一種青枯菌的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法與流程

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種青枯菌(Ralstonia solanacearum)的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法。

背景技術：

植物細菌性青枯病(Bacterial wilt of plants)，是由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.，簡稱青枯菌)引起的一種世界性重大病害。青枯病于上世紀30年代在我國首次被報道；上世紀50年代，該病僅分布于我國長江流域。但迄今為止，南起20°N的海南省、北至42°N的河北壩上地區均有其造成危害的報道(徐進等，2013)。作為復合種，青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染54個科的450余種植物(Wicker et al.，2007)。其中經濟上重要的寄主包括馬鈴薯、西紅柿、辣椒、茄子、煙草、生姜、桑樹和香蕉等。

國內最為常用的青枯菌檢測方法是平板劃線分離技術，該方法簡單廉價。但費時費力，且操作人員需具備準確識別青枯菌菌落形態的能力。血清學檢測技術是基于抗原與抗體的專一性識別與結合，它利用抗體與抗原產生的凝集反應、沉淀反應等對靶標病原菌作出快速有效的診斷與鑒定。已報道用于青枯菌檢測的血清學方法，包括酶聯免疫吸附(ELISA)、免疫螢光(IF)、熒光原位雜交(FISH)以及免疫試紙條(Immuno-strip)等。美國阿格迪(Agdia)公司商品化生產的ELISA試劑盒和免疫試紙條在歐美一些國家已被用于室內及田間青枯病疑似樣品的初步篩查。但此類方法的缺點在于價格昂貴，檢測靈敏度不高。如Agdia的檢測試紙條每個樣品的檢測成本約￥50，檢測靈敏度閾值一般在10⁶-10⁷cfu/ml H2O。

基于植物病原細菌核酸序列(Nucleic acid-based)的分子檢測和鑒定方法主要包括：PCR(Polymerase Chain Reaction，PCR)、DNA指紋、DNA芯片以及DNA條形碼技術等。上世紀90年代以來，隨著PCR技術日臻成熟，基于該技術的快速分子診斷方法，被廣泛應用于包括青枯菌在內的植物病原細菌研究領域。較常規平板劃線分離和血清學檢測方法，PCR檢測更為精準、高效和靈敏。

迄今為止，國內外相關研究通過抑制性差減雜交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)、比較基因組學(Comparative Genomics)和DNA指紋圖譜等研究手段，分別以青枯菌的16S和23S rRNA基因及其間隔區(Internal Transgenic Spacer，ITS)、flicC和lpxC等功能基因、未知功能片斷(Anonymous sequence)以及菌株特有基因(strain-specific gene)等作為PCR擴增靶標，設計出了近30套用于青枯菌種及種以下分類單元(演化型、生理小種和生化 變種)的特異性檢測引物或探針。

在種水平上，Opina等基于隨機擴增片段長度多態性(Random amplified polymorphism，RAPD)的分析結果，錨定了青枯菌lpxC基因及其上游部分序列，設計的PCR擴增引物Au759/760，因其在青枯菌種水平鑒定上具有高度的特異性和廣泛的通用性，因此被國內外相關研究者廣為采用；Seal和Pastrik分別基于16S rRNA基因建立的單一PCR和PCR/RFLP檢測方法也比較具有代表性，被歐洲和地中海植物保護組織推薦作為青枯菌的分子鑒定方法。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫擴增技術，因其操作簡單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點，逐漸成為可以替代傳統PCR的新的核酸擴增檢測技術。它是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應體系中恒溫高效擴增，大量合成目的DNA的同時，產生副產物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴增反應依賴于靶DNA的6個獨立的區域，因此特異性非常高，反應在等溫條件下進行，則不需要PCR儀等昂貴設備，僅用水浴鍋等能夠維持穩定恒溫的設備即可完成，檢測成本大大降低，應用范圍顯著擴大，可以在田間進行實時監測。

技術實現要素：

發明目的：針對以上存在的問題，本發明的目的是提供一組LAMP引物組合，能夠檢測植物病原青枯菌。本發明的另一目的是提供上述青枯菌的LAMP檢測試劑盒。本發明的另一目的是提供上述青枯菌的LAMP檢測方法。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種用于青枯菌的LAMP引物組合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內引物FIP，反向內引物BIP和反向環引物LB組成，各引物序列如下：

FIP：5’-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3’；

BIP：5’-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3’；

F3：5’-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3’；

B3：5’-ACCGCAACACGGGATCA-3’；

所述引物組合在檢測青枯菌中的應用。

一種檢測青枯菌的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向內引物FIP 8μM、反向內引物FIP 8μM；

(2)反應液及染料，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶，SYBR Green I；

(3)陽性對照為青枯菌GMI1000菌株的基因組DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合 液。

所述的檢測青枯菌的LAMP試劑盒在檢測青枯菌中的應用

一種檢測青枯菌的方法，包括以DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP試劑盒進行LAMP擴增，觀察反應溶液的顏色變化，顯示橙色表示檢測為陰性，不存在青枯菌，而顯示綠色的為陽性，樣品中存在青枯菌。

所述的檢測青枯菌的方法，提取待測樣品的總DNA，取1μL DNA溶液，加入5μL反應液、5μL引物液、14μL滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為60～65℃，時間為30～50min，反應結束后加入染料觀察顏色變化。

本發明檢測青枯菌的方法，包括待測樣品DNA的提取，以DNA為模板，利用所述引物組合進行LAMP反應。SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，反應結束后通過反應體系的顏色變化判斷青枯菌的有無。顯示橙色表示檢測為陰性，不存在青枯菌，而顯示綠色的為陽性，樣品中存在青枯菌。

本發明的關鍵技術之一是青枯菌的高效特異擴增引物序列及其擴增方法。為了驗證引物序列的特異性，本發明以24株青枯菌和4株非青枯菌菌株為供試材料(表1和表2)，當發生LAMP反應時，產生大量的焦磷酸鎂沉淀導致濁度上升。通過SYBR Green I顯色反應結果所示，青枯菌樣品反應管里均為綠色，其為陽性結果；而非青枯菌樣品管均呈橙色，為陰性結果。證明設計的LAMP引物組合具有特異性。說明該引物組合可被用于田間青枯菌快速可靠的檢測鑒定。

有益效果：現有技術相比，本發明的有點和積極效果表現在：

1)特異性強。本發明針對青枯菌的lpxC基因序列的6個區域設計了4條特異引物，對青枯菌進行特異性識別，其特異性強、靈敏度高，使本發明能夠快速準確完成青枯菌的檢測。

2)操作簡便快捷。本發明提供的檢測青枯菌的LAMP方法，克服了現有生物與化學檢測方法樣品處理繁瑣，檢測周期長、費時費力及需要PCR熱循環儀等問題。該方法無需PCR反應中的退火、復性等溫度的變化，30～50min內即可完成檢測，大大提高了檢測的效率。

3)成本低。本方法無需昂貴、精密的試驗儀器設備，僅需要恒溫水浴鍋或保溫杯即可完成檢測，且實驗過程中所用均為常規試劑，價格低廉。

因此本方法實用性強，可滿足田間青枯菌的快速檢測。

表1 用于檢測引物特異性的青枯菌菌株

表2 用于檢測引物特異性的非青枯菌菌株

(四)附圖說明

圖1：LAMP引物組合的特異性驗證結果

圖中菌株編號與表1和表2相同，圖中顯示1～24反應管為青枯菌，檢測結果呈陽性，25～28為非青枯菌，29為未加入任何DNA的反應管，檢測結果均均顯示陰性。

圖2：LAMP引物組合的靈敏度試驗結果

1～8反應管中菌懸液濃度分別為3×10⁷CFU/mL、3×10⁶CFU/mL、3×10⁵CFU/mL、3×10⁴CFU/mL、3×10³CFU/mL、3×10²CFU/mL、3×10¹CFU/mL、3×10⁰CFU/mL。圖中顯示1～5反應管均顯示陽性，而6～8反應管呈陰性，說明LAMP反應對青枯菌菌懸液的靈敏度為3×10³CFU/mL。

(五)具體實施方式

下面以具體實施例做進一步說明，但本發明不受以下實施例的限制。

實施實例1：青枯菌LAMP反應的特異性實驗

為了驗證LAMP方法的特異性，以24個青枯菌株和4個對照菌株為參試對象(表1和表2)。

LAMP反應：取1μL DNA溶液，加入5μL反應液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為63℃，時間為45min，擴增產物進行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結果如圖1所示，24株青枯菌菌株反應管均顯示綠色的陽性反應，而其他4株菌株及不加入任何DNA模板的反應管均呈橙色的陰性反應。

實施實例2：青枯菌LAMP反應的靈敏度實驗

為了驗證LAMP方法的靈敏度，比濁法制備3×10⁸CFU/mL濃度的青枯菌菌懸液，用超純水進行10倍梯度稀釋。分別取稀釋后的各濃度菌懸液1μL做模板，加入5μL反應液、5μL引物組混合液、14L滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為63℃，時間為45min，擴增產物進行顏色變化的觀察。結果表明(圖2)，加入1μL濃度為3×10⁷CFU/mL、3×10⁶ CFU/mL、3×10⁵CFU/mL、3×10⁴CFU/mL、3×10³CFU/mL菌懸液的反應管呈明顯綠色，而加入1μL濃度為3×10²CFU/mL、3×10¹CFU/mL、3×10⁰CFU/mL菌懸液的反應管呈橙色，表明LAMP反應的靈敏度達到3×10³CFU/mL。

序列表：