檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法、試劑盒及應用的制作方法

專利名稱：檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法、試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法、試劑盒及其在培育 具有高總產仔數性狀的豬以及豬的育種中的應用。
背景技術：
繁殖力是影響養豬業的一個重要的經濟性狀，繁殖力的提高無疑將給養豬業生產 帶來巨大的經濟效益，但是如何提高豬繁殖力的育種效率一直是備受關注的問題。豬的育 種主要分為常規育種和分子育種兩方面，在傳統育種中，選擇的依據通常是表現型而非基 因型，這是因為人們無法直接知道個體的基因型，只能從表現型加以推斷。由于數量性狀的 表現型與基因型之間缺乏明確的對應關系，使得選擇效率不高。要提高選擇的效率，最理想 的方法應是能夠直接對基因型進行選擇。分子標記的基因型是可以識別的，為實現對基因 型的直接選擇提供了可能，這也是分子標記在育種中應用的最主要方面。目前，利用目標性 狀與標記基因型之間的關聯性進行標記輔助選擇是研究的重點之一。FUTl基因定位于6號染色體6qll，然而在這個染色體區域附近已經被發現與豬 產仔性狀相關(Yasue H, et al. Analysis of allele segregation distortion in a swine reource family. Animal Biotechnology, 1999, 10: 147-152)。FUTl 作為 F18 介導的粘附呈敏感性或抗性遺傳性狀的一個候選基因，并且與仔豬水腫病、腹瀉等疾病相 關，對動物健康的影響比能夠觀察到的要多好幾倍(Meijerink E，et al. Two alpha (1,2) fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6qll are closely linked to the blood group inhibitor (S) and Escherichia coli F18 receptor (ECF18R) loci. Mammalian Genome, 1997，8:736-741)。由于動物健康很直接的影響繁殖性能，FUTl基 因已被視為是豬產仔數的一個候選基因。Buske等等對商品豬的研究表明雜合子AB基 因型的母豬在高產群中的比例高，而BB基因型的母豬在低產群中的比例高，說明AB基因 型有利于產仔數(Buske B, et al. Analysis of association of GPX5, FUTl and ESR2 genotypes with litter size in a commercial pig cross population. Archives of Animal Breeding, 2006, 49:259-268)。Horak 等在 Prestice 花斑豬中研究發現，FUTIg/ FUTIg基因型的母豬在1-6胎總產仔數上明顯超過FUT1a/FUT1a基因型的母豬(Horak P, et al. The FUTl and ESR genes—their variability and associations with reproduction in Prestice Black-Pied sows. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2005, 122:210-213)。張引紅等對中外26個品種的豬群FUTl基因多態進行檢測，結果表明，Hin6 I位 點上，大白豬、長白豬和杜洛克等3個外來豬種均存在多態，且以GG型和AG型居多；山西黑 豬、太原花豬和馬身豬3個本地豬種的所有檢測樣品都表現為GG型。用方差分析FUTl基 因型、品種和胎次與產仔性狀之間的關系，基因型和品種對豬的總產仔數的影響顯著，3種 基因型豬產仔數均值多少依次為AA>AG>GG，胎次對總產仔數影響不顯著；而基因型、品種和胎次對產活仔數影響均不顯著。孫鵬翔等采用PCR-RFLP方法對蘇太豬FUTl基因多態性 進行分析。結果表明蘇太豬FUTl基因開放閱讀框307位點經ZZi/^ I酶切后，產生GG型 和AG型，不存在抗性純合子AA型，其2種基因型與蘇太豬生產性能間的相關性結果表明AG 型個體平均生產性能均高于GG型個體，且AG型個體的斷奶窩重，胎總產仔數顯著高于GG 型個體(P<0. 05)，對一些生產性狀而言，AG型是有利基因型。羅仍卓么等發現，在北京黑豬 經產母豬中，FUTl基因AA基因型個體比GG型個體的TNB明顯高1. 11頭(P<0. 05)，在TNB 和NBA大小總趨勢是AA>AG>GG (羅仍卓么.北京黑豬10個基因的多態性與產仔性狀的關 聯分析.2008，陜西楊陵西北農林科技大學，碩士學位論文)。綜上所述，FUTl基因已經成為一個可影響母豬總產仔數的主效候選基因。

發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法、試劑 盒及其在培育具有高總產仔數性狀的豬以及豬的育種中的應用。本發明提供的檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法為采用PCR—SSCP 法，PCR擴增包括GenBank Accession Number AX752829的自5，末端第315位脫氧核糖核 苷酸在內的片段，凝膠電泳檢測PCR擴增產物，根據電泳結果確定待測母豬的基因型若電 泳顯示為兩條帶，待測母豬的基因型為GG或AA，是純合體；若電泳顯示為三條帶，待測母豬 的基因型為GA，是雜合體。前述PCR擴增以待測母豬的基因組DNA為模板；所用的引物對為序列1 (5’ 一 ATCTCCCGTGGCCATATTCT— 3，)和序列 2 (5，一ATGGCAGGCTGGATGAAG — 3，)組成的引物對。 當采用該引物對進行PCR擴增時，根據待測母豬的基因組DNA的不同，擴增得到的DNA片段 為序列3所示的核苷酸序列或序列4所示的核苷酸序列。通過檢測母豬總產仔數相關突變等位基因進行待測母豬基因型判型的方法為以 序列 5，一ATCTCCCGTGGCCATATTCT— 3，和序列 5，一ATGGCAGGCTGGATGAAG— 3，組成的引 物對為引物，對基因型為GG、AA、GA的三種豬DNA分別開展PCR擴增，擴增產物分別用瓊脂 糖凝膠回收試劑盒回收純化，純化后的PCR產物采用SSCP凝膠電泳方法進行凝膠電泳，并 將電泳后的條帶在試劑盒中制作為標準品S1為GG基因型標準品，S2為AA基因型標準品， S3為GA基因型標準品；判型待測母豬的基因型時，采用PCR—SSCP法，在同一聚丙烯酰胺 凝膠中，同時電泳三個標準品及擴增待測母豬所得的PCR產物，電泳后條帶與Sl相同者為 GG基因型，條帶與S2相同者為AA基因型，條帶與S3相同者為GA基因型。本發明還提供一種檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的試劑盒，含有序列1 (5，一ATCTCCCGTGGCCATATTCT— 3，)和序列 2 (5，一ATGGCAGGCTGGATGAAG— 3，)組成的引 物對以及Si、S2、S3三個標準品；Sl為GG基因型標準品，S2為AA基因型標準品，S3為GA 基因型標準品。前述試劑盒可用于制備輔助檢測母豬的總產仔數性狀的試劑盒。以上所述方法、所述試劑盒均可用于培育具有高總產仔數性狀的豬，從而應用于 豬的育種。本發明所述待測母豬具體可為北京黑豬。豬GenBank Accession Number AX752829的自5，末端第315位脫氧核糖核苷酸存在一個脫氧核糖核苷酸的差異(G/A)。實驗表明，AA基因型的母豬的產仔數高于GG基因型 的母豬的產仔數。經產階段，AA純合基因型群體比GG純合基因型群體總產仔數高約1. 11 頭，所以該突變等位基因可作為豬總產仔數性狀分子育種標記。本發明采用PCR-SSCP 方法檢測豬 GenBank Accession Number AX752829 的自 5， 末端第315位脫氧核糖核苷酸，基因型判型非常準確，檢測費用低廉，具有很高的育種實踐 應用價值。用本發明所述方法對豬總產仔數性狀進行選擇，可使豬群經產階段總產仔數提 高約1. 11頭，從而獲得可觀的經濟效益。應用本發明所提供的方法對豬進行育種，可對待選豬進行早期篩選，有效地緩解 了實際生產中選優良種豬時間長的問題，降低了育種花費，有效增加了實際生產中的豬總 產仔數，提高了經濟效益。本發明所述的檢測方法操作簡單、費用低廉、準確度高，并可實現 自動化的直接檢測。本發明提供的方法和試劑盒將在豬的育種工作中發揮巨大作用。


圖 1 是包含豬 GenBank Accession Number AX752829 的自 5，末端第 315 位脫氧 核糖核苷酸的PCR擴增片段及三個標準品的SSCP電泳圖。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試 驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的引物均由上 海英駿生物技術有限公司合成。實施例1 豬的育種中優良種豬的選擇
一、PCR-SSCP檢測方法的建立及多態性位點確定 1、PCR擴增
根據豬GenBank Accession Number AX752829序列設計引物，引物如下 U (上游引物):5，-ATCTCCCGTGGCCATATTCT-3，(序列 1)； D (下游引物):5，- ATGGCAGGCTGGATGAAG-3，(序列 2)。選擇北京黑豬為實驗材料。以北京黑豬的基因組DNA為模板，使用引物U和D進 行PCR擴增。擴增體系為基因組DNA 200ng, 10父？0 擴增緩沖液2.5“1，(1^138 5mM，上、下游 引物各50ng，Taq DNA聚合酶0. 75U，Mg2 + 2. 5mmol/L，用ddH20補充反應體系至25 μ 1。PCR反應條件為95°C變性5min ；然后95°C變性20s, 52. 4°C退火30s，72°C延伸 30s，共35個循環；最后72°C延伸IOmin0PCR產物經瓊脂糖凝膠檢測后于-20°C保存。2、SSCP 分析
取步驟1的PCR產物各1. 5ul，分別與8. 5ul上樣緩沖液(98%甲酰胺，0. 09%溴酚藍， 0. 09% 二甲苯氰，2%甘油，0. lmol/L EDTA)混合，98°C變性10分鐘，迅速置冰上冷卻10分 鐘，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(12小時，電壓8V/cm)，銀染顯色，根據染色結果分析基因 型。結果如圖1所示，上述PCR產物具有三種帶型，表明擴增序列存在多態性位點，純合基 因型豬個體經擴增產生2種帶型(AA型、GG型)，分別產生兩條帶，雜合基因型豬個體經擴增產生三條帶(GAS)。3、克隆測序及序列分析
分別將兩種純合基因型個體PCR產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公 司)回收純化，回收的DNA片段連接載體pGEM-T(Pr0mega公司)后，將連接產物轉化大腸桿 菌DH5 α感受態細胞(明日百傲(北京)科技有限公司)，根據載體上的羧卞青霉素抗性標記 篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的Τ7和SP6啟動子序 列為引物對其進行核苷酸序列測定(北京優博奧生物技術有限公司)。測序結果表明產物 1為序列3，產物2為序列4 ；序列3和序列4的長度均為201bp，只存在一個脫氧核糖核苷 酸的差異(G/A)，該多態位點(命名為G315A)位于序列表中自5’端第161位脫氧核糖核苷 酸，即GenBank Accession Number AX752829的自5，末端第315位脫氧核糖核苷酸。如果 待測母豬的G315A為G時，其純合體的基因型為GG ；如果待測母豬的G315A為A時，其純合 體的基因型為AA ；它們的雜合體基因型為GA。4、三種基因型標準品設計
取步驟2中三種基因型PCR產物(GG基因型為S1，AA基因型為S2，GA基因型為S3)各 30ul，分別用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司洄收純化，將純化后的PCR產 物按照上述SSCP凝膠電泳方法進行凝膠電泳。從結果圖1中可以看出，Si、S2、S3電泳后 條帶清晰、無雜帶、判型清楚，在本試劑盒中可制作為標準品S1為GG基因型標準品，S2為 AA基因型標準品，S3為GA基因型標準品。在同一聚丙烯酰胺凝膠中，同時電泳三個標準品 以及本試劑盒所提供引物擴增待檢測豬所得的PCR產物，如圖1，可清晰、準確、快捷地判別 所檢豬的基因型。二、G315A多態位點與豬總產仔數的相關性分析
為確定G315A多態位點與豬總產仔數是否相關，以314頭北京黑豬母豬為實驗材料，進 行如下試驗提取基因組進行PCR-SSCP分析，方法同步驟一；同時記錄胎次、總產仔數等表 型，對G315A位點與總產仔數開展最小二乘關聯分析。結果見下表1。
表1產伃性狀最小二乘均值及ZOTI基因
G315A.多態位點與總產伃數性狀的關聯分析 注同列上標含有相同字母表示差異不顯著(P>0. 05)。結果表明在經產胎次中，AA基因型個體分別比GG基因型個體在總產仔數方面多 1. 11頭；G315A位點與經產階段總產仔數顯著關聯(P<0. 05)。所以，在實際的豬育種中，最好選擇AA基因型的豬進行育種。以上所用北京黑豬均來自于北京世新華盛牧業科技有限公司。序列表
序列 1 :ATCTCCCGTGGCCATATTCT 序列 2 :ATGGCAGGCTGGATGAAG 序列3 (AA基因型序列)
ATCTCCCGTGGCCATATTCTGCCTGGCGGGCACGCCGGTACACCCCAACGCCTCCGATTCCTGTCCCAAGCATCCTGCCTCCTTTTCCGGGACCTGGACTATTTACCCGGATGGCCGGTTTGGGAACCAGATGGGACAGTATGCCACGC TGCTGGCCCTGACGCAGCTCAACGGCCGCCAGGCCTTCATCCAGCCTGCCAT 序列4 (GG基因型序列)
ATCTCCCGTGGCCATATTCTGCCTGGCGGGCACGCCGGTACACCCCAACGCCTCCGATTCCTGTCCCAAGCA TCCTGCCTCCTTTTCCGGGACCTGGACTATTTACCCGGATGGCCGGTTTGGGAACCAGATGGGACAGTATGCCACGC TGCTGGCCCTGGCGCAGCTCAACGGCCGCCAGGCCTTCATCCAGCCTGCCAT
權利要求
一種檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法，其特征在于采用PCR—SSCP法，PCR擴增包括GenBank Accession Number AX752829的自5’末端第315位脫氧核糖核苷酸在內的片段，凝膠電泳檢測PCR擴增產物，根據電泳結果確定待測母豬的基因型若電泳顯示為兩條帶，待測母豬的基因型為GG或AA，是純合體；若電泳顯示為三條帶，待測母豬的基因型為GA，是雜合體。
2.根據權利要求1所述檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法，其特征在 于PCR擴增所用的引物對為序列5，一ATCTCCCGTGGCCATATTCT— 3，和序列5，一 ATGGCAGGCTGGATGAAG— 3，組成的弓丨物對。
3.根據權利要求1所述檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法，其特征在于以 待測母豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增。
4.通過檢測母豬總產仔數相關突變等位基因進行待測母豬基因型判型的方法，其特征 在于以序列 5，一ATCTCCCGTGGCCATATTCT— 3，和序列 5，一ATGGCAGGCTGGATGAAG—3，組 成的引物對為引物，對基因型為GG、AA、GA的三種豬DNA分別開展PCR擴增，擴增產物分別 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，純化后的PCR產物采用SSCP凝膠電泳方法進行凝膠電 泳，并將電泳后的條帶在試劑盒中制作為標準品S1為GG基因型標準品，S2為AA基因型標 準品，S3為GA基因型標準品；判型待測母豬的基因型時，采用PCR—SSCP法，在同一聚丙烯 酰胺凝膠中，同時電泳三個標準品及擴增待測母豬所得的PCR產物，電泳后條帶與Sl相同 者為GG基因型，條帶與S2相同者為AA基因型，條帶與S3相同者為GA基因型。
5.一種檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的試劑盒，其特征在于含有序列5’ -ATCTCCCGTGGCCATATTCT— 3，和序列 5，一ATGGCAGGCTGGATGAAG— 3，組成的引物對以及 Si、 S2、S3三個標準品；Sl為GG基因型標準品，S2為AA基因型標準品，S3為GA基因型標準品。
6.如權利要求5所述的試劑盒在制備輔助檢測母豬的總產仔數性狀的試劑盒中的應用。
7.如權利要求1-4中任一項所述方法在培育具有高總產仔數性狀的豬以及豬的育種 中的應用。
8.如權利要求5或6所述試劑盒在培育具有高總產仔數性狀的豬以及豬的育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測母豬總產仔數相關突變等位基因的方法、試劑盒及應用；所述方法即采用PCR—SSCP法，PCR擴增包括GenBankAccessionNumberAX752829的自5′末端第315位脫氧核糖核苷酸在內的片段，凝膠電泳檢測PCR擴增產物，根據電泳結果確定待測母豬的基因型若電泳顯示為兩條帶，待測母豬的基因型為GG或AA，是純合體；若電泳顯示為三條帶，待測母豬的基因型為GA，是雜合體。本發明檢測方法操作簡單、費用低廉、準確度高，可實現自動化的直接檢測，具有很高的育種實踐應用價值。應用本發明方法及試劑盒對豬進行育種，可對待選豬進行早期篩選，有效地緩解了實際生產中選優良種豬時間長的問題，降低了育種花費，增加了豬總產仔數，提高了經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK101892318SQ201010246679
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者張龍超, 王立賢, 王紅衛, 石國華, 謝蜀楊 申請人:北京世新華盛牧業科技有限公司