大白菜抗根腫病CRb基因的連鎖分子標記、引物及抗根腫病植株的選擇方法與制造工藝

本申請為原發明專利申請“大白菜抗根腫病CRb基因的連鎖分子標記、引物及抗根腫病植株的選擇方法”的分案申請，其專利申請日：2013年4月16日；專利申請號：2013101322309；發明創造名稱：大白菜抗根腫病CRb基因的連鎖分子標記、引物及抗根腫病植株的選擇方法。技術領域本發明涉及與大白菜抗根腫病基因CRb緊密連鎖的分子標記、引物序列以及篩選大白菜抗根腫病植株的方法。

背景技術：
2002年，本課題組獲得了1份抗蕓薹根腫病的大白菜雙單倍體系‘CRShinkiDH’系，研究表明該抗病材料抗蕓薹根腫菌生理小種2、4和8（Piao等，ConversionofAFLPmarkerlinkedtoclubrootresistancegeneintoSCARmarker.2002，JKorSocHortSci43:653–665）。進一步研究證明抗根腫病基因為顯性單基因，并命名為CRb（Piao等，SCARandCAPSmappingofCRb,ageneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（Brassicarapassp.pekinensis），TheorApplGenet，2004，108:1458-1465）。在蕓薹種抗根腫病品種轉育過程中，每代都需要采用田間接種根腫病菌的方法鑒定中間材料的基因型，而且環境條件會影響到正確中間材料的選擇，這樣勢必影響轉育進程，因此抗病品種轉育難的問題還沒有徹底解決。分子標記輔助選擇技術（MAS）可能是最終解決這一問題的有效途徑。目前，只有國內沈陽農業大學樸鐘云等（2004）獲得了與蕓薹種抗根腫病基因CRb連鎖的CAPS標記。其中最近的兩個側翼標記TCR05和TCR09，見（Piao等，SCARandCAPSmappingofCRb,ageneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（Brassicarapassp.pekinensis），TheorApplGenet，108:1458-1465），但這些標記與CRb的遺傳距離較遠。因此，本實驗在這兩個CAPS標記基礎上，開發與大白菜抗根腫病基因CRb緊密連鎖的標記，精細定位該基因，從而簡化大白菜抗根腫病品種的轉育程序。

技術實現要素：
發明目的是：（1）提供與大白菜抗根腫病基因CRb緊密連鎖的分子標記；（2）提供由所述標記的全長序列和PCR引物序列；（3）提供在對大白菜抗根腫病基因進行輔助選擇的過程中對上述標記進行應用的方法。（4）通過特異引物PCR擴增可對待測植株進行苗期鑒定，大大提高育種效率，縮短了育種進程。本發明提供的技術方案如下：1．與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的分子標記：TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74分別具有如下核苷酸序列：（1）TCR25（301bp）：5’-CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCAAATTCACTAGTTTATATGATATATATGTATACTATATATATATTTGATATATATATATATATATATATATATTTGGATTGTAACCACCTCGAATTTTGAGATAATTATCATGTGAAAACGAAGACAAAAAAAAATTATGGGCATATTGATTGTATCTAATAAATTAATCATCCGATTAGTATATTCAAAATTAAAAAAAATCTTTATATTTTAAGAGAAATAGTGATAATGTCAAATATAACACACAAAAAAAATTCATATTCTGTTAATGGGACA-3’（2）TCR108（1366bp）:5'-TCTGTCATGTATTATTTAGAACAAAAATATTATTAATATTAATTAACAATATCTTTATATATTTGTCATTTATTTTTATATACTTTTATATACACATACATGTGCACCTTGATGTGAGTACTTTATAAGTATTTACCACTACTGAAATATCTATATTTTTTTTGAAGTTGAAATATTTTTTTCTTAATGCTTCTTTCACTACCGACCAAATTGTAGTGAAATGATTAGTCTTAATAATTTTCTTTTCTTTTTCTTGAACTATTATCCGTTTACAAACTATAATATGAAACCATTGGTTCGACATGACAATTATCTAAAATTTATAACATAAAAATTAACAAATAATAATAATTTTTGGTTTTTACCGAAAAACTAACAAATCAAACATTCTAACAGAAAAAAACCAAAAAATAATTTAAAACCGAACCAATATCTAGATTAAACAGATTTAATGTGTTTTTATTAAAAATAACGAAACTAATAATCACATGCCGCGCAAGGCGCGGATTATTACCTAGTAATTTTAGTAAAAAAAAACATGGCTGTTTTTTTACAGTCATATATATTTTTCTTTGACAATTGATTTGACGTACAGGTATCTGTTCAAAAAATGAGTATCTGACATGACAAAAATAAGATTCAGTTGCATTCGATCTTCTCTTTTTATAGTTGCATTTGATCATTATTTCTATAAAAATACATATGATGCCCAACATGTAGTATTACAAATCGTTATATTTAAATAAGGTAACAAAAATATTTTTTTTATTTAAAAAAACAAAAATATTTTGAAATGCTTTTTCGTTTAGGATTTTAAATAGCCAACTATTAAAATAAAATATAAACCACCGCAAAAGAAAAAAAAGTAACAGCTATCAGAAATTCAGAATATAAAAAACGTATAGGTTCACGGGTCTCCGATATGCCATGGTGGAGTTTCGTAACTACAACTGCATGAAGAGAGCTTTTGAGATGGTTTAAAATTTTAAATCAGTAAAACTGAAAATCGAGAATGTGAATATTTATTATCATTTTCCTTAAATTGTCTATTAAATATCATTAAATTTTAATTTTATTTATCACCAGAAAAGGAAAAGAATCTATAAGATACAGTTAAAAAAAAAGAATCTATAAGATACATATTAGTTGACTGAAAGGAGATTAAATTATAATTAATGTAGACAGAGTACAATGAATTAACATGTTTGATTGGAAAACAGTTTTATATAGTAGTACATTCTTATATATTTAATTTTAAGATTAGAAGTAACACAGAATAAGATACTGATATTATAAAGATGCTTTGACTAGTCAAGGTACACTGTTCCATACGTTTGTGTGCCAAGGAAACATGCATGAGTGCATC-3’(3)TCR116(1520bp):5'-CTATATACCATTTTACAAACACCAAAACTGTTAATAAACTAATCAGTTAAGAAGAGATAAGTTGTTTTAACACCTGTTGCTTTGGCGAAAATCAAAACCAAAACCAAAAAGGGTTTTGCCTTCTTCGAATCCCCAACCAAGCATCTCAACAATCATCTCATGGAAGTAGAACACTGACTCGCGTCCAACCATCTACACAAAAGTCTTTGACTTGATCAACAATCTACACAAAGCTAACGTGTAGAGACTATATAAACATTTACCATATCAGGGTCTAAGACATCGATTGCAAGCAGGCCAGCTCTGTCTTGAGGAACCACAATACTCGTGTTTGCGTCGAGAGTGATCGTTTTACCTGTTCCACATGAAAACGTTTCCTCAGAGAGCTTAAACAAAGCTAAAAGCTAATGACTTTTCTATAAAAAATGAAACTTTTTTTTTTGTTTACCAGTTGAAGGATCGAAGCGAGACCACATCTTTGTCCGAAACTCGTGGTCGGCACCGAAGATTCTGACCCAGACACGCTCTTCTTTCCCGGTGTCATGATCAACGGCGTTGAGAATCGAGCCGGCGATACCCGGGACGAGAAGAACCGGGTCGAGAGTCGGGTCAACGTAGGGTTTCTGGGTTGAAGTCTTGAGCTTTAGAAAGGTCTCTACTGATCGAGTGATCTCTTCCAGTAATAAAGCCATTTGTTGAATCGATTTAAGAAAATCCAATTTGGGGAAATTAGGGTTTGTGTGAGAGATGTGAAGACAAAAGGGTGGAACTTTGGAATTTAAGCCGTACAAGTTAAGGAGGGAAGAAAACAATCTTGTAATCTATATCATTTAAATAAATGATTTAATTTTTCAAATGGATAACGTAAGATTGAAATAATTGATACTTCCAATAACAAATTAATTAATAATTTAATAATATTATCTGGGATTCCATTGGGATTATTAATTATTACGATATATTTATGGTTAATGGGTCACAGGCTTATTATATTTTACACAACCCCCTCTATTTTGTTTCTGTTTTCAATTTGTCTCTGACTTTAGATTTGATCACAGAAGCCCACAACCTCAGGGCTCCCGGTTGAGATATCAGCTGGAAAGTCCGGTTCTGGACTTTCAATTTTGTGGAGACAAACAAACCAGTTACAGGATTGGAAAATAGTTTCTAAACTAAATAAAAATTGAGTTACAAGATTTTTTTAATCAACAAGGTCCCTATCAAGATTGTAAATCTTACATGGAGCCTTGCATTTCAGGAAAAGCAATGTTGTAGCCGGAGGAAAAGTTTATTTATGATCAGACCAACATTGTCTCAACTACTGAGACTGCAAACTGTAACATGATAAACATCAAGCTTTTATTTTCTCAAAGCATACTACTCAAACATCACTTTAAAATGTTAAAAGACTCGAACTTTATTTGGCAACTTTCTGTAGACAGAAATCAACTCAAGTGTGAAAACTTTGATCTTTTTATTCATTTGGAGAATCTGTGTCGATCATGAGGCGAGGAGTAATC-3’（4）TCR30（703bp）：5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGTACACATCATCGCTTCTTGTCTTTGATCAGATTACTGATTTTGAGACAAAAGTTTCCAACTTTCGATCCGTTTTTCTGTGTCCAAACTAAAATACTCTGTTTTTGTTCATGAAACCTCTGTTTCTCATACTAGGATGCTCTGTTTTTGCTCTTAAACCTCTGTTTCTCAAACTAAAGTCTGATCTTTTGATTTTTTTTTTGGCATAAGTGTACAATAGCAATGGCTCGATCTGCGGTTGATGAGACATCAGACTCGGGAGCATTTCAAAGAACTGCTTCAACATTCCGTAACTTCGTCTCAAGAGATTCCAACTCTCAGTTTCCAGCTGAATCTGGAAGATACCATCTTTACATATCGTATGCTTGTCCATGGGCTTCTAGATGCATCTCATACTTGAAGATTAAAGGACTTGACGATGCTATAAGCTTCTCGGTTCGTTGACTCAAAAGCCCTTTTCAAACTGCTTATGTTCATTACAATAATAGTTTCCTTGTTTGGTTTGCATCAGTCTGTTAAACCCATTTGGGGAAGAACAAAAGAAAGTGATGAGCATATGGGATGGGTCTTCCCGGATTCAGACAATGAGGTCGAAGGAGCTGACTCGGACAATCTTAATGGTGCTAAAAGTGTAAGAGAACTCTATGAGATTGCTAGTCCCAACTACACCGGGAAGTATACTGTTC-3’（5）TCR74（333bp）：5’-TTGAACCATAGGAGGGATAGTTGTTATTCATAATTTAATAGGAAAATTTTCAAAATTTTGAGAAATTCATACTAAAATCTTTTGAGAGATGATCAAAATTGTAGTATCTTGTAACAGTTTTTTATATATATATAAAAAAAAAAGGAGACCGGAAACAAAAATGGTTTAATTAATTAATTATTAAAATAACCAAGCCAATTAAAACATTGAAGATTCATATAACTTAGCCCAAAATGAAGAAGTATAAGGCCCAAATAACTAAGATACACAGTGACACTACTACTCCGCGCCAACTAAACGACAGTAATCATCACTCTATCCATCCATCACCAT-3’2．上述標記TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74的特異性擴增引物分別具有如下序列：（1）TCR25：FTCR25:5’-CGTTTAAATTTGTTTATACGATGCA-3’RTCR25:5’-TGTCCCATTAACAGAATATGAATTT-3’以及由TCR25序列開發的所有引物。（2）TCR108FTCR108:5’-TCTGTCATGTATTATTTAGA-3’RTCR108:5’-GATGCACTCATGCATGTTTC-3’以及由TCR30序列開發的所有引物。（3）TCR116FTCR116:5’-CTATATACCATTTTACAAAC-3’RTCR116:5’-GATTACTCCTCGCCTCATGA-3’以及由TCR30序列開發的所有引物。（4）TCR30FTCR30：5’-CGTGGATCTCGTCTTCAGGT-3’RTCR30：5’-GGAACAGTATACTTCCCGGTGT-3’以及由TCR30序列開發的所有引物。（5）TCR74FTCR74：5’-TTGAACCATAGGAGGGATAGTTG-3’RTCR74：5’-ATGGATGATGGATGGATAGAGTG-3’以及由TCR74序列開發的所有引物。3．上述標記TCR25、TCR108、TCR116、TCR30、TCR74在輔助選擇中的應用方法為：（1）用CTAB等方法對待測材料進行基因組DNA的提取（2）PCR擴增:a.反應體系：10μL體系，各組分物質的含量分別為15ng模板DNA;5pmol·L-1primer;1.0mmol·L-1dNTP;1×PCRBuffer;0.5UTaqDNApolymerase;ddH2O補齊10μL，混勻，離心；b.擴增程序：預變性94℃/5min;94℃/30s;60℃/45s;72℃/30s;35個循環后;72℃延伸10min;最后4℃保存。c.電泳：TCR25、TCR30、TCR74：將擴增產物與等體積的上樣緩沖液混合（98%formamide,10mMEDTA,0.001%xylenecyanol和bromphenolblue）。94℃變性6min，之后在DNA測序電泳儀上進行變性聚丙烯酰胺凝膠（6%）電泳，70W條件下電泳1.5小時。電泳結束后，進行銀染。TCR108、TCR116:將擴增產物與等體積的上樣緩沖液混合（98%formamide,10mMEDTA,0.001%xylenecyanol和bromphenolblue）。之后在瓊脂糖凝膠電泳儀上進行瓊脂糖凝膠（1%）電泳，100V條件下電泳30分鐘。電泳結束后，在紫外燈下觀察、成像。d.判斷①在使用TCR25的引物的擴增結果中如果能夠檢測到兩條帶(301bp和小于301bp），則帶有301bp條帶的材料含有大白菜抗根腫病基因CRb的概率約為99.93%。②在使用TCR108的引物的擴增結果中如果能夠檢到條帶（1366bp），則帶有1336bp條帶的材料含有大白菜抗根腫病基因CRb的概率約為99.96%。③在使用TCR116的引物的擴增結果中如果能夠檢測到條帶（1520bp）,則帶有1520bp條帶的材料含有大白菜抗根腫病基因CRb的概率約為99.92%。④在使用TCR30的引物的擴增結果中如果能夠檢測到兩條帶（703bp和小于703bp），則帶有703bp條帶的材料含有大白菜抗根腫病基因CRb的概率約為99.81%。⑤在使用TCR74的引物的擴增結果中如果能夠檢測到兩條帶（333bp和小于333bp）,則帶有333bp條帶的材料含有大白菜抗根腫病基因CRb的概率約為99.73%。如果①、②、③、④、⑤5項中的擴增結果均可獲得，則待測材料具有大白菜抗根腫病基因CRb的概率為100%。有益效果如下：上述標記TCR25、TCR108、TCR116、TCR34、TCR74與蕓薹種抗根腫病基因CRb緊密連鎖，可廣泛應用于蕓薹種抗根腫病基因CRb的分子標記輔助選擇育種。本發明通過特異引物PCR擴增可對待測植株進行苗期鑒定，大大提高育種效率，縮短育種進程。附圖說明圖1：大白菜抗根腫病CRb基因的標記連鎖圖；圖2：TCR25、TCR108、TCR116、TCR30和TCR74在親本及部分F2代個體上的擴增結果；圖2中...