用于檢測煙草對tmv抗性的n基因特異性引物對、檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對、檢測方法及試劑盒，特異性引物對包括上游引物和下游引物；上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。檢測方法為：在煙草N基因序列特異區域設計一對特異性引物；以待測煙草品種的DNA為模板，使用N基因特異性引物對進行PCR擴增；采用電泳檢測PCR擴增產物，判斷PCR擴增產物是否含有865bp的特征條帶，如果含有，則對TMV具有抗性；反之，則不具有N基因介導的TMV抗性。具有操作簡便、結果可靠、檢測速度快等優點，能夠極大地加速抗TMV育種材料的選育過程，縮短育種周期，提高育種效率。
【專利說明】用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對、檢測方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物化學與分子生物學領域，具體涉及一種用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對、檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]煙草普通花葉病(TMV, tobacco mosaic virus)是全世界煙草栽培區發生普遍、危害嚴重的一大病害。發病后，煙葉產量降低，品質變劣，對煙葉生產帶來極大危害。目前，對于TMV的防治沒有效果較好的藥劑，只能采取提前預防、綜合防治等措施，由于受耕地資源緊張、連作的影響，培育抗TMV的煙草品種在生產中顯得尤為迫切和重要。
[0003]N基因起源于野生種黏煙草(Nicotiana glutinosa),是目前已經明確的煙草抗TMV基因，是煙草抗TMV育種的主要抗源。1938年，F.Q.Holmes等研究表明，黏煙草對TMV的抗性是由顯性單基因N基因控制的；1994年，S.Whitham等通過轉座子標簽法克隆得到N基因，并證明其介導的TMV抗性可以產生過敏性壞死反應。N基因全長為6656bp，包括5個外顯子和4個內含子，編碼NS和NL兩種轉錄產物，屬于TIR-NBS-LRR類抗病基因。國外已經利用N基因介導的TMV抗性育成了一批高抗TMV的煙草品種，包括Ky56、By21、NC75、VA770、TN86、Colerl76、Coker86等。我國也利用該抗源培育了一系列抗TMV品種(系)，如:利用Ky56作為親本育成了遼煙8號、遼煙10號等抗TMV品種；利用Coker86的抗病性，育成了遼煙13、遼煙14等抗TMV品種。這些品種在我國的煙草生產中發揮了重要作用。
[0004]在傳統的抗TMV育種中，為鑒定所培育的品種是否具有TMV抗性，通常采取田間鑒定方法，即:需要對育種材料進行單株接種并創造合適的發病條件，因此，如果接種不成功或條件不合適，均會影響品種抗性判斷結論，具有品種抗性判斷效率低的不足。
【發明內容】
[0005]針對現有技術存在的缺陷，本發明提供一種用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對、檢測方法及試劑盒，利用N基因特異引物序列檢測不同育種材料TMV抗性，為煙草抗TMV育種提供一條快捷有效的方法，不受生長條件和發育時期的影響，可以快速高效的檢測N基因控制的TMV抗性，加快抗TMV種質資源和優良品種篩選，還具有操作簡便、結果可靠、檢測速度快等優點，能夠極大地加速材料的選育過程，縮短育種周期，提高育種效率。
[0006]本發明采用的技術方案如下:
[0007]本發明第一目的為提供一種用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對，包括上游引物NPF和下游引物NPR ；
[0008]所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0009]所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]本發明第二目的為提供一種煙草是否具有N基因介導的TMV抗性的檢測方法，包括以下步驟:
[0011]SI,利用Genbank提供的煙草基因組序列進行Blast比對，查找被檢測煙草的N基因序列特異區域，并在該特異區域設計N基因特異性引物對；其中，所述N基因特異性引物對包括:上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示；
[0012]N基因序列特異區域的序列如下:
【權利要求】
1.一種用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對，其特征在于，包括上游引物NPF和下游引物NPR ； 所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一種煙草是否具有N基因介導的TMV抗性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，利用Genbank提供的煙草基因組序列進行Blast比對，查找被檢測煙草的N基因序列特異區域，并在該特異區域設計N基因特異性引物對；其中，所述N基因特異性引物對包括:上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示； S2，提取被檢測煙草品種的DNA ； S3，以所述被檢測煙草品種的DNA為模板，使用所述N基因特異性引物對對所述被檢測煙草品種的DNA進行PCR擴增； S4,采用電泳檢測PCR擴增產物，判斷所述PCR擴增產物是否含有865bp的特征條帶，如果含有，則所述被檢測煙草品種具有N基因序列，對TMV具有抗性；反之，則所述被檢測煙草品種不具有N基因介導的TMV抗性。
3.根據權利要求2所述的煙草是否具有N基因介導的TMV抗性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系組成為:2 X Dr eamt aq MIX I Ou I，模板DNA Iu I，上游引物Iu I，下游引物Iul，最后用雙蒸水將反應體系補至20ul。
4.根據權利要求3所述 的煙草是否具有N基因介導的TMV抗性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應條件為:94~95°C預變性3~5min ；94~95°C變性30s ;退火溫度 53-570C，30s ;72°C延伸 Imin ;30_35 個循環，最后 72°C，IOmin 停止反應。
5.根據權利要求4所述的煙草是否具有N基因介導的TMV抗性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應條件為:94°C預變性3min ;94°C變性30s ;退火溫度56°C，30s ；72°C延伸Imin ;共35個循環，最后72°C IOmin停止反應。
6.一種檢測煙草是否具有N基因介導的TMV抗性的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括:PCR反應試劑和引物；所述引物包括: 上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866038SQ201410135454
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】張玉, 羅成剛, 楊愛國, 張偉, 蔣彩虹, 常愛霞, 馮全福, 錢玉梅, 程立銳, 耿銳梅, 任民 申請人:中國農業科學院煙草研究所