本申請要求2014年6月26日提交的美國申請No.62/017,784的權益，通過引用將其全部合并在本文中。
政府撥款條款
本發明是在美國國立衛生研究院授予的款項no.1U01AI070107-01的政府支持下做出的。在本發明中政府擁有某些權利。
技術領域
本發明涉及通過分析預示性基因集(predictive gene set)來診斷異體移植物(allograft)的急性細胞排異(acute cellular rejection，ACR)的方法，以及用于實踐這些方法的試劑盒。所述方法包括通過測定含有至少7個預選基因的基因標記集(gene signature set)的表達水平來分析腎臟異體移植物受者的血液，以鑒定和治療這樣的患者。與對照中的相同基因相比，在異體移植物受者的血液中一種或更多種基因的改變的表達水平表明該患者有異體移植物排異風險。改變的水平越大，排異風險越高。邏輯回歸擬合模型可以應用于標準化了的表達值(例如，來自下一代測序技術的基因的讀取結果計數)來得出統計模型，從所述統計模型中可以對每個患者計算急性細胞排異風險概率評分(probability score)。
背景技術：
腎臟異體移植物排異的現有測試是繁瑣和昂貴的。這樣的測試通常需要從患者獲得活檢樣本。經常在認識到排異時已經太晚而不能做任何事。血清肌酸酐的提高或尿液中蛋白質的提高可能是排異的警告，但不完全是預示性的。本領域中需要一種改進的分析，其易于進行，消除了活檢的需求，對于腎臟異體移植物排異或纖維化的風險是更為預示性的。
當前的表達譜(expression profile)測試解決了這一需求，并提供了一種容易對移植患者(transplant patient)重復實施的基于血液的分析。在移植之后腎臟移植患者由他們的醫師非常頻繁地檢查，大多數情況下第一個月每周兩次，到每周一次，然后每隔一周一次，在4到5個月后每月一次，此后就診的時間間隔逐步提高。在這期間，監視患者的腎臟功能和免疫抑制水平。如果移植后的過程沒有并發癥并且患者沒有高免疫學風險，到手術后3個月，類固醇逐漸減少到5mg，到6-12個月，他克莫司(tacrolimus，一種抑制免疫系統的藥物，被用于預防移植器官的排異)水平逐漸降低到穩定水平。可以采用下文描述的基因表達譜作為標準測試來在臨床就診時進行。陽性測試結果(即，相比對照，患者以改變的水平表達這些基因)表明患者有排異移植器官的風險，將通過提高免疫抑制藥物的劑量和通過中止免疫抑制藥物的慣常的漸減來治療。重復測試(其可以經濟地進行，因為所述分析優選地是基于血液的測試)將指導免疫抑制漸減的重新開始。因而，例如如果2次隨后的測試是陰性的，潑尼松(prednisone)劑量可以降低2.5或5mg，或者他克莫司的目標水平可以降低0.5mg/dl。如果在肌酸酐升高的情況下譜測試是陽性的，這將表明臨床急性排異，以腎臟損傷作為證據。在這種情況下，取決于個體的總體免疫學風險，患者將用高劑量的類固醇或抗淋巴細胞劑來治療。
技術實現要素：
一方面，提供了鑒定有異體移植物排異或失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，通過從腎臟異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中預選的基因標記集的表達水平，比較所述樣本中所述預選的基因標記集的表達水平與對照中所述預選的基因標記集的表達水平，如果相比所述對照中的表達水平，所述樣本中所述基因標記集的表達水平改變，確定所述異體移植物受者有排異異體移植物的提高風險。
另一方面，提供了鑒定有異體移植物排異或失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，通過從腎臟異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中預選的基因標記集的表達水平，比較所述樣本中所述預選的基因標記集的表達水平與對照中所述預選的基因標記集的表達水平，如果相比所述對照中所述基因標記集中的一種或更多種基因的表達水平，所述樣本中所述基因標記集中的一種或更多種基因的表達水平改變，確定所述異體移植物受者有排異異體移植物的提高風險。
另一方面，提供了治療有異體移植物排異或失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，通過從腎臟異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中預選的基因標記集的表達水平，比較所述樣本中所述預選的基因標記集的表達水平與對照樣品中所述預選的基因標記集的表達水平，如果相比所述對照中所述預選的基因標記集的表達水平，所述樣本中所述基因標記集的表達水平改變，確定所述異體移植物受者有排異異體移植物的提高風險，以及治療被確定有排異風險的受者。
另一方面，提供了治療有異體移植物排異或失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，通過從腎臟異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中預選的基因標記集的表達水平，比較所述樣本中所述預選的基因標記集的表達水平與對照樣品中所述預選的基因標記集的表達水平，如果相比所述對照中所述基因標記集中的一種或更多種基因的表達水平，所述樣本中所述基因標記集中的一種或更多種基因的表達水平改變，確定所述異體移植物受者有排異異體移植物的提高風險，以及治療被確定有排異風險的受者。
在另一個實施方式中，提供了治療腎臟異體移植物受者的方法，通過從所述異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中選定的基因集的表達水平，比較所述樣本中所述基因集的表達水平與對照患者的表達水平，如果相比所述對照中所述基因集的表達水平，所述樣本中所述基因集的表達水平改變，確定所述受者有排異異體移植物的風險，以及治療被確定有排異風險的受者。
在另一個實施方式中，提供了治療腎臟異體移植物受者的方法，通過從所述異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中選定的基因集的表達水平，比較所述樣本中所述基因集的表達水平與對照的表達水平，如果相比所述對照中所述基因標記集的一個或多個成員的表達水平，所述樣本中所述基因集的一個或多個成員的表達水平改變，確定所述受者有排異異體移植物的風險，以及治療被確定有排異風險的受者。
另一個實施方式提供了治療腎臟異體移植物受者的方法，通過從所述異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中選定的基因集的表達水平，比較所述樣本中所述基因集的表達水平與對照的表達水平，如果相對于所述對照中所述基因集的表達水平，所述樣本中所述基因集的表達水平改變，確定所述患者有排異異體移植物的風險，以及通過向所述受者施用免疫抑制藥物或通過施用高劑量類固醇或抗淋巴細胞劑來治療被確定有排異風險的受者。
另一個實施方式提供了治療腎臟異體移植物受者的方法，通過從所述異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中選定的基因集的表達水平，比較所述樣本中所述基因集的表達水平與對照中所述基因集的表達水平，如果相對于所述對照中所述基因集的一個或多個成員的表達水平，所述樣本中所述基因集的一個或更多個基因的表達水平改變，確定所述患者有排異異體移植物的風險，以及通過向所述受者施用免疫抑制藥物或通過施用高劑量類固醇或抗淋巴細胞劑來治療被確定有排異風險的受者。
另一個方面，提供了用于確定異體移植物受者是否有ACR風險的試劑盒。所述試劑盒包含用于預選的基因標記集的分析、用于預選的基因標記集的引物、緩沖液、陽性和陰性對照以及使用說明書。
一方面，提供了測序面板，其包含來自基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1的至少7個基因。
另一個方面，提供了測序面板，其包含基因ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7。
另一個方面，提供的測序面板，其包含基因TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、MAP1A、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7。
另一個方面，提供了測序面板，其包含基因CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1和C1GALT1C1。
另一個方面，提供了測序面板，其包含基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1。
又一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功(allograft loss)風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
又一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、MAP1A、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
又一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1和C1GALT1C1)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
另一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
本發明的另一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集包含選自以下組成的組的基因：SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
進一步的方面提供了鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，包括步驟：提供來自腎臟異體移植物受者的血液樣本，從所述血液樣本分離mRNA，從所述mRNA合成cDNA，用MiSEQ測序系統(Illumina,Inc.San Diego California)、Nanostring(miRNA Expression Assay-Nanostring Technologies,Inc.Seattle Washington)或qPCR測量包含預選的基因標記集的基因面板的表達水平。基因集分析的結果與對照比較。基因表達結果可以用于在移植患者中預測異體移植物排異應答的發作、診斷異體移植物排異應答和/或表征異體移植物排異應答。如果相對于對照中的表達水平，患者以改變的水平表達所述基因標記集，所述患者有排異風險。患者的標記基因集表達水平相比對照改變越大，排異風險越大。
另一個方面，分析的結果被應用于懲罰邏輯回歸擬合模型(log(p(x))/(1-p(x))＝β*0+β*1g1+β*igi+....+β*ngn(其中p(x)是ACR的概率，β*i是懲罰系數，gi是基因i的讀取結果計數)，其可以用于計算每個患者的急性排異概率評分。
另一個方面，本發明提供了評估患者中腎臟移植排異的可能性的方法，通過測定來自所述患者的樣品中預選基因集的表達水平(所述基因集至少含有基因ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7)，比較所述樣品中所述預選基因集基因的表達水平與對照中所述預選基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了評估患者中腎臟移植排異的可能性的方法，通過測定來自所述患者的樣品中預選基因集的表達水平(所述基因集至少含有基因TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、MAP1A、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7)，比較所述樣品中所述預選基因集基因的表達水平與對照中所述預選基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了評估患者中腎臟移植排異的可能性的方法，通過測定來自所述患者的樣品中預選基因集的表達水平(所述基因集至少含有基因CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1和C1GALT1C1)，比較所述樣品中所述預選基因集基因的表達水平與對照中所述基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了評估患者中腎臟移植排異的可能性的方法，通過測定來自所述患者的樣品中預選基因集的表達水平(所述基因集至少含有基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1)，比較所述樣品中所述預選基因集基因的表達水平與對照中所述預選基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中基因集的表達水平(所述基因集至少包含基因ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7)，以及比較所述樣品中所述基因集表達水平與對照中所述基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中基因集的表達水平(所述基因集至少包含基因TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、MAP1A、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7)，以及比較所述樣品中所述基因集表達水平與對照中所述基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中基因集的表達水平(所述基因集至少包含基因CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1和C1GALT1C1)，以及比較所述樣品中所述基因集表達水平與對照中所述基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了評估患者中腎臟移植排異的可能性的方法，通過測定來自所述患者的樣品中預選基因集的表達水平(所述基因集至少含有基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1)，比較所述樣品中所述預選基因集基因的表達水平與對照中所述基因集基因的表達水平，來評估所述患者中腎臟移植排異的可能性。
另一個方面，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中基因集的表達水平，所述基因集至少包含基因TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7。
另一個方面，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中十一成員基因集(eleven member gene set)的表達水平，所述十一成員基因集至少包含基因CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1和C1GALT1C1。
另一個方面，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中17成員基因集的表達水平，所述基因集至少包含基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1。
另一個方面，本發明提供了用于確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的試劑盒，其在一個或更多個容器中包含用于預選基因集的引物對、陽性和陰性對照、緩沖液和使用說明書。
另一個方面，本發明提供了用于確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的試劑盒，其在一個或更多個容器中包含用于17成員基因集的引物對、陽性和陰性對照、緩沖液和使用說明書。
另一個方面，本發明提供了用于確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的試劑盒，其在一個或更多個容器中包含用于11成員基因集的引物對、陽性和陰性對照、緩沖液和使用說明書。
另一個方面，本發明提供了用于確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的試劑盒，其在一個或更多個容器中包含用于9成員基因集的引物對、陽性和陰性對照、緩沖液和使用說明書。
另一個方面，本發明提供了用于確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的試劑盒，其在一個或更多個容器中包含用于7成員基因集的引物對、陽性和陰性對照、緩沖液和使用說明書。
另一個方面，本發明提供了針對治療選擇腎臟異體移植物受者來降低腎臟異體移植物排異風險的方法，其包括
(a)提供來自所述腎臟異體移植物受者的血液樣本；
(b)測定所述樣本中預選基因集的表達水平；
(c)比較所述樣本中所述預選基因集基因的表達水平和對照中所述預選基因集基因的表達水平，以及
(d)如果相比所述對照中一個或更多個所述基因集基因的表達水平，所述樣本中所述基因集中一個或更多個基因的表達水平改變，選擇所述受者用于治療異體移植物排異。
另一個方面，本發明提供了針對治療選擇腎臟異體移植物患者來降低腎臟異體移植物排異或異體移植物失功風險的方法，其包括比較獲自所述患者的預選基因集的表達水平與獲自不患有異體移植物排異的異體移植物受者的對照樣品中所述預選基因集的表達水平，如果相比所述對照中一個或更多個所述預選基因集基因的表達水平，來自所述患者的所述預選基因集中一個或更多個基因的表達水平改變，選擇所述患者用于治療異體移植物排異或失功。
在以下附圖和說明中將闡述本發明的一個或多個實施方式的細節。根據說明書和附圖，以及根據權利要求書，本發明的其他特征、目的和益處將是明顯的。
具體實施方式
定義
如本文使用的，術語“約”或“大約”通常是指處于值的類型和測量方法的可接受的誤差范圍內。例如，它可以指在給定值或范圍的20％之內，更優選的10％之內，再最優選的在5％之內。可選地，特別是在生物系統中，術語“約”是指在約一個log(即，一個數量級)之內，優選的在給定值的兩個因數(指數，factor)之內。
本文使用的“ACR”是指急性細胞排異。
根據本發明，可以采用本領域技術人員能力之內的常規的分子生物學、微生物學、重組DNA、免疫學、細胞生物學和其他相關的技術。參見，例如，Sambrook et al.,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.；Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.；Ausubel et al.,eds.(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Bonifacino et al.,eds.(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan et al.,eds.(2005)Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coico et al.,eds.(2005)Current Protocols in Microbiology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan et al.,eds.(2005)Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Enna et al.,eds.(2005)Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Hames et al.,eds.(1999)Protein Expression:A Practical Approach.Oxford University Press:Oxford；Freshney(2000)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique.4th ed.Wiley-Liss；等等。上文列出的當前手冊(Current Protocols)每年更新幾次。
術語“降低”、“降低的”、“減少的”、“減少”或“下調的”在本文中一般全部用于指統計學顯著量的減少。然而，為了避免疑惑，“減少的”、“減少”、“下調”、“降低的”或“降低”是指與參考水平相比減去至少10％，例如減去至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％或多達并包括100％的降低(即與參考樣品相比沒有水平)，或與參考水平相比10-100％之間的任何降低，或與參考水平相比至少約0.5倍、或至少約1.0倍、或至少約1.2倍、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約10倍降低，或1.0倍到10倍之間的任何降低或更多。
術語“提高的”、“提高”或“上調”在本文中一般全部用于指統計學顯著量的增加；為了避免任何疑惑，術語“提高的”或“提高”是指與參考水平相比提高至少10％，例如提高至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％或多達并包括100％的提高，或與參考水平相比10-100％之間的任何提高，或與參考水平相比至少約0.5倍、或至少約1.0倍、或至少約1.2倍、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約10倍提高，或1.0倍到10倍之間的任何提高或更多。
如本文使用的，“測定表達的水平”、“測定表達水平”或“檢測表達水平”，以及例如“測定基因的表達水平”是指定量樣品中存在的mRNA的數量。檢測特定mRNA的表達可以利用本領域已知的或本文描述的任何方法實現。一般地，mRNA檢測方法涉及序列特異性檢測，例如，通過RT-PCR。可以利用核酸序列設計mRNA特異性引物和探針，這是本領域已知的。
在整個申請和附隨的權利要求中，應當理解的以及希望被理解的是，術語“藥物”、“藥品”、“劑、試劑(agent)”和“治療劑”是可互換的表述，限定了相同的或相似的實體。“藥物”一般是指化合物、小分子、或其他生物學組合物，例如，反義化合物、抗體、蛋白酶抑制劑、激素、趨化因子或細胞因子，當向受試者正確施用時，能夠誘導期望的治療或預防效果。
如本文使用的，病狀(state)、紊亂(disorder)或病況(condition)的“治療(treating)”或“治療(treatment)”包括：(1)預防或延遲哺乳動物中發生的病狀、紊亂或病況的臨床或亞臨床癥狀的出現，所述哺乳動物可能受擾于或傾向于所述病狀、紊亂或病況，但還沒有經歷或顯示所述病狀、紊亂或病況的臨床或亞臨床癥狀(例如，腎臟異體移植物的纖維化和/或異體移植物失功)；和/或(2)抑制所述病狀、紊亂或病況，即，阻礙(arrest)、降低或延遲疾病的發生(development)或其復發(在維持治療的情況下)，或其至少一種臨床或亞臨床癥狀；和/或(3)減輕疾病，即，引起病狀、紊亂或病況，或者其臨床或亞臨床癥狀的至少一種的減退；和/或(4)引起疾病的一種或更多種癥狀的嚴重度方面的降低。對被治療的受試者的益處是統計學上顯著的，或至少對于患者或醫師是可感覺到的。
如本文使用的，術語疾病或病況(例如，ACR和/或異體移植物失功)的“抑制”是指，例如，通過例如患者或患者的醫生，在出現或可檢測之前停止受試者中疾病的一種或更多種癥狀的發生。優選地，所述疾病或病況根本不發生，即，沒有可檢測的疾病癥狀。然而，其還可以引起疾病的一種或更多種癥狀的發生的延遲或減緩。
如本文使用的，與參考水平或對照水平相比mRNA的“改變”的表達水平是至少0.5倍(例如，至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000或10000倍)改變的mRNA表達水平。要理解的是，所述改變可以是提高或降低。可選地，改變的表達水平被定義為，利用根據訓練患者組建立的邏輯回歸模型中的參數，將概率評分與從訓練集得出的截止值(cutoff)比較，急性排異概率評分的提高。
“對照”被定義為從接受了異體移植物移植、不患有急性細胞排異的患者獲得的樣品。
現在已經確定的是，基因預選集的增強的轉錄可以用于在患者顯現任何明顯癥狀之前預測腎臟異體移植物受者將排異移植的腎臟的可能性。該分析也可以用于診斷腎臟移植患者是否經歷急性排異。基因集的過量表達可以用于鑒定有急性排異風險的患者。
如果患者以相對于對照改變的水平表達預選基因，所述患者有排異風險。與對照相比預先的基因的表達水平的改變越大，排異風險越大。所述分析獲得的信息也可以應用于懲罰邏輯回歸擬合模型(log(p(x))/(1-p(x))＝β*0+β*1g1+β*igi+....+β*9g9(其中p(x)是ACR的概率，β*i是懲罰系數，gi是基因i的讀取結果計數)，其可以對每個患者計算急性排異概率評分。在一個實施方式中，更高的評分表明患者處于排異移植的器官的高風險之中。
當前，急性排異的診斷需要腎臟異體移植物活檢，其由存在腎臟損傷的情況下的肌酸酐升高而觸發。患者活檢樣品的采集和分析是費時和昂貴的。當前的分析技術是生物學的組織分析，優選避免需要活檢樣本的基于血液的分析。所述分析可以用于在患者顯現任何明顯癥狀之前預測腎臟異體移植物受者將排異移植的腎臟的可能性。該分析也可以用于診斷腎臟移植患者是否經歷急性排異。該分析是便宜的、高精確性的、可重復的和非侵入性的。
已經鑒定了外周血標記，其使用包含至少7個以及多達17個預選基因的基因標記集。這些預選基因集可以用于精確地診斷腎臟異體移植物的亞臨床排異，以及鑒定有隨后的組織學和功能降低風險以及移植排異風險的腎臟異體移植物。
在實踐本文公開的方法中有用的基因標記集選自以下基因：SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1。
本發明的七基因外周血標記集是ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7。
本發明的九基因外周血標記是：TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、MAP1A、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7。
本發明的11-基因外周血標記是：CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1和C1GALT1C1。
本發明的17-基因外周血標記是：SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1。
這些血液標記集的每一個可以用于實踐本發明。然而，11基因血液標記集是優選的實施方式。
本發明提供了鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，包括步驟：提供來自腎臟異體移植物受者的血液樣本，從所述血液樣本分離mRNA，從所述mRNA合成cDNA，用MiSEQ測序系統(Illumina,Inc.San Diego California)、Nanostring(miRNA Expression Assay-Nanostring Technologies,Inc.Seattle Washington)或qPCR測量包含選定的基因標記集的基因面板的表達水平。基因集分析的結果與對照比較。基因表達結果可以用于在移植患者中預測異體移植物排異應答的發作、診斷異體移植物排異應答、和/或表征異體移植物排異應答。如果相對于對照中的基因標記集基因的表達水平，患者以改變的水平表達基因標記集，所述患者有排異風險。患者的標記基因集表達水平相比對照改變越大，排異風險越大。
一方面，提供了治療腎臟異體移植物受者的方法，通過從所述腎臟異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中預選的基因標記集的表達水平，比較所述樣本中所述預選的基因標記集的表達水平與對照樣品中所述基因標記基因的表達水平，如果相對于所述對照中所述基因標記集的水平，所述樣本中所述基因標記集的水平改變，確定所述異體移植物受者有異體移植物的急性T細胞介導的排異的提高風險。
在另一個實施方式中，提供了治療腎臟異體移植患者的方法，通過從所述異體移植患者獲得生物樣本，測量所述樣本中選定的基因集的表達水平，比較所述樣本中所述基因集的表達水平與對照患者的表達水平，如果相對于所述對照中所述基因集的表達水平，所述樣本中所述基因集的表達水平改變，確定所述患者有排異異體移植物的風險，以及治療被確定有排異風險的患者來預防排異。
另一個實施方式提供了治療腎臟異體移植物受者的方法，通過從所述異體移植物受者獲得生物樣本，測量所述樣本中預選基因集的表達水平，比較所述樣本中所述基因集的表達水平與對照的表達水平，如果相對于所述對照中所述基因集的表達水平，所述樣本中所述基因集的表達水平改變，確定所述患者有排異風險，以及通過向所述受者施用免疫抑制藥物或通過施用高劑量類固醇或抗淋巴細胞劑來治療被確定有排異風險的受者。
在又一個實施方式中，提供了一種用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
在又一個實施方式中，提供了一種用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因TSC22D1、ANKA5、EFTUD2、AP1M1、MAP1A、C1GALT1C1、SENP6、CLK1和SENP7)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
又一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因CCDC82、F13A1、TUBB1、TSC22D1、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、and C1GALT1C1)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
又一個方面是用于鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有異體移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的分析試劑盒，包含處于一個或更多個獨立容器中的：用于基因標記集的分析(所述基因標記集至少包含基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1)，緩沖液，陽性和陰性對照以及使用說明書。
在進一步的實施方式中，本發明提供了鑒定患有亞臨床和臨床的急性排異以及有移植物失功風險的腎臟異體移植物受者的方法，包括步驟：提供來自腎臟異體移植物受者的血液樣本，從所述血液樣本分離mRNA，從所述mRNA合成cDNA，用MiSEQ測序系統(Illumina,Inc.San Diego California)、Nanostring(miRNA Expression Assay-Nanostring Technologies,Inc.Seattle Washington)或qPCR測量包含選定的九基因標記集的基因面板的表達水平。基因集分析的結果與對照中所述標記集基因的表達水平比較。基因表達結果可以用于在移植患者中預測異體移植物排異應答的發作、診斷異體移植物排異應答、和/或表征異體移植物排異應答。如果患者以相對于對照改變的水平表達基因標記集，所述患者有排異標記集基因的風險。患者的基因標記基因的表達水平相比對照改變(提高和/或降低)越大，排異風險越大。
在另一個實施方式中，分析的結果被應用于懲罰邏輯回歸擬合模型(log(p(x))/(1-p(x))＝β*0+β*1g1+β*igi+....+β*ngn(其中p(x)是ACR的概率，β*i是懲罰系數，gi是基因i的讀取結果計數)，其可以用于計算每個患者的急性排異概率評分。如果患者的概率評分高于對照的概率評分，則患者有急性細胞排異風險。.
在另一個實施方式中，本發明提供了確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的方法，通過評估來自所述接受了異體移植物的患者的樣品中17成員基因集的表達水平，所述基因集至少包含基因SPCS3、ZMAT1、ETAA1、ZNF493、CCDC82、NFYB、F13A1、TUBB1、TSC22D1、SENP6、ANXA5、EFTUD2、SENP7、AP1M1、CLK1、MAP1A和C1GALT1C1。
在本文的某些方法中，希望的是檢測和定量樣品中存在的mRNA。RNA表達的檢測和定量可以通過許多本領域公知的方法的任一種來實現。利用RNA家族成員的已知序列，視情況可以設計特異性探針和引物用于下文描述的檢測方法中。
在某些情況下，RNA表達的檢測和定量需要從樣品例如細胞或組織樣品分離核酸。核酸，包括RNA和具體的mRNA，可以利用本領域已知的任何適合的技術來分離。例如，基于苯酚的提取是分離RNA的常見方法。基于苯酚的試劑含有變性劑與RNase抑制劑的組合，用于破壞細胞和組織以及隨后從污染物中分離RNA。基于苯酚的分離過程可以回收10-200個核苷酸范圍的RNA物種(例如，前體和成熟miRNA，5S和5.8S核糖體RNA(rRNA)，和U1小核RNA(snRNA))。此外，提取過程例如利用TRIZOLTM或TRI REAGENTTM的那些過程將純化所有RNA，大的和小的，并且是從含有miRNA和小干擾RNA(siRNA)的生物樣品中分離總RNA的高效方法。提取過程例如使用QIAGEN-ALLprep試劑盒的那些過程也是期待的。
在某些實施方式中，使用定量性RT-PCR是期望的。定量RT-PCR(qRT-PCR)是用于快速測量聚合酶鏈式反應的產物數量的聚合酶鏈式反應的改進。qRT-PCR通常用于確定遺傳序列是否存在于樣品中的目的，以及如果存在，確定樣品的中的拷貝數。可以測定核酸分子包括mRNA的表達的任何PCR方法落入當前公開內容的范圍內。存在著本領域已知的QRT-PCR方法的幾種變體，下文描述其中三種。
在另一個實施方式中，本發明提供了用于確定接受了異體移植物的患者是否經歷異體移植物急性排異的試劑盒，其在一個或更多個容器中包含用于17成員基因集的引物對、陽性和陰性對照、緩沖液和使用說明書。
在典型的實施方式中，臨床實驗室將利用患者的樣品獲得表達值并發送給患者的醫生。醫生然后將這一值傳遞給他的基于web的服務提供者。服務提供者將在生物信息學系統中輸入該值，所述系統已具有預選基因集的每個基因的懲罰系數，以及來自訓練集的邏輯回歸模型的截止值。生物信息學系統將使用這些信息來計算患者的概率評分。計算出的評分將反映患者的ACR狀態。
下文使用九基因標記作為非限制性實例描述了ACR診斷中應用基因標記的總體過程。
1)選擇訓練組：仔細地選一組具有平衡的ACR和沒有ACR(對照)病情(總數N＝～100)的腎臟移植患者。訓練組將具有良好表征的人口統計資料和臨床指標，其已經由至少兩位病理學家檢視。
2)測量9個基因的表達：來自訓練組中每位患者的移植后血液樣品的9個基因的表達水平可以使用任何技術來測量，優選地通過MiSEQ、RT-PCR或Nanostring技術。這些技術的運用在以下的實施例1-3中描述。
3)建立回歸模型和截止值：然后，使用logistf R程序包(一種可以獲自r-project.org的統計程序包)的懲罰邏輯回歸擬合模型將應用于9個基因的表達值來得出統計模型，從所述統計模型中將得到每個基因的β*值，根據以下方程計算每位患者的急性排異概率評分：
(log(p(x))/(1-p(x))＝β*0+β*1g1+β*igi+....+β*9g9
(其中p(x)是ACR的概率，β*i是懲罰系數，gi是基因i的讀取結果計數)
根據概率評分，將確定預測統計，例如預測真陽性率對比假陽性的ROC(受者工作特征)曲線的AUC(曲線下面積)、敏感性/特異性、陽性值(PPV)和陰性預測值(NPV)。在給定的特異性(90％)下建立概率評分截止值，其最好地檢測急性排異的存在。預計的是，這可以清楚地截止為兩個組，如果患者處于頂部組，他們有更高的可能性具有急性排異，并且測試被確定為陽性，如果他們處于底部，他們有極低的可能具有急性排異，測試被確定為陰性。
可選的是，將根據如上確定的他們的概率評分將患者置入三分位(tertiles)。在這種情況下，如果患者處于(1)頂部三分位，他們具有很高可能性具有急性排異，測試被確定為陽性；(2)他們處于第二三分位或中間組，他們的風險不能被精確地確定；以及(3)如果他們處于底部，他們有極低的可能具有急性排異，測試被確定為陰性。
來自訓練組的系數(β*值)和截止值將被輸入和保存在基于web的生物信息學計算機系統中，其可以由臨床實驗室/醫生辦公室通過互聯網訪問。
4)新病例的診斷：對于新的患者，9基因集的表達水平將在臨床實驗室中通過用于訓練集的相同技術來測量。通過使用基于web的生物信息學系統，通過9個基因的表達值(gi)乘以從訓練集得出的它們的β*值，對它們求和計算出概率評分。概率評分與截止值比較來確定ACR狀態。患者的概率評分相對于對照的概率評分的提高表明患者有異體移植物排異的提高的風險。臨床實驗室將該測試結果發送給醫生。
本文公開的方法精確地診斷亞臨床和臨床的排異，精確地鑒定有隨后的組織學和功能降低風險的異體移植物，以及有移植物失功風險的異體移植物受者。
當鑒定出這樣的異體移植物受者時，本發明包括治療這樣的患者的方法。所述方法包括，無限制地，增加施用免疫抑制藥物，即鈣調磷酸酶抑制劑(CNI，calcineurin inhibitor)例如，環孢霉素(cyclosporine)或他克莫司，或減少產生纖維的免疫抑制藥物，例如嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)或西羅莫司。免疫抑制劑的主要類別有鈣調磷酸酶抑制劑(CNI)，其包括他克莫司(和XL(Astellas Pharma Inc.)以及的仿制藥(generics))和環孢霉素(和(Novartis AG)和仿制藥)。類固醇例如潑尼松也可以施用，來治療有移植物失功或功能下降風險的患者。抗增殖劑例如嗎替麥考酚酯、麥考酚鈉和硫唑嘌呤(Azathioprine)在這樣的治療中也是有用的。免疫抑制可以用許多不同的藥物實現，包括類固醇、靶向抗體和CNI樣他克莫司。在這些之中，就抑制免疫系統而言他克莫司是更有效的之一，施用高劑量的類固醇或抗淋巴細胞劑取決于存在或是不存在肌酸酐升高。臨床排異的當前優選的治療方案是高劑量的類固醇或抗淋巴細胞劑。另一種優選試劑是(貝拉西普，Bristol-Myers Squibb)，一種輸注的生物制劑。
試劑盒
在某些實施方式中，提供試劑盒用于測定腎臟異體移植物受者的異體移植物失功風險。
所述試劑盒將含有如下文實施例5所列的17成員基因標記集的引物(用于Nanostring分析)，用于2個持家基因、β肌動蛋白(ACTB)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的引物，以及對照探針，18S核糖體RNA(用于qPCR分析)。
試劑盒可以進一步含有一種或更多種mRNA提取試劑和/或用于cDNA合成的試劑。在其他實施方式中，所述試劑盒可以包含一個或更多個容器，生物制劑放入其中，優選地適當等分地(aliquotted)放入。試劑盒的成分可以包裝在水性介質中或以凍干形式包裝。所述試劑盒也可以包含一種或更多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或載體。藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或載體的非限制性實例包括無RNAse的水、蒸餾水、緩沖的水、生理鹽水、PBS、Ringer's溶液、葡萄糖溶液、反應緩沖液、標記緩沖液、洗滌緩沖液和雜交緩沖液。
本發明的試劑盒可以采取多種形式。一般地，試劑盒將包括適合于測定樣品中的基因集表達水平(例如，本文公開的那些)的試劑。任選地，試劑盒可以含有一個或更多個對照樣品。此外，在某些情況下，試劑盒將包括提供參考(例如，預定值)的書面信息(標識)，其中受試者中的基因表達水平和參考(預定值)之間的比較是臨床狀態的指示。
在某些情況下，試劑盒包含對于與參考比較基因集表達水平或出現有用的軟件(例如，預測模型)。通常，所述軟件將以計算機可讀形式提供，例如，盤，但也可以通過互聯網下載獲得。然而，所述試劑盒不受此限制，其他變體對于本領域普通技術人員而言是顯而易見的。
根據基因集的表達水平(例如，本文公開的那些)，當前的方法也可以用于選擇對受試者的治療和/或確定對受試者的治療計劃。
表達水平和/或參考表達水平可以保存在適合的數據存儲媒介(例如，數據庫)中，因而對于未來的診斷也是可用的。這也容許有效地診斷疾病的發病率，因為一旦確認(將來)獲取相應參考樣品的受試者發生異體移植物的纖維化和/或經歷異體移植物排異，適合的參考結果可以在數據庫中鑒定。
如本文使用的，“數據庫”包含適合的存儲媒介上采集的數據(例如，被分析物和/或參考水平信息和/或患者信息)。此外，所述數據庫可以進一步包含數據庫管理系統。所述數據庫管理系統優選地是基于網絡的、分層的或面向對象的數據庫管理系統。更優選的，所述數據庫將作為分布的(聯合的)系統，例如作為客戶端-服務器-系統來實現。更優選的，所述數據庫是結構化的，以容許搜索算法來比較測試數據集和通過數據采集包含的數據集。具體地，通過使用這樣的算法，可以檢索所述數據庫中表現腎臟異體移植物排異風險的相似或相同的數據集。因而，如果在所述數據采集中可以鑒定相同或相似的數據集，所述測試數據集將與腎臟異體移植物排異風險相關聯。因此，從數據采集獲得的信息可以用于診斷異體移植物受者的異體移植物失功風險，或基于從受試者獲得的測試數據集。更優選的，數據采集包含所有被分析物的特征值，所述被分析物被上文引述的組的任一個所包含。
本發明進一步提供了分析結果或診斷或這兩者與例如技術員、醫師或患者的通信。在某些實施方式中，計算機將用于將分析結果或診斷或這兩者通知給當事人，例如，醫師和他們的患者。
在某些實施方式中，本文公開的方法進一步包含修改受者的臨床記錄來鑒定有發生ACR和/或異體移植物失功風險的受者。所述臨床記錄可以保存在任何適合的數據存儲媒介中(例如，計算機可讀媒介)。
在本發明的某些實施方式中，根據本文提供的方法的診斷在獲得診斷之后盡可能快地通知給異體移植物受者。所述診斷可以由所述受者的治療醫師通知給受者。可選地，所述診斷可以通過電子郵件發送給受者，或通過電話通知受試者。所述診斷可以以報告的形式發送給受者。計算機可以用于通過電子郵件或電話來通知所述診斷。在某些實施方式中，利用通信領域技術人員熟悉的計算機硬件和軟件的組合，含有診斷測試結果的信息可以產生并自動發送給受者。
本發明的方面包括計算機程序產品，用于鑒定經歷腎臟異體移植物并有急性排異風險的受試者，其中所述計算機程序產品在加載到計算機上時被配置以采用來自受試者得到的樣品的基因表達結果，來確定經歷腎臟異體移植的受試者是否有異體移植物排異風險，其中所述基因表達結果包含至少一個基因標記集的表達數據。
還提供的是以下之一的表型的參考表達譜：(a)急性排異低風險；或(b)高風險；其中所述表達譜被記錄在計算機可讀媒介上，所述計算機可讀媒介可被用戶訪問，例如，以用戶可讀取的形式。在某些實施方式中，所述表達譜包括。在某些實施方式中，所述表達譜是低風險的表型的譜。在某些實施方式中，所述表達譜是高風險的表型譜。
所述表達譜及其數據庫可以以各種媒介提供來促進它們的應用。“媒介”是指含有本發明的表達譜信息的產品。本發明的數據庫可以被記錄在計算機可讀媒介上，例如，可由用戶利用計算機直接讀取和訪問的任何媒介。這樣的媒介包括，但不限于：磁存儲媒介，例如，軟磁盤、硬磁盤存儲媒介和磁帶；光存儲媒介，例如CD-ROM；電子存儲媒介，例如，RAM和ROM；和這些類別的雜合物，例如，磁/光存儲媒介。本領域技術人員可以容易地理解，任何當前已知的計算機可讀媒介如何用于產生包含當前數據庫信息記錄的產品。
“記錄”是指使用本領域已知的這樣的方法將信息存儲在計算機可讀媒介上的過程。根據用于訪問存儲的信息的手段，可以選擇任何方便的數據存儲結構。多種數據處理器程序和格式可以用于存儲，例如，字處理文本文件、數據庫格式，等等。因而，受試者表達譜數據庫可以被用戶訪問，即，數據庫文件以用戶可讀形式保存(例如，計算機可讀形式，其中用戶控制所述計算機)。
如本文使用的，“基于計算機的系統”是指用于分析本發明的信息的硬件裝置、軟件裝置和數據存儲裝置。本發明的基于計算機的系統的最小硬件包括中央處理器(CPU)、輸入裝置、輸出裝置和數據存儲裝置。熟練的技術人員可以容易地理解，任一種當前可用的基于計算機的系統適合在本發明中使用。數據存儲裝置可以包含任何產品，其包含如上所述的信息的記錄，或存儲器存取裝置，其可以訪問這樣的產品。
輸入和輸出裝置的各種結構形式可以用于在本發明的基于計算機的系統中輸入和輸出信息，例如，往返于用戶。輸出裝置的一種形式將具有與參考表達譜不同程度相似性的表達譜排序。這樣的呈現為熟練的技術人員提供了相似性的排序，并鑒定出測試表達譜中含有的相似性程度。
在以下實施例中描述本發明，其是為了進一步描述本發明而不是限制其范圍。
如下文的實施例中描述的，發現了預測腎臟異體移植物急性細胞排異的發生/發展(progression)的分子標記。數據表明以下用途，使用外周mRNA譜來監視和分層有纖維化和移植物失功風險的患者，避免異體移植物活檢的需要，并鑒定出可以受益于早期介入來預防慢性異體移植物失功的那些人。
在以下實施例中，使用了以下材料和方法：
實施例1：MiSEQ分析
1)常規分析(用于9基因面板，包括持家基因面板的帶條碼的探針集)
2)RNA樣品制備試劑盒v2
3)用于提取高質量總RNA的QIAGEN試劑盒
MiSEQ實驗
使用QIAGEN試劑盒提取總RNA。使用RNA樣品制備試劑盒v2通過以下的廠家方案產生序列文庫：簡要地，首先從總RNA純化含有polyA的mRNA并片段化。使用隨機六聚體引物和逆轉錄酶進行第一鏈cDNA合成，隨后是第二鏈cDNA合成。在將突出端轉化為cDNA的鈍末端的末端修復過程之后，多個索引銜接子(indexing adapters)添加到雙鏈cDNA的末端，利用特異于基因面板和持家基因的引物對進行PCR來富集目標。最后，索引化的文庫進行驗證，標準化并集中，用于在MiSEQ測序儀上測序。
MiSEQ數據處理
MiSEQ測序儀產生的未加工的RNAseq數據將使用以下過程處理：使用BWA1比對算法，優質的讀取結果首先與包括hg19人類基因組、外顯子、剪接接點的幾個人類參考數據庫，以及包括核糖體和線粒體RNA序列的污染數據庫比對。在濾除了映射到(mapped to)污染數據庫的讀取結果之后，具有與期望的擴增子(即，來自配對引物的PCR產物)區域最大2個堿基錯配而獨特比對的讀取結果作為相應基因的表達水平進行計數，在使用R統計學程序log2變換之后進一步進行樣品間的分位數標準化(quantile normalization)。
實施例2：Nanostring分析
1)常規的CodeSet(用于9基因面板的條碼化探針集，包括3個持家基因和Nanostring提供的陰性對照)。
2)Master試劑盒，包括nCounter Cartridge、nCounter Plate Pack和nCounter Prep Pack
3)用于提取高質量總RNA的QIAGEN試劑盒
Nanostring實驗：
通過以下的廠家方案使用QIAGEN試劑盒提取總RNA；使用主試劑盒在65℃的溶液中使條碼探針與總RNA退火。捕獲探針將捕獲被固定用于數據的目標。在雜交之后，將樣品轉移到nCounter Pre Station，探針/目標固定在nCouter Cartridge上，然后通過nCounter Digital Analyzer對探針計數。
mRNA轉錄組數據分析
來自Nanostring分析儀的未加工的計數數據使用以下過程處理，未加工的計數數據首先相對于持家基因的計數進行標準化，計數低于陰性對照計數的中值加3標準偏差的mRNA將被濾出。由于來自試劑批次的數據變異，來自不同試劑批次的每種mRNA的計數將通過乘以不同試劑批次上樣品的平均計數之比例的因數來校準。來自不同實驗分批的校準的計數將進一步通過ComBat程序包來調整。
實施例3：qPCR分析
1)引物容器(16個試管，12個基因，包括9基因面板和2個持家基因(ACTB和GAPDH)以及對照探針18S核糖體RNA，每個試管一個qPCR分析)。分析(assay)從LifeTech訂購。
2)Universal Master Mix II:用于qPCR反應的試劑
3)ARRAY 96-孔板6×16
4)Agilent AffinityScript QPCR cDNA合成試劑盒：用于最高效率地轉化RNA為cDNA，是為實時定量PCR(QPCR)應用完全優化的。
使用Allprep試劑盒(QIAGEN-ALLprep試劑盒，Valencia,CA USA)從異體移植物活檢樣品中提取總RNA。用寡聚dt引物(Agilent Inc.Santa Clara,CA)使用AffinityScript RT試劑盒合成cDNA。9基因集、2個持家基因(ACTB、GAPDH)和18S的TaqManq PCR分析購自ABI Life Technology(Grand Island,NY)。使用TAQMAN通用混合物對cDNA進行qPCR實驗，使用ABI7900HT系統監視和獲取PCR反應。樣品將測量三次。將產生預測基因集以及2個持家基因的周期時間(Cycle Times，CT)值。通過從每個基因的CT值中減去持家基因的平均CT值來計算每個基因的ΔCT值。
實施例4：對移植患者的分析性能
研究群體
利用基因表達譜研究了八十位成年人腎臟移植患者，來確定他們的活檢物上亞臨床急性排異的存在。受者主要是男性(80％)，平均年齡49.7歲，從19到75歲。受者種族是55％白人，22.5％非裔美國人，11.25％亞洲人，11.25％西班牙人。供體是40％活供體，60％死亡供體。供體平均年齡41.5歲，從歲3到75歲。百分之三十的患者接受抗-IL-2受體阻斷劑用于誘導，27.5％接受抗胸腺細胞球蛋白(Thymoglobulin)，27.5％沒有接受誘導，0.5％接受Campath-1H。所有患者接受潑尼松、普樂可復(prograf)和嗎替麥考酚酯。
方法
在移植后從80位腎臟移植物受者采集10cc外周血，保存在Paxgene試管中。血液保存在4℃冷柜中；如果不能立即進行分析，則分析可以在第二天進行。如果血液要保存更久，應當保存在-80℃。
如上文實施例1中描述的進行MiSEQ分析。
預測分析
然后將獲自MiSEQ分析的表達數據輸入伴隨試劑盒的計算機程序產品，用于監視接受了異體移植物的受試者的急性排異(AR)應答。這個計算機程序產品當加載于計算機上時，被配置以采用來自每一受試者的樣品的基因表達結果，來測定評分，并將這一ACR評分以用戶可讀形式提供給用戶。ACR評分基于從參考實驗得出的概率評分，從所述參考實驗中已經驗證了診斷性參考范圍。
ACR陰性：ACR概率評分低于0.16。
ACR陽性：ACR概率評分高于0.5。
結果在此處附上的表1和2中顯示。
以下結果是基于MiSEQ分析的9個基因中7個基因的定量。這7個基因是：ANXA5、TSC22D1、AP1M1、CLK1、EFTUD2、SENP6和SENP7。
如表1中所示，80名患者中，28人患者具有0.16以下的評分，18人具有0.5以上的評分。三十二名患者處于中間范圍，因而被分類為不確定的。
與常規診斷方法比較，具體的病理顯示，通過外周血分析被診斷為無ACR的28名患者(組1)中僅一人有活檢物上的急性排異的任何證據(表)。然而，這名患者患有BK腎病，其引起其他原因之外的活檢物上的炎癥。這一診斷的患者是過度免疫抑制的，具有與ACR不同的外周血譜。這個數據顯示，使用所要求權利的分析，BK炎癥可以在外周血上與ACR炎癥區分。18名ACR患者中的四人在活檢上沒有發現ACR；然而，這些患者中的2人接下來患上ACR，因而該分析正確地將他們鑒定為高風險的。
中間的32名患者(組2)中，發現11名患者有被懷疑的活檢物(n＝7)或ACR的活檢物(n＝4)。
診斷患有ACR的18名患者(組3)中，4人被診斷為沒有ACR，但這些患者中的2人在后來的時間點患上ACR。
利用基于這些結果的參考范圍，分析的敏感性和特異性分別是1和.875，NPV和PPV分別為1和0.78。
患者的管理
患者組1(ACR評分陰性)繼續標準的免疫抑制漸減方案，其中如果患者仍然服用，患者降低為潑尼松0.5mg，普樂可復目標水平是降低到5-7mg/dl和嗎替麥考酚酯。
患者組2(ACR不確定的)，方案將由治療醫師決定。可能的方案包括：
a.免疫抑制將不會進一步漸減，將不間斷監視患者，如果他們的測試變為陽性，將進行治療。
b.進行活檢來確認或排除ACR的存在。
患者組3(ACR評分陽性)，患者將接受短療程的高劑量類固醇，例如500mg潑尼松3天。在服完類固醇之后一周重復分析，來確定ACR譜現在是否正常。如果不正常，可確保活檢
實施例5：引物
17個基因的引物對如下：
本發明不能被限定于本文描述的具體實施方式的范圍中。實際上，除此處描述的之外本發明的各種修改根據上述的說明書和附圖對本領域技術人員而言是顯而易見的。這種修改也將落在附隨的權利要求的范圍之中。
進一步要理解的是，所有的數值是近似的，是為了描述而提供的。整個本申請中引用的專利、專利申請、出版物、產品說明書和方案為了所有的目的通過完全引用將其公開內容合并在本文中。
表1
SEQUENCE LISTING
<110> 西奈山伊坎醫學院(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)
<120> 通過預示性基因集的RNA測序分析來診斷亞臨床急性排斥的方法
<130> 27527-0135WO1
<150> US 62/017,784
<151> 2014-06-26
<160> 68
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸(synthetically generated oligonucleotides)
<400> 1
caatttagag caactactcc ttgctgt 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 2
tattcgaagt atacctgcct accttgc 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 3
atgaagctca agttgaacaa gatgctc 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 4
agaacttaaa tgggggacag atgaaga 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 5
gttcgagctc atgtcctacc gtctcaa 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 6
cctttgatat ggatcgagtc ggtgatc 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 7
ccacagccgc atcgagtaca tgatcaa 27
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 8
caaaagccag ttcaagcggc ggtcaa 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 9
gcatgtgatg atgtatgggg tataccg 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 10
gggcatttgg gcatattttc aatgatg 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 11
cctgaaatat gctggagtat ttgcaga 27
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 12
tgcagaagat gctgatggaa aagatg 26
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 13
caatgacaga agaagttgaa gatgaac 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 14
agaaacagtg gaaagaattt tcaggcg 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 15
ttctctttca aatagatttc aggcctc 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 16
tcaaccctca cattcaggaa taatttt 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 17
ggacctctac caaaacatat gatacag 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 18
attttcacca cgatcgatta gactggg 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 19
tctgactaca cagaggcgta taatccc 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 20
tgatgaacgc accttaataa atccaga 27
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 21
aattcatgat caaaacccgc cgtagg 26
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 22
gagcatcagc aaattcttcg atgatcc 27
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 23
aaccataacc gaaccccgag gcaatga 27
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 24
gacccttgaa gttcaatacc acatctg 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 25
tgggaaaact tactaggtag tgaacct 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 26
aaatatcgac atgcctgaac tctttcc 27
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 27
agtaacccaa atcagactag tgcatca 27
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 28
tctttgatga ttggaatgat ccctcat 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 29
ccaatttgat gcaccttttg tttttgc 27
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 30
gcgacctcat ttacattaca gctaaga 27
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 31
tggagtaaca agaccaatga agaagatg 28
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 32
aactccaccg tgcagtggga agaagt 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 33
gaaaaagaca aggccctgga acagaa 26
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 34
aagattccag aagagaaaga caaagcc 27
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 35
ctgaaggcag agaagcgaaa gctgat 26
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 36
caaggtaggg aaaaagcacc ttaaaga 27
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 37
cctctgaaat tataccttca gaaattcag 29
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 38
ctatgaaagg agaaaaggga attggtgg 28
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 39
tgttatggtt tacacaacat catatcaac 29
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 40
tctggtgttc agcaaattca gttttca 27
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 41
ggcatttaaa gcctactatc tgtaaac 27
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 42
tatcctactt atggactcac tccgagg 27
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 43
tgagaaggat tttatttttg tacccct 27
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 44
cactggtttt tggctgttgt ttgtttc 27
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 45
gacactgtct ttgagtgcag aggatt 26
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 46
gtaccgagtc gaatatgtca gtaccaa 27
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 47
attagaacac tctgtattaa gccagca 27
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 48
tcattttcct tgaactacac aatcctg 27
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 49
ttattccatt tgtcttagga aggccca 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 50
ttacatgtga ctagcaactt tctccac 27
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 51
gtcaaagctt aaaaatcagg tgtgtcc 27
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 52
gataagcctg cagtcttaac cagacct 27
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 53
actgtgcctc tttcttctca aacaatg 27
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 54
tgagagtgac aaaatggtga caggtag 27
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 55
tcacccattt cattgctcgc tgcgaaa 27
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 56
gtgagactga catatgccat tatctct 27
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 57
gttctgtcta tccaccagct gattgag 27
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 58
atgcctgttt ctgcattgac aatgagg 27
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 59
aatacctggt ccaaacaaga aaaacaa 27
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 60
gacaagcaaa actaaagaac tgcagtc 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 61
acctagtcat tcaaagtaga aacccac 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 62
tgctttcagc ttttatcctg agagtgg 27
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 63
cacatgcaag gaagtgaaca tcaaatt 27
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 64
atctagtgaa gaattcaagg aagacac 27
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 65
agcctttagt attttctcaa cccctac 27
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 66
tcacactgaa gagaaatccc acagatg 27
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 67
cagtcctcaa ctcctagtaa acataat 27
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生的寡核苷酸
<400> 68
aaaccataca actgtgaaga atgtggc 27