點在于:
[0019]本發明所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝利用超聲波空化產生的極大壓力造成被破碎菌絲體細胞壁破裂，同時超聲波產生的振動作用加強了胞內物質的釋放、擴散及溶解，加速菌絲體中的有效成分進入溶劑，進一步增大了有效成分的溶出，經過超聲波粉碎處理后的杏鮑菇菌絲混合液直接采用熱水浸提法加熱使杏鮑菇菌絲體胞內多糖滲出，無需反復多次浸提，多糖得率高，簡化了提取工藝；
[0020]超聲波粉碎是一個物理過程，在整個浸提過程中無化學反應發生，不影響大多數藥物有效成分的生理活性，提取物有效成分含量高，有利于進一步精制；
[0021]采用超聲波技術來強化提取過程，提取時間僅為常規溶劑提取法的幾分之一，因而提取效率聞;
[0022]本發明采用醇沉和離子交換層析技術去除杏鮑菇多糖中的雜質、游離蛋白質和色素等，得到的最終杏鮑菇多糖純度高。
【具體實施方式】
[0023]下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0024]本發明實施例公開一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，以實現提取時間短，無需加熱，適合熱敏物質的提取，目標成分取率高，可降低溶劑用量，提高多糖純度為目的。
[0025]一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，采用如下步驟:(1)將干燥后的杏鮑菇菌絲浸潰于蒸餾水溶劑容器中，將容器放置在超聲波粉碎設備中利用超聲波粉碎杏鮑菇菌絲的細胞壁結構，獲得杏鮑菇菌絲混合液；(2)將杏鮑菇菌絲混合液采用熱水浸提法加熱使杏鮑菇菌絲體胞內多糖滲出，獲得浸提液；(3)將浸提液離心，獲得殘渣后再將殘渣采用熱水浸提并離心，合并兩次的上清液，將上清液濃縮，獲得多糖提取液；(4)將多糖提取液進行醇沉加工，將其中的粗多糖分離出來，一方面脫除部分雜質，同時得到粗多糖粉；(5)利用離子交換層析技術將粗多糖粉分離純化去除其中的游離蛋白質，除蛋白后的多糖再經過脫色及透析，將少量色素及小分子雜質去除，最終獲得杏鮑菇多糖。
[0026]超聲波可在液體中產生空化作用，而空化作用產生的沖擊波和射流可破壞細胞和細胞膜結構，從而增加細胞內容物通過細胞膜的穿透能力。適當的超聲處理能增強細胞內容物通過細胞膜的穿透力和傳輸能力。因此，本項目采用熱水浸提法，并通過超聲破碎法處理菌絲體細胞來彌補傳統熱水浸提法需要多次浸提，多糖得率低的缺點。超聲處理時間延長，多糖得率增大，但是超聲處理時間過長時，多糖得率反而有下降的趨勢，這是由于超聲波處理時間過長，導致多糖結構發生變化，糖鏈斷裂使多糖得率下降所致。
[0027]超聲功率:本發明采用超聲波細胞粉碎機對菌絲體進行破碎，在固定料液比、超聲頻率、提取時間以及溫度為25~55°C的條件下，以超聲功率分別為200、400、500、600、700、800W進行超聲提取，結果表明，隨著超聲功率的增加，收率不斷增加，600W時收率最高，超過700W之后多糖收率反而下降。
[0028]超聲提取時間:本項目在固定料液比、超聲功率、超聲頻率以及溫度為25~55°C的條件下，以超聲提取時間分別為5、8、10、15、20、30min進行提取，提取2次。結果表明，提取時間為8~IOmin時，收率最高。
[0029]在通過超聲波粉碎處理之后，將杏鮑菇菌絲混合液采用熱水浸提法加熱使杏鮑菇菌絲體胞內多糖滲出，獲得浸提液。
[0030]通過反復試驗發現影響杏鮑菇菌絲體多糖得率的因素大小為浸提溫度 > 浸提時間 > 液料比。杏鮑菇菌絲體采用超聲破碎法，破碎后的菌絲可直接進行熱水浸提，不需要將菌絲體烘干粉碎制成菌粉。由于超聲破碎效果較強，菌絲破碎后，大部分多糖已經從細胞中溶出，無需反復多次浸提，不僅提高了多糖得率，還簡化了提取工藝，節約大量工時，提高了多糖提取的效率。
[0031]試驗結果表明杏鮑菇菌絲體多糖提取的最佳工藝條件為:浸提溫度97°C、浸提時間2h、液料比8: lml/g。
[0032]將采用熱水浸提法得到的浸提液進行離心，獲得殘渣后再將殘渣采用熱水浸提并離心，合并兩次的上清液，采用真空濃縮對上清液進行濃縮，并將上清液濃縮至濃縮前的1/10，獲得多糖提取液。由于氣壓小，沸點降低，溶液蒸發的溫度低，從而物料不受高溫影響，避免了熱不穩定成分的破壞和損失，更好地保存了原料的營養成分，經過濃縮后得到多糖提取液。
[0033]濃縮之后的杏鮑菇多糖提取液中含有很多雜質，可以通過醇沉的方法將其中的粗多糖分離出來，一方面可以脫除部分雜質，同時也可以得到粗多糖粉，為杏鮑菇多糖的進一步分離、純化作為原料。[0034]通過對醇沉工藝時間及最佳乙醇加量的研究,最終確定醇沉的最佳工藝條件為多糖提取液3倍體積的95%乙醇沉淀6小時，在此條件下杏鮑菇粗多糖的醇沉得率為21.34%，即經過上述工藝提取多糖后，每100g杏鮑菇可以得到15.7g的粗多糖粉。經過測定，在此粗多糖粉中，多糖含量為75.73%，蛋白含量為6.67%。
[0035]醇沉后的粗多糖粉中還含有游離蛋白質、色素以及其它一些低分子物質(包括寡糖、一些單糖、鹽分等)，其中蛋白質為含量較大的一種。本發明采用離子交換層析的工藝對杏鮑菇的粗多糖粉進行進一步的分離純化。
[0036]采用離子交換樹脂脫蛋白，即利用不同生物物質的帶電部分與具有相反電荷的離子交換吸附的強弱不同，利用一定的置換技術，將其逐一進行分開而實現分離的目的。離子交換劑即離子交換層析所用的固相基質，是由不溶于水的，具有網狀結構的高分子聚合物骨架組成。這種不溶性骨架有樹脂，纖維素，葡聚糖凝膠，聚丙烯酞胺凝膠和瓊脂糖凝膠等不同種類。這些骨架在交換過程中不發生任何反應。由于蛋白質在除等電點以外的溶液中帶有電荷，而多糖大多為中性，所以對于多糖溶液中存在的游離蛋白質可以采用離子交換樹脂吸附而除去。
[0037]采用樹脂分離杏鮑菇多糖中的蛋白質，要求樹脂對多糖的吸附量小，同時對蛋白質的吸附量要大。所以選擇交換樹脂既要看樹脂的極性大小，又要看其對多糖和蛋白質的吸附量的大小。通過對ABS、D101、D315三種大孔樹脂進行篩選，研究發現D315大孔樹脂對多糖的吸附量最低，并且對蛋白質的吸附量最大，所以，本項目采用D315大孔樹脂對杏鮑菇多糖進行脫蛋白處理。
[0038]在多糖液通過D315大孔樹脂時其流速的增大，樹脂對蛋白質的吸附量減少，多糖的純度降低，這是因為流速過快，樹脂與蛋白質分子之間沒有足夠的接觸；流速過小，有利于吸附，但會延長吸附時間。通過篩選，本發明最終選擇l.0ml/min流速作為洗脫速度。
[0039]在進行離子交換之前的多糖液中，多糖含量為3.03mg/ml，蛋白質含量為0.27mg/ml ;經過D315弱堿性陰離子大孔樹脂脫蛋白后，經測定并換算為與離子交換前相同體積多糖液條件下，多糖含量為2.58mg/ml，多糖損失率為14.91% ;蛋白質含量為0.05mg/Ml，蛋白脫除率為81.48%。
[0040]除蛋白后的多糖再經過脫色及透析，將少量色素及小分子雜質去除，從而使得杏鮑菇多糖純度達到87.3%。
[0041]以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，采用如下步驟:(I)將干燥后的杏鮑菇菌絲浸潰于蒸餾水溶劑容器中，將容器放置在功率為500~700W、溫度控制在25°C~55°C的超聲波粉碎設備中利用超聲波粉碎杏鮑菇菌絲的細胞壁結構，獲得杏鮑菇菌絲混合液；(2)將杏鮑菇菌絲混合液采用熱水浸提法加熱使杏鮑菇菌絲體胞內多糖滲出，獲得浸提液；(3)將浸提液離心，獲得殘渣后再將殘渣采用熱水浸提并離心，合并兩次的上清液，將上清液濃縮，獲得多糖提取液；(4)將多糖提取液進行醇沉加工，將其中的粗多糖分離出來，一方面脫除部分雜質，同時得到粗多糖粉；(5)利用離子交換層析技術將粗多糖粉分離純化去除其中的游離蛋白質，除蛋白后的多糖再經過脫色及透析，將少量色素及小分子雜質去除，最終獲得杏鮑菇多糖。
2.根據權利要求1所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中杏鮑菇菌絲溶液的超聲波粉碎處理加工時間8~lOmin。
3.根據權利要求1所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中熱水浸提法加熱的杏鮑菇菌絲混合液的液料比為8:lml/g，加熱溫度保持在97°C，浸提時間為2小時。
4.根據權利要求1所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(3)中對上清液采用真空濃縮，并將上清液濃縮至濃縮前的1/10。
5.根據權利要求1所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(4)中采用3倍多糖提取液體積的乙醇溶液對多糖提取液進行醇沉加工獲得粗多糖粉，沉淀時間為6小時。`
6.根據權利要求5所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(4)中乙醇溶液的濃度為95%。
7.根據權利要求5所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(5)中采用離子交換樹脂吸附去除游離蛋白質，樹脂采用對多糖的吸附量小、同時對蛋白質的吸附量大并且呈網狀結構的D315大孔樹脂。
8.根據權利要求7所述的超聲波輔助杏鮑菇多糖提取工藝，其特征在于，所述的步驟(5)中對粗多糖粉液的洗脫速度為l.0ml/min流速。
【文檔編號】C08B37/00GK103497259SQ201310481489
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】熊德閏 申請人:四川省硯山中藥飲片有限公司