一種軟骨再生支架材料的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種軟骨再生支架材料的制備方法，其是以死亡動物新鮮的背部、面部或臀部皮膚為原料，經深低溫處理、脫毛、病毒滅活、脫細胞、結構重塑、交聯、凍干、再修飾及滅菌等處理工藝得到成品。采用本發明方法制備的軟骨再生支架材料可用于促進軟骨細胞貼附和生長，促進關節軟骨損傷的愈合。本品屬于一種天然細胞外基質成分，有利于細胞的吸附、增殖和分化，并具有一定的力學強度，可作為組織填充物而長期存在于體內；并且具有較好的組織親和性和相容性，可誘導軟骨細胞向其中生長，從而重建軟骨，促進軟骨細胞貼附和生長，促進關節軟骨損傷的愈合，修復關節缺損，是一種有效修復關節軟骨缺損的新型再生支架材料。
【專利說明】一種軟骨再生支架材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程【技術領域】，具體地說，涉及一種軟骨再生支架材料的制備方法。
【背景技術】
[0002]在骨科領域中，關節軟骨缺損是十分常見的疾病。關節軟骨損傷的修復治療一直是骨科領域的一個難題。目前臨床上大多采用人工膝關節置換來治療軟骨缺損。人工關節置換術易導致一些并發癥，如易松動，需要翻修，成本過高，導致過度醫療。因此，進一步研發能夠實現內源性組織再生的軟骨支架修復材料，提高國內醫療水平和相關的治療效果，降低國內的醫療費用，成為臨床軟骨再生支架材料領域的一個重要方向。
[0003]再生支架修復技術，是軟骨組織工程和再生醫學研究內容之一，是近幾十年來興起的一種修復軟骨缺損的方法。全國每年關節軟骨損傷患者約為3000萬人，常規的方法對治療相關疾病存在一定局限，且費用高昂，每個患者采用相關技術治療的費用約為2-3萬元以上。
[0004]目前的軟骨組織工程和再生醫學技術材料按照手術方式和設計理念可分為三代，第一代技術以骨膜或其他細胞載體復合軟骨細胞修復軟骨缺損，手術方式為清除軟骨，但不破壞軟骨下骨，這種技術的細胞主要來源于后期復合或滑膜遷徙而來，組織工程化軟骨(修復材料)營養供應主要靠滑膜液供給。第二代技術的支架材料或載體材料具有一定活性或誘導功能，這種支架可以復合骨髓基質干細胞，并且可以使復合的骨髓基質干細胞向軟骨細胞分化，同時這種支架材料還可以誘導其他來源細胞形成軟骨；這種組織工程軟骨較第一代組織工程軟骨成軟骨能力更強，但是手術依然采用了不破壞軟骨下骨的植入方式。第三代技術為無細胞支架材料技術，該類支架材料在具有適當的結構和降解性能的同時具有很好的誘導功能，同時第三類技術材料關鍵是改變手術植入方式，在清除軟骨病變的同時，以鉆孔和磨消的方式打破軟骨下骨，讓支架材料與軟骨下骨的細胞相接觸，這種設計理念主要在于支架材料不但可以收納來源于滑膜的干細胞，同時可以吸附大量的來源于軟骨下骨存在的各類細胞，充分利用人體自體的再生能力，免去體外培養細胞的復雜工序以及由其帶來的高昂成本及相應的風險。
[0005]目前上市的軟骨再生復合材料機械強度均不高，且降解周期偏快，不能起到支架材料的效果。而作為生物衍生材料來源的軟骨再生支架材料，因具有明顯的優勢，受到越來越多的關注。ZL201110099363.1中公開了一種軟骨修復支架材料的制備方法，因缺少深低溫處理降低免疫原性和病毒滅活的工藝流程，存在潛在的生物安全性風險。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種軟骨再生支架材料的制備方法。
[0007]為了實現本發明目的，本發明的一種軟骨再生支架材料的制備方法，其是以死亡動物新鮮的背部、面部或臀部皮膚為原料，經深低溫處理、脫毛、病毒滅活、脫細胞、結構重塑、交聯、凍干、再修飾及滅菌等處理工藝得到成品。
[0008]前述的方法，所述動物包括但不限于豬、牛、馬、羊等新生動物個體。
[0009]前述的方法，深低溫處理的工藝包括但不限于低溫冷凍或反復凍融以降低免疫原性。所述深低溫冷凍的條件為:-200°C~-10°C冷凍I~90天，優選-196°C~_80°C，冷凍10~60天。反復凍融的條件為:-200°C~-10°C冷凍I~90天，反復凍融2_3次，優選-196°C~_80°C，冷凍10~60天，反復凍融2_3次。
[0010]前述的方法，脫毛工藝使用質量百分含量為2~10%的溶劑I浸泡處理0.5~24h ；所述溶劑I包括但不限于巰基乙酸、Na2S、胰蛋白酶、胃蛋白酶溶液等。[0011]前述的方法，病毒滅活采用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液、乙醇溶液、過氧化氫溶液、堿溶液或含吐溫80的磷酸三丁酯溶液等中的任一種溶液通過浸泡處理以滅活病毒。其中，采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡法滅活病毒，溶液中過氧乙酸的質量百分含量為0.05~
0.2%，乙醇的質量百分含量為0.15~0.6%，浸泡溫度為4~40°C，病毒滅活時間為I~2h ;或采用含吐溫80的磷酸三丁酯溶液進行浸泡處理，溶液中磷酸三丁酯和吐溫80的質量百分含量分別為0.1-0.5%和1-2%，浸泡溫度為24°C，滅活時間為5-10h。
[0012]前述的方法，脫細胞工藝在20_40°C的恒溫條件下在超聲波清洗器中進行，使用溶劑II浸泡處理2~16h ;所述溶劑II中胰蛋白酶、胃蛋白酶、十二烷基硫酸鈉和聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通X-100)的質量百分含量分別為0.03%-1%、0.01-0.25%和0.1_1%。
[0013]前述的方法，結構重塑工藝使用質量百分含量為0.03%-1%的胰蛋白酶溶液浸泡處理0.5~8h。
[0014]前述的方法，交聯工藝使用質量百分含量為0.1~5%的溶劑III浸泡處理0.5~4h;所述溶劑III包括但不限于甲醛、戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺等的水溶液。
[0015]前述的方法，再修飾工藝具體為:將經過交聯處理后的材料進行凍干，然后浸泡于質量百分含量為0.01~1%的溶劑IV中0.5~2h ;所述溶劑IV為硫酸軟骨素、透明質酸鈉、軟骨細胞生長因子溶液等中的一種或多種。
[0016]前述的方法，滅菌處理工藝包括但不限于伽馬射線輻照滅菌、高能電子束滅菌及環氧乙烷滅菌等滅菌方式。
[0017]本發明提供的一種軟骨再生支架材料的制備方法，采用動物或人的真皮基質，通過脫細胞、改建、交聯、凍干、表面修飾等處理工藝得到成品。該材料具有很好的生物相容性及降解性，具有適宜軟骨生長的多孔結構，孔隙均勻，相互連通，同時保留了大部分真皮基質中的生長因子并在材料中適當的復合有利軟骨再生的成分或生長因子，有利于軟骨的再生修復。
[0018]軟骨再生支架材料以人或動物的真皮基質為原料，優選15-35歲人尸體皮膚或新生小豬、小牛、小馬、小羊的皮膚。優選上述動物背部、面部或臀部的皮膚。經過深低溫處理、脫毛、病毒滅活、脫細胞、結構重塑、交聯、凍干、再修飾、滅菌等處理工藝得到成品。
[0019]深低溫處理:可采用深低溫冷凍，或反復凍融以降低免疫原性。
[0020]脫毛工藝:可以使用物理方法，如使用巰基乙酸、Na2S、胰蛋白酶、胃蛋白酶等浸泡材料。濃度范圍為2~10%，處理時間為0.5~24h，優選濃度為8%的Na2S溶液，處理2h。
[0021]病毒滅活:采用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液、乙醇溶液、過氧化氫溶液、堿溶液或含吐溫80的磷酸三丁酯溶液中的任一種溶液浸泡滅活病毒。其中，優選過氧乙酸-乙醇溶液浸泡法，過氧乙酸濃度范圍優選質量百分含量為0.05~0.2%，乙醇濃度范圍優選質量百分含量為0.15~0.6%，病毒滅活時間優選I~2h，溫度范圍優選為4~40°C。或采用含吐溫80的磷酸三丁酯溶液進行浸泡處理，溶液中磷酸三丁酯和吐溫80的質量百分含量分別為0.1-0.5%和1-2%，浸泡溫度為24°C，滅活時間為5-10h。
[0022]病毒滅活后用純化水、生理鹽水或pH值6-8的磷酸鹽緩沖液清洗2~8次，每次5~30min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時達到清洗終點，清洗方案優選磷酸鹽緩沖液清洗8次,每次20min。
[0023]脫細胞工藝:包括物理方法處理，如快速冷凍、超聲；化學方法處理，如過氧乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇雙四乙酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚等；酶法處理，如胰蛋白酶、核酸酶、半乳糖苷酶等。具體脫細胞方案有很多種，可以選用上述方法及試劑中的一種或一種以上混合使用，試劑使用順序、濃度和作用時間上存在差異，但目標一致，即以最溫和的方式實現徹底脫細胞并同時最大限度保留細胞外基質中的生物活性成分。脫細胞方案優選使用:胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉和聚乙二醇辛基苯基醚等中的任一種，或它們混合溶液；最優選十二烷基硫酸鈉溶液。所用濃度范圍為0.01~10%，優選濃度0.02%。所用時間為2~16h，優選為4h。脫細胞工藝在可振蕩的恒溫超聲波清洗器中進行。
[0024]脫細胞處理后用純化水、生理鹽水或pH值6-8的磷酸鹽緩沖液清洗2~12次，每次5~30min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時達到清洗終點，清洗方案優選磷酸鹽緩沖液清洗12次,每次20min。
[0025]結構重塑:使用胰蛋白酶或胃蛋白酶或二者聯用，濃度范圍0.1~1%，處理時間為
0.5~8h。優選使用濃度為0.5%的胰蛋白酶處理3h。
[0026]交聯:使用甲醛、戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)U-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等的水溶液。溶液濃度范圍為0.1~5%，處理時間為0.5~4h。優選使用濃度為0.5-1%的戊二醛處理l_2h。
[0027]交聯處理后用純化水、生理鹽水或pH值6-8的磷酸鹽緩沖液清洗2~20次，每次5~30min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時達到清洗終點，清洗方案優選磷酸鹽緩沖液清洗15次,每次20min。
[0028]再修飾:將上述材料凍干處理后浸泡于硫酸軟骨素、透明質酸鈉、軟骨細胞生長因子的一種或一種以上的混合溶液中。濃度范圍為0.01%~1%，浸泡時間為0.5~2h。優選使用濃度為0.01%的軟骨生長因子溶液浸泡lh。
[0029]上述產品進行凍干處理后滅菌包裝:可以采用伽馬射線輻照滅菌、高能電子束滅菌及環氧乙烷滅菌，優選環氧乙烷滅菌。滅菌后，產品在通風干燥的室溫放置二周以上，才可以使用。使用特衛強等材料進行雙層無菌包裝。
[0030]采用本發明方法制備的 軟骨再生支架材料可用于促進軟骨細胞貼附和生長，促進關節軟骨損傷的愈合。本品屬于一種天然細胞外基質成分，有利于細胞的吸附、增殖和分化，并具有一定的力學強度，可作為組織填充物而長期存在于體內；并且具有較好的組織親和性和相容性，可誘導軟骨細胞向其中生長，從而重建軟骨，促進軟骨細胞貼附和生長，促進關節軟骨損傷的愈合，修復關節缺損，是一種有效修復關節軟骨缺損的新型再生支架材料。
[0031]本發明具有以下優點:
[0032](一)原料進行病毒滅活處理。
[0033](二)材料經過一系列去抗原、脫細胞處理保證生物安全性。
[0034](三)交聯處理得到具有一定機械強度的如軟骨再生支架材料。
[0035](四)材料復合硫酸軟骨素、透明質酸鈉、軟骨細胞生長因子等生物活性物質促進軟骨再生。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0037]實施例1新型軟骨再生支架材料及其制備方法
[0038]取出生后不久死亡的小牛面部皮膚全層，置于_80°C冰箱中，凍存處理30天。然后取出，復溫后，進行脫毛。
[0039]脫毛工藝使用新鮮配置的濃度為8%的Na2S溶液，處理2h。
[0040]用過氧乙酸-乙醇溶液滅活病毒，過氧乙酸的質量百分含量為0.05%,乙醇的質量百分含量為0.15%，病毒滅活時間2h，溫度為24°C。
[0041]病毒滅活后用生理鹽水清洗8次，每次20min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0042]脫細胞工藝:用濃度為0.02%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡材料，所用時間為4h。脫細胞工藝在清洗槽內可振蕩的恒溫超聲波清洗器中進行。
[0043]脫細胞處理后生理鹽水清洗8次，每次20min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時達到清洗終點。
[0044]結構重塑:使用胰蛋白酶，使用濃度為0.5%,處理3h。
[0045]交聯:使用戊二醛，優選濃度為1%，處理時間為2h。
[0046]交聯處理后用生理鹽水清洗20次，每次20min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0047]再修飾:將上述材料凍干處理后浸泡于質量百分含量為0.1%的硫酸軟骨素溶液中2h。
[0048]上述產品進行凍干處理后滅菌包裝:可以采用伽馬射線輻照滅菌，采用特衛強等材料進行雙層無菌包裝。
[0049]實施例2新型軟骨再生支架材料及其制備方法
[0050]取出生后不久死亡的乳豬背部皮膚全層，置于_196°C液氮中，凍存處理4天。然后取出，復溫后，進行脫毛。
[0051]脫毛工藝使用新鮮配置的濃度為0.5%的胰蛋白酶溶液，處理18h。
[0052]用質量百分含量為0.15%的乙醇溶液滅活病毒4h，溫度為24°C。
[0053]病毒滅活后用純化水溶液清洗5次，每次15min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。[0054]脫細胞工藝:用濃度為0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液浸泡材料，所用時間為6h。脫細胞工藝在清洗槽內可振蕩的恒溫超聲波清洗器中進行。
[0055]脫細胞處理后用生理鹽水清洗8次，每次20min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0056]結構重塑:使用濃度為0.5%的胰蛋白酶處理3h。
[0057]交聯:使用濃度為0.2%的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)，處理時間為4h。
[0058]交聯處理后用pH值6-8的磷酸緩沖溶液清洗20次，每次20min，清洗后檢測清洗液的PH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0059]再修飾:將上述材料凍干處理后浸泡于濃度為0.01%的軟骨生長因子溶液中lh。
[0060]上述產品進行凍干處理后滅菌包裝:可以采用環氧乙烷滅菌，滅菌后產品在通風干燥的室溫環境中放置二周以上，采用特衛強等材料進行雙層無菌包裝。
[0061 ] 實施例3新型軟骨再生支架材料及其制備方法
[0062]取出生后不久死亡的小馬臀部皮膚全層，_20°C，凍存60天。然后取出，復溫后，用7%巰基乙酸脫毛處理2小時后用純化水溶液清洗5次，每次lOmin。
[0063]用磷酸三丁酯加表面活性劑吐溫80進行病毒滅活，病毒滅活液中磷酸三丁酯質量百分含量為0.3%，吐溫80 質量百分含量為1%，處理溫度為24°C，滅活時間為6小時。
[0064]病毒滅活后用純化水溶液清洗5次，每次15min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0065]脫細胞工藝:用濃度為0.3%的胰蛋白酶浸泡材料12h。脫細胞工藝在清洗槽內可振蕩的37°C恒溫超聲波清洗器中進行。
[0066]脫細胞處理后用pH值6-8的磷酸緩沖溶液清洗10次，每次30min，清洗后檢測清洗液的PH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0067]交聯:使用濃度為1%京尼平，處理時間為6h。
[0068]交聯處理后用0.9%的氯化鈉溶液清洗12次，每次15min，清洗后檢測清洗液的pH值，當pH達到6.5-7.5時即為清洗終點。
[0069]再修飾:將上述材料凍干處理后浸泡于濃度為0.5%的透明質酸鈉溶液中5h。
[0070]上述產品進行凍干處理后滅菌包裝:可以采用高能電子束滅菌，采用特衛強等材料進行雙層無菌包裝。
[0071]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.一種軟骨再生支架材料的制備方法，其特征在于，以死亡動物新鮮的背部、面部或臀部皮膚為原料，經深低溫處理、脫毛、病毒滅活、脫細胞、結構重塑、交聯、凍干、再修飾及滅菌處理工藝得到成品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述動物包括但不限于豬、牛、馬、羊的新生個體。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，深低溫處理的工藝包括但不限于深低溫冷凍或反復凍融以降低免疫原性；所述深低溫冷凍的條件為:-200°C~-10°C冷凍I~90天；反復凍融的條件為:-200°C~-10°C冷凍I~90天，反復凍融2~3次。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，脫毛工藝使用質量百分含量為2~10%的溶劑I浸泡處理0.5~24h ;所述溶劑I包括但不限于巰基乙酸、Na2S、胰蛋白酶、胃蛋白酶溶液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，病毒滅活采用低濃度過氧乙酸-乙醇溶液、乙醇溶液、過氧化氫溶液、堿溶液或含吐溫80的磷酸三丁酯溶液中的任一種溶液通過浸泡處理以滅活病毒。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡法滅活病毒，溶液中過氧乙酸的質量百分含量為0.05~0.2%,乙醇的質量百分含量為0.15~0.6%,浸泡溫度為4~40°C，病毒滅活時間為I~2h ;或采用含吐溫80的磷酸三丁酯溶液進行浸泡處理，溶液中磷酸三丁酯和吐溫80的質量百分含量分別為0.1~0.5%和I~2%，浸泡溫度為24°C，滅活時間為5~10h。
7.根據權利要求1所述的 方法，其特征在于，脫細胞工藝在溫度為20-40°C的超聲波清洗器中進行，使用溶劑II浸泡處理2~16h ;所述溶劑II中胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉和聚乙二醇辛基苯基醚的質量百分含量分別為0.03~1%、0.01~0.25%和0.1~1% ;結構重塑工藝使用質量百分含量為0.03~1%的胰蛋白酶溶液浸泡處理0.5~8h。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，交聯工藝使用質量百分含量為0.1~5%的溶劑III浸泡處理0.5~4h ;所述溶劑III包括但不限于甲醛、戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、N-輕基琥珀酰亞胺的水溶液。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，再修飾工藝具體為:將經過交聯處理后的材料進行凍干，然后浸泡于質量百分含量為0.01~1%的溶劑IV中0.5~2h ;所述溶劑IV為硫酸軟骨素、透明質酸鈉、軟骨細胞生長因子溶液中的一種或多種。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，滅菌處理工藝包括但不限于伽馬射線輻照滅菌、高能電子束滅菌及環氧乙烷滅菌。
【文檔編號】C08J3/24GK103785065SQ201410036743
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】陳德夫, 田偉, 孫磊, 牛睿 申請人:北京大清生物技術有限公司