用于檢測第一和第二表位的空間接近性的方法與流程

本發明涉及用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法。本發明還涉及一種用于對患病的對象分層的方法，所述方法用于評估治療的適合性和/或用于對象的疾病的結果預后和/或用于患病的對象針對治療的治療抗性的預測和/或檢測。此外，本發明涉及新的試劑盒及其相應的用途。

技術背景

鄰近連接測定法（PLA）是能夠報告兩種蛋白的共定位的方法（參見Weibrecht I.等人，"Proximity ligation assays: A recent addition to the proteomics toolbox", Expert Review of Proteomics, 第7卷，第3期，2010，第401-409頁)）。該方法使用各自用單鏈DNA寡核苷酸標記的兩種抗體。需要這兩種寡核苷酸以由兩個第二DNA寡核苷酸形成閉合環，所述第二DNA寡核苷酸在抗體結合其表位后添加到樣品中。一旦成環，則使用滾環擴增（RCA）來創建數百個圓形模板的拷貝。最后，用熒光團標記的互補探針與RCA產物退火，在兩種蛋白共定位的位置產生亮點。

標準PLA方案（即使用標記的一抗）需要約6.5小時來完成。發生RCA的最長步驟需要約1小時40分鐘并需要酶。除了這種反應需要長時間，酶的使用使得整個測定難以整合到裝置中，這主要是因為敏感性酶的穩定儲存通常是一個問題。因此，期望具有用于通過在患者的組織和/或細胞（細胞團塊）和/或體液上原位染色來確定兩種蛋白的空間接近性或共定位的技術，所述技術不需要使用酶或至少不需要復雜的酶反應，諸如序列擴增等。

WO 2005/059509 A3公開了可用于使用一組共適體構建體來鑒定和定量任何多肽或大分子復合物的組合物和方法。構建結合大分子構建體多肽的獨特表位的適體構建體。那些適體構建體含有表位結合位點、共適體結合位點和可檢測標記物。在同源多肽、分析物-多肽復合物或其它大分子復合物的存在下，共適體彼此締合以產生可檢測的信號。共適體構建體可以通過接頭連接以產生二價適體構建體。

WO 2012/152942 A1涉及用于檢測樣品中的分析物的基于鄰近探針的檢測測定法，并且具體涉及包括使用至少一組至少第一和第二鄰近探針的方法，所述探針各自包含分析物結合結構域和核酸結構域并且可以同時直接或間接結合至分析物，其中至少一個所述鄰近探針的核酸結構域包含發夾結構，所述發卡結構可以通過切割核酸結構域而解折疊以產生與所述樣品中的另一核酸分子互補的至少一個可連接的游離末端或區域，其中當探針結合所述分析物時，解折疊所述發夾結構允許所述至少第一和第二鄰位探針的核酸結構域直接或間接相互作用。

WO 2010/006291 A1提供了測定單細胞中多種蛋白的活化狀態的方法。該方法允許基于活化狀態、表達標志物和其他標準快速檢測復雜細胞群體中的異質性，以及鑒定在細胞群體內表現出相關激活變化的細胞亞群。此外，這種方法允許細胞活性或性質的相關性。另外，細胞激活調節劑的使用允許表征途徑和細胞群體。可以使用該方法分析的幾種示例性疾病包括AML、MDS和MPN。

發明概述

本發明的一個目的是提供一種用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法，其中所述方法解決或至少減少PLA的上述問題。

本發明提供了用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法，其中所述方法包括：

-將具有與其綴合的第一寡核苷酸的第一結合構件結合到所述第一表位，

-將具有與其綴合的第二寡核苷酸的第二結合構件結合到所述第二表位，和

-確定在與第一寡核苷酸和第二寡核苷酸相締合的供體熒光團和受體熒光團之間是否存在熒光共振能量轉移（FRET）效應，其中FRET效應的存在指示第一和第二寡核苷酸的空間接近性以及，因此第一和第二表位的空間接近性，

其中所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸至少部分互補，

其中所述第一寡核苷酸最初提供有第一分離的屏蔽元件和/或所述第二寡核苷酸最初提供有用于防止所述第一和第二寡核苷酸過早雜交的第二分離的屏蔽元件。

由于具有與其連接的第一寡核苷酸的第一結合構件結合到第一表位，并且具有與其連接的第二寡核苷酸的第二結合構件結合到第二表位，通過確定供體熒光團和受體熒光團之間是否存在FRET效應，其中FRET效應的存在指示第一和第二寡核苷酸的空間接近性，可以在對象的樣品中檢測蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性。與標準PLA方案相比，本發明的實施方案可以在更短的時間內完成。此外，本發明的實施方案不需要使用酶，或者至少不需要復雜的酶反應，諸如序列擴增等。

由于第一寡核苷酸與第二寡核苷酸至少部分互補，因此當在空間上接近時，第一和第二寡核苷酸將雜交，由此供體熒光團和受體熒光團可以彼此形成合適的距離，諸如允許以更高的確定性在供體熒光團和受體熒光團之間發生FRET效應。互補區段的長度應優選大于10個核苷酸。此外，寡核苷酸中可存在多個互補區段，并且其間具有非互補區段。后者對于第一和第二寡核苷酸可以具有不同的長度。

由于第一寡核苷酸最初提供有第一分離的屏蔽元件和/或第二寡核苷酸最初提供有用于防止第一和第二寡核苷酸過早雜交的第二分離屏蔽元件，因此可以防止第一和第二寡核苷酸在第一和第二結合構件結合到第一和第二表位之前已經雜交。隨之，可以減少或避免檢測誤差，所述檢測誤差可以例如，當第一和第二寡核苷酸在結合——允許FRET效應在供體熒光團和受體熒光團之間發生——前雜交，并且然后第一和第二結合構件之一將結合單個蛋白的相應表位（或不顯示另一表位的蛋白）時導致。此外，由于屏蔽元件是分離的屏蔽元件，即，在它/它們被提供給相應的寡核苷酸之前，它/它們是與相應寡核苷酸分開的分子的形式，其中，優選地，它/它們選自與相應的寡核苷酸至少部分互補并與其雜交的分子，屏蔽功能性（以及如下進一步描述的去除屏蔽的功能性）可以具有高可靠性。

熒光共振能量轉移（FRET）（也以德國科學家TheodorF?rster命名為F?rster共振能量轉移）是描述兩個熒光團（即，可以在光激發下重新發光的熒光化合物）之間的能量轉移的機制。最初處于其電子激發態的供體熒光團可通過非輻射偶極-偶極耦合將能量轉移到受體熒光團。這種能量轉移的效率與供體和受體熒光團之間的距離的六次方成反比，使得FRET對小距離極其敏感。為了實現FRET效應，供體熒光團的一部分發射光譜必須與受體熒光團的激發光譜重疊，如圖1所示，圖1示意性和示例性地顯示了Cy3和Cy5的光譜。從圖中可以看出，Cy3的激發光譜（左側的實線Ex）在548nm的波長處具有激發最大值，并且其發射光譜（左側的點劃線Em）偏移到更高的波長，并且在562nm的波長具有發射最大值。相反，Cy5的激發光譜（右側的實線Ex）在646nm的波長處具有激發最大值，并且其發射光譜（右側的點劃線Em）偏移到更高的波長，并且在波長664nm具有發射最大值。在Cy3的發射光譜和Cy5的激發光譜下的陰影區域表示能夠發生FRET效應所需的重疊區域。

分子生物學中正使用FRET（有時使用遺傳編碼的熒光蛋白）來研究兩個實體之間的空間接近性，例如，來研究核小體呼吸（參見Koopmans WJ等人，“Engineering mononucleosomes for single-pair FRET experiments”Methods in Molecular Biology，第739卷，2011，第291至303頁）。事實上，FRET是在1至10nm尺度上研究（生物學）相互作用的優選方法。常見的FRET供體-受體熒光團對包括：熒光素異硫氰酸酯（FITC）-四甲基羅丹明（TRITC），Cy3-Cy5，增強型綠色熒光蛋白（EGFP）-Cy3，青色熒光蛋白（CFP）-黃色熒光蛋白（YFP）和EGFP-YFP。

可以通過以空間分辨方式的光譜分析熒光發射來確定FRET效應的存在。選擇供體熒光團和受體熒光團的染料，使得可以在不存在FRET效應的情況下激發供體熒光團而不激發受體熒光團。通過激發供體熒光團并測量受體熒光團的熒光發射，受體熒光團發射通道中的可檢測信號指示FRET效應的存在。已知FRET效率與分子距離成比例，如下式所示：

其中E表示FRET效率，r表示分子距離，并且表示F?rster半徑，即取決于供體熒光團和受體熒光團的光譜重疊的參數。通常，將其確定為供體熒光團和受體熒光團的發射強度之比—分子越近，觀察到來自供體熒光團的發射越少，并且來自受體熒光團的發射越多。

為了檢測組織或細胞學上的蛋白相互作用，可以在供體熒光團的激發（吸收）帶中的激發和受體熒光團的發射帶中的檢測中獲取熒光圖像。對于FRET效率的檢查，這可以與在受體熒光團的激發（吸收）帶中用激發獲得的圖像進行比較。

對象的樣品可以是提取的樣品，即，從對象提取的樣品。本文所用的術語“對象”是指任何生物。在一些實施方案中，所述對象是植物。在一些實施方案中，所述對象是動物，優選哺乳動物。在某些實施方案中，術語“對象”是指人，優選患者。

樣品的實例包括但不限于對象的組織、細胞、血液和/或體液。

在一個實施方案中，第一和第二表位是兩個但是相同的表位。在另一個實施方案中，第一和第二表位彼此不同。

第一和第二結合構件可以是第一和第二抗體，優選第一和第二單克隆抗體。但是，可選地，它們也可以是例如第一和第二抗體片段，諸如駱駝抗體、適體或寡肽。更一般地，第一和第二結合構件可以是能夠分別結合第一和第二表位，并且第一和第二寡核苷酸可以綴合到其上的任何種類的元件或結構。在一個實施方案中，第一和第二結合構件是相同的。在另一個實施方案中，第一和第二結合構件彼此不同。

第一和第二寡核苷酸的合適長度為20至1000個堿基對，優選30至600個堿基對。

在一個實施方案中，第一和第二寡核苷酸是相同的。在另一個實施方案中，第一和第二寡核苷酸彼此不同。

注意，雖然第一和第二結合構件的結合在兩個步驟中限定，但這并不意味著這兩個步驟不能以不同的順序或優選基本上同時進行。

在確定供體熒光團和受體熒光團之間是否存在FRET效應之前，供體熒光團和受體熒光團已與第一寡核苷酸和第二寡核苷酸結合。

在一些實施方案中，熒光團可以連接到寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以用熒光團預標記，即，寡核苷酸在結合構件結合之前已經用熒光團標記，優選在將具有與其綴合的寡核苷酸的結合構件添加到對象之前。在一個實施方案中，第一寡核苷酸用供體熒光團預標記和/或第二寡核苷酸用受體熒光團預標記。另外或可選地，所述方法還包括在結合第一結合構件后，將供體熒光團連接到第一寡核苷酸上，和/或在結合第二結合構件后，將受體熒光團連接到第二寡核苷酸上。

由于第一寡核苷酸用供體熒光團預標記和/或由于第二寡核苷酸用受體熒光團預標記，和/或由于該方法還包括在結合第一結合構件之后，將供體熒光團連接到第一寡核苷酸，和/或在第二結合構件結合之后，將受體熒光團連接到第二寡核苷酸，供體熒光團和受體熒光團可以彼此進入合適的距離，諸如以允許在供體熒光團和受體熒光團之間發生FRET效應。

應注意，盡管上面在兩個步驟中限定了在第一和第二結合構件結合之后將供體熒光團和受體熒光團連接到第一和第二寡核苷酸上，但這并不意味著這兩個步驟不能以不同的順序或優選基本上同時進行。

這允許在第一和第二結合構件結合到第一和第二表位之前防止第一和第二寡核苷酸已經雜交。隨之，可以減少或避免檢測誤差，所述檢測誤差可以例如，當第一和第二寡核苷酸在結合——允許FRET效應在供體熒光團和受體熒光團之間發生——前雜交，并且然后第一和第二結合構件之一將結合單個蛋白（或不顯示另一表位的蛋白）的相應表位時導致。

優選地，該方法還包括：

-在結合所述第一結合構件之后，從所述第一寡核苷酸去除所述第一分離的屏蔽元件，和/或

-在結合所述第二結合構件之后，從所述第二寡核苷酸去除所述第二分離的屏蔽元件。

應注意，盡管上面在兩個步驟中限定了在第一和第二結合構件的結合之后從第一和第二寡核苷酸去除第一和/或第二分離的屏蔽元件，但是這并不意味著這兩個步驟不能以不同的順序或優選基本上同時進行。特別是，優選僅在第一和第二結合構件結合到它們各自的表位之后去除第一和/或第二分離的屏蔽元件。

第一分離的屏蔽元件優選包含與第一寡核苷酸至少部分互補并與其雜交的第一DNA或RNA鏈，和/或第二分離的屏蔽元件優選包含與第二寡核苷酸至少部分互補并與其雜交的第二DNA或RNA鏈。

優選地，去除第一DNA或RNA鏈和/或第二DNA或RNA鏈包括熔化第一寡核苷酸和第一DNA或RNA鏈的雜交和/或第二寡核苷酸和第二DNA或RNA鏈的雜交。

例如，在一個實例中，適當地增加樣品的溫度以實現雜交所需的熔化。在另一個實例中，改變樣品的溶劑以進行熔化。在熔化之后，優選地，在合適的另外的洗滌步驟中洗去未標記的第一和第二DNA鏈，導致基本上只有具有與其連接的第一和第二寡核苷酸的特異性結合的第一和第二結合構件保留在樣品中。

在優選的變體中，第一DNA或RNA鏈是第一RNA鏈，和/或第二DNA或RNA鏈是第二RNA鏈，其中去除第一RNA鏈和/或第二RNA鏈包括使用酶。

酶可以是例如RNA酶H，其消化RNA。該變體具有整個過程變得等溫的優點；但另一方面，它需要使用酶。

在另一個實施方案中，所述方法優選包括：

-在結合第一結合構件之后，提供用供體熒光團預標記的第三寡核苷酸，其中第三寡核苷酸與第一寡核苷酸至少部分互補，并且供體熒光團與第一寡核苷酸的連接包括與第三寡核苷酸雜交，和/或

-在結合第二結合構件之后，提供用受體熒光團預標記的第四寡核苷酸，其中第四寡核苷酸與第二寡核苷酸至少部分互補，并且受體熒光團與第二寡核苷酸的連接包括與第四寡核苷酸雜交。

這里，優選第一和第二寡核苷酸部分互補以實現所需的空間接近性。然后第三和第四寡核苷酸優選在第一和第二寡核苷酸的相應互補區段中間與第一和第二寡核苷酸雜交。

應注意，盡管上面在兩個步驟中限定了在第一和第二結合構件結合之后提供用供體熒光團和受體熒光團預標記的第三和第四寡核苷酸，但這并不意味著這兩個步驟不能以不同的順序或優選基本上同時進行。

該實施方案的優點是用供體熒光團和受體熒光團預標記的寡核苷酸可以與其余的檢測元件解耦，這可以允許熒光團的更簡單的測試和轉換（例如，在與干擾熒光團或高度自發熒光樣品多路復用的情況下）。此外，其可以允許標準化檢測測試的產生，特別是當使用二次免疫測定并且針對例如小鼠和大鼠抗體結構域設計測試時。

在進一步的實施方案中，所述第一寡核苷酸用供體熒光團預標記，或第二寡核苷酸用受體熒光團預標記，其中所述方法包括：

-在結合第一和??第二結合構件之后，添加受體熒光團或供體熒光團，其嵌入到通過第一和第二寡核苷酸的雜交形成的雙鏈中。

這里，僅在第一和第二結合構件結合后加入的供體熒光團、受體熒光團分別基于嵌入染料，例如，DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）或YOYO，其是噁唑黃的四價陽離子同二聚體。因為嵌入染料僅在實際嵌入雙鏈DNA中時才發熒光，所以可以有利地確保FRET效應僅在所需位置產生。

本發明還提供了用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法，其中所述方法包括：

-將具有與其綴合的第一寡核苷酸的第一結合構件結合到所述第一表位，

-將具有與其綴合的第二寡核苷酸的第二結合構件結合到第二表位，和

-確定在與第一寡核苷酸和第二寡核苷酸相締合的供體熒光團和受體熒光團之間是否存在熒光共振能量轉移（FRET）效應，其中FRET效應的存在指示第一和第二寡核苷酸的空間接近性以及，因此，第一和第二表位的空間接近性，其中所述方法包括：

-在結合第一和第二結合構件之后，提供其中PI電子沿著分子離域的聚合物，其中所述聚合物能夠結合第一和第二寡核苷酸，并且能夠從供體熒光團轉移能量到受體熒光團，或作為供體熒光團和/或受體熒光團的受體和/或供體(參見Demchenko A.P., "Nanoparticles and nanocomposites for fluorescence sensing and imaging", Methods and Applications in Fluorescence, 第1卷，第2期，2013)。

因為能量轉移借助第三元件，即聚合物實現，所以第一和第二寡核苷酸不必至少部分互補。這具有的優點是，如果第一和第二寡核苷酸基本上完全不互補，則不必須提供第一和第二寡核苷酸的屏蔽，這可以導致更簡單的過程，因為在這種情況下，還可以避免去除屏蔽的步驟。

優選地，為了檢測蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性，選擇第一和第二結合構件，使得第一和第二表位在蛋白復合物的第一和第二蛋白上不被遮蓋。

優選確定FRET效應是否存在包括：

-獲得樣品的至少一個熒光圖像，和

-執行所述至少一個熒光圖像的空間分辨分析以檢測和定位所述FRET效應。

本發明還提供一種用于對患病的對象分層的方法，所述方法用于評估治療(其中所述治療針對信號傳導途徑)的適合性,和/或用于對象的疾病的結果預后,和/或用于患病的對象針對治療的治療抗性的預測和/或檢測,其中所述方法包括:

-通過應用如上文所定義的用于在所述對象的樣品中檢測是否存在至少一種轉錄因子的方法來確定所述信號傳導途徑的活化狀態。

本發明的方法可以在短時間內完成。此外，該方法不需要使用酶，或者至少不需要復雜的酶反應，諸如序列擴增等。

在一些實施方案中，所述疾病可以是癌癥。

本發明還提供了用于實施本發明所定義的方法的試劑盒，其中所述試劑盒包含以下組件：

-第一結合構件，其具有與其綴合的第一寡核苷酸，其中所述第一結合構件針對第一表位，

-第二結合構件，其具有與其綴合的第二寡核苷酸，其中所述第二結合構件針對第二表位，和

-供體熒光團和受體熒光團，

其中所述第一和第二表位是蛋白的或蛋白復合物的第一和第二蛋白的，

其中所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸至少部分互補，

其中所述第一寡核苷酸提供有第一分離的屏蔽元件,和/或所述第二寡核苷酸提供有用于防止所述第一和第二寡核苷酸過早雜交的第二分離的屏蔽元件。

本發明還提供了用于實施本發明所定義的方法的試劑盒，其中所述試劑盒包含以下組件：

-第一結合構件，其具有與其綴合的第一寡核苷酸，其中所述第一結合構件針對第一表位，

-第二結合構件，其具有與其綴合的第二寡核苷酸，其中所述第二結合構件針對第二表位，

-供體熒光團和受體熒光團，和

-其中PI電子沿著分子離域的聚合物，其中所述聚合物能夠結合第一和第二寡核苷酸，并且能夠從供體熒光團轉移能量到受體熒光團，或作為供體熒光團和/或受體熒光團的受體和/或供體，

其中所述第一和第二表位是蛋白的或蛋白復合物的第一和第二蛋白的。

本發明的試劑盒不需要使用酶，或者至少不需要用于復雜的酶反應，諸如序列擴增等的試劑。

在一個實施方案中，供體熒光團和/或受體熒光團與第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸締合和/或連接。

本發明還提供了本發明的每種試劑盒在本發明的相應方法中的用途。

使用用于上述方法的試劑盒允許所述方法在短時間內完成。此外，使用所述試劑盒不需要使用酶，或者至少不需要復雜的酶反應，諸如序列擴增等。

本發明的方法和試劑盒具有共同的優點，即當不是第一結合構件和第二結合構件兩者都分別結合對象樣品中的蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位時，它們可以減少或避免由于供體熒光團和受體熒光團之間發生不期望的的FRET效應而導致的檢測誤差。

應當理解，本發明的優選實施方案也可以是從屬權利要求或上述實施方案與相應獨立權利要求的任意組合。

參考下文描述的實施例，本發明的這些和其它方面將是顯而易見的并且將被闡述。

附圖說明

在以下示例性和示意性附圖中：

圖1顯示Cy3和Cy5的激發光譜和發射光譜，

圖2（a）至（e）示出了根據本發明的第一實施方案，

圖3顯示了圖2（a）-（e）中所示的第一實施方案的變型。

圖4顯示了本發明方法的第二實施方案，

圖5顯示了本發明方法的第三實施方案，

圖6顯示了本發明方法的第四實施方案。

具體實施方案

在附圖中，相同元件用相同附圖標記表示。此外，在相同元件出現在相同的附圖或子圖中的情況下，可以用附圖標記僅指定單個實體。

圖2（a）至（e）顯示了用于檢測患者的組織和/或細胞和/或體液中蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20的第一和第二表位11,21的空間接近性的方法的第一實施方案。從圖中可以看出，第一結合元件30（這里是第一抗體）具有與其綴合的第一寡核苷酸31，并且第二結合元件40（這里是第二抗體）具有與其綴合的第二寡核苷酸41。

如圖2（b）所示，將具有與其綴合的第一寡核苷酸31的第一抗體30結合于第一表位11，將具有與其綴合的第二寡核苷酸41的第二抗體40結合于第二表位21。特別是，如圖2（a）所示，將具有與其綴合的第一寡核苷酸31的第一抗體30和具有與其綴合的第二寡核苷酸41的第二抗體40加入到包含蛋白復合物1的樣品中，在該實施例中，所述蛋白復合物1是由第一和第二蛋白10,20組成的蛋白二聚體。另外，樣品還可以單獨包含第一和第二蛋白，如本文所示。現在，在一定孵育期后，第一和第二抗體30,40已經特異性結合，即已經結合第一和第二表位11,21，或者根據具體情況已經非特異性結合，即已經結合到除了但可能類似于第一和第二表位11,21的位置（參見圖2（b）中已經結合在所示蛋白之間的空間中的抗體）。然后使用合適的洗滌步驟除去可能的非特異性結合的第一和第二抗體，導致基本上只有特異性結合的第一和第二抗體保留在樣品中，如圖2（c）所示。

在該實施方案中，第一寡核苷酸31用供體熒光團32預標記，并且第二寡核苷酸41用受體熒光團42預標記。供體-受體熒光團對的合適選擇可以是例如異硫氰酸熒光素（FITC）-四甲基羅丹明（TRITC）、Cy3-Cy5、增強型綠色熒光蛋白（EGFP）-Cy3、青色熒光蛋白（CFP）-黃色熒光蛋白（YFP）或EGFP-YFP。

這里，第一和第二寡核苷酸31,41是至少部分互補的，使得當它們彼此在空間上接近時它們可以雜交。為了防止第一和第二寡核苷酸31,41的過早雜交，即防止第一和第二寡核苷酸31,41在第一和第二抗體30,40結合到第一和第二表位11,21之前已經雜交，第一寡核苷酸31最初設置有第一分離的屏蔽元件33，并且第二寡核苷酸41最初設置有第二分離的屏蔽元件43。第一和/或第二分離的屏蔽元件33,43可以比第一和第二寡核苷酸31,41短得多，或者它/它們可以由多個短元件組成，只要它們允許抑制第一和第二寡核苷酸31,41的雜交。在該實施方案中，第一分離的屏蔽元件33包含與第一寡核苷酸31至少部分互補并與其雜交的第一DNA鏈，并且第二分離的屏蔽元件43包含與第二寡核苷酸41至少部分互補并與其雜交的第二DNA鏈。這里，第一和第二DNA鏈是未標記的DNA鏈，即，它們沒有用供體熒光團32或受體熒光團42預標記。

如圖2（d）所示，在結合第一抗體30之后，從第一寡核苷酸31去除第一分離的屏蔽元件33，這里是第一DNA鏈，并且在結合第二抗體40之后，從第二寡核苷酸41去除第二分離的屏蔽元件43，這里是第二DNA鏈。在該實施方案中，去除第一和第二DNA鏈包括使第一寡核苷酸31和第一DNA鏈33的雜交以及第二寡核苷酸41和第二DNA鏈43的雜交熔化。例如，在一個實例中，適當地增加樣品的溫度以實現雜交所需的熔化。在另一個實例中，改變樣品的溶劑以進行熔化。在熔化后，未標記的第一和第二DNA鏈33,43在合適的另外的洗滌步驟中洗去，也如圖2（d）所示，導致基本上只有具有與其連接的第一和第二寡核苷酸31,41的特異性結合的第一和第二抗體30,40保留在樣品中。

一旦已經從第一和第二寡核苷酸31,41除去第一和第二分離的屏蔽元件33,43，這里為第一和第二DNA鏈，則至少部分互補的兩個寡核苷酸可以雜交 ，如圖2（e）所示，使供體熒光團32和受體熒光團42具有允許在其間發生FRET效應的空間接近性。（該步驟優選包括在前述熔化步驟之后再次降低樣品的溫度）。確定供體熒光團32和受體熒光團42之間的FRET效應的存在，其中FRET效應的存在指示第一和第二寡核苷酸31,41的空間接近性，然后允許在患者的組織和/或細胞和/或體液的樣品中檢測蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20的第一和第二表位11,21的空間接近性。相反，如圖2（e）的左側和右側所示，與單個蛋白的相應表位特異性結合的抗體不會導致FRET效應，因為與其綴合的受體/供體熒光團預標記的寡核苷酸不會與用相應的供體/受體熒光團預標記的寡核苷酸在空間上接近。

第一和第二寡核苷酸31,41優選在主鏈上預標記，而不是僅僅在3'或5'-末端，如其通常的情況。此外，標記物可以使用如Ozaki H.和McLaughlin L.W.，“The estimation of specific between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescence resonance energy transfer”，Nucleic Acids Research，第20卷，第19期,1992，第5205-5214頁所述的標記方法應用到具體位點。優選還向含有可用于抗體位點特異性綴合的分子的序列添加堿基，并且在其上應優選是至少10至20nm的接頭（在接頭是雙鏈DNA的情況下更長，由于長的持久長度），使得第一和第二寡核苷酸31,41可以具有足夠的空間自由度以雜交。

在文獻中已經描述了實現有效能量轉移的各種方法（參見Demchenko A.P.，“Nanoparticles and nanocomposites for fluorescence sensing and imaging”，Methods and Applications in Fluorescence，第1卷，第2期，2013年，第28頁）。因此，不必在第一和第二寡核苷酸31,41上具有供體熒光團32和受體熒光團42的對稱分布。

熒光掃描儀或顯微鏡的檢測下限（LOD）非常依賴于光學器件和照相機的質量以及測量條件，諸如積分時間和激發強度。粗略的估計是，對于常規熒光顯微鏡光學布置，每個目標需要使用約100個染料分子，假設在約0.25μm²的光學分辨率下具有一個目標。因此，為了檢測單個寡核苷酸，目標在于對應約100個染料分子的發射強度。

另一個設計方面是避免同種染料之間的同源-FRET相互作用。在Invitrogen（Life Technologies/Thermo Fisher）網站上給出了可能的估計。據此，每20個堿基對約1個染料分子，Alexa染料家族勝過傳統的花青染料。然而，必須注意，該1:20密度是通過缺口平移的隨機標記獲得的，這意味著它包括相隔小于20個堿基對的熒光團。通過特異性標記，可以實現在每個寡核苷酸上每20個堿基對至少1個FRET對的更高密度。

有利地，被標記物完全飽和的寡核苷酸將顯示同源-FRET，但是所有供體熒光團標記物仍然可以將其能量轉移到其受體熒光團標記物，導致更低的標記需求。

此外，淬滅也可以用于通過從激活FRET化寡核苷酸之后獲得的圖像中減去之前獲得的圖像來產生圖像。

根據受體熒光團和供體熒光團的設計和類型，例如分子、量子點、納米顆粒或聚合物，可以選擇第一和第二寡核苷酸31,41的大小。

在用有機熒光染料的經典設計的情況下，第一和第二寡核苷酸31,41應當優選地被制造得相當長以為大約100個染料分子提供足夠的位置（例如，20×100 = 2000個堿基，或5×100 = 500個堿基）。

然而，也可以選擇染料的數量如此之小，使得不能檢測到單個蛋白復合物，而是檢測到一定濃度的復合物，使得檢測器的光學分辨率內的總發射超過檢測限。

圖3中顯示了圖2（a）-（e）所示的第一實施方案的變型。 該變型基本上類似于第一實施方案。然而，不同之處在于，在該變型中，第一分離的屏蔽元件33包含與第一寡核苷酸31至少部分互補并與其雜交的第一RNA鏈，和/或第二分離的屏蔽元件43包含與第二寡核苷酸41至少部分互補并與其雜交的第二RNA鏈。然后除去第一和第二RNA鏈包括使用酶50，例如，RNase H，用于消化RNA。該變體具有整個過程變得等溫的優點；但另一方面，它需要使用酶50。

圖4顯示了用于檢測患者的組織和/或細胞和/或體液樣品中蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20的第一和第二表位11,21的空間接近性的方法的第二實施方案。

此實施方案基本上類似于圖2（a）-（e）中所示的第一實施方案。然而，不同之處在于，在該實施方案中，供體熒光團32僅在第一結合構件30（此處為第一抗體）結合之后才與第一寡核苷酸31連接，并且受體熒光團42僅在第二結合構件40（此處為第二抗體）結合之后才與第二寡核苷酸41連接。特別是，如圖4所示，在結合第一抗體30后，提供用供體熒光團32標記的第三寡核苷酸34，其中第三寡核苷酸34與第一寡核苷酸31至少部分互補，并且將供體熒光團32連接到第一寡核苷酸31包括與其雜交第三寡核苷酸34。同樣，在結合第二抗體40后，提供用受體熒光團42標記的第四寡核苷酸44，其中第四寡核苷酸44與第二寡核苷酸41至少部分互補，并且將受體熒光團42連接到第二寡核苷酸41包括與其雜交第四寡核苷酸44。

這里，優選第一和第二寡核苷酸31,41部分互補以實現所需的空間接近性。然后第三和第四寡核苷酸34, 44優選在第一和第二寡核苷酸31, 41的相應互補區段中間與第一和第二寡核苷酸31, 41雜交，如圖4所示。

該實施方案的優點是用供體熒光團32和受體熒光團42標記的寡核苷酸可以與其余的檢測元件解耦，這可以允許熒光團的更簡單的測試和轉換（例如，在與干擾熒光團或高度自發熒光樣品多路復用的情況下）。此外，其可以允許標準化檢測測試的產生，特別是當使用二次免疫測定并且針對例如小鼠和大鼠抗體結構域設計測試時。

圖5顯示了用于檢測患者的組織和/或細胞和/或體液樣品中蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20的第一和第二表位11,21的空間接近性的方法的第三實施方案。

此實施方案基本上類似于圖2（a）-（e）中所示的第一實施方案。特別是,還是在此實施方案中，第一和第二寡核苷酸31,41是至少部分互補的，使得當它們彼此在空間上接近時它們可以雜交。然而，不同之處在于，在該實施方案中，僅第二寡核苷酸41用受體熒光團42標記，并且如圖5所示，在第一和第二結合構件30,40（這里是第一和第二抗體）的結合之后，添加供體熒光團32，其嵌入通過第一和第二寡核苷酸31,41的雜交形成的雙鏈中。

這里，僅在第一和第二抗體30,40結合后加入的供體熒光團32基于嵌入染料，例如，DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）或YOYO，其是噁唑黃的四價陽離子同二聚體。因為嵌入染料僅在實際嵌入雙鏈DNA中時才發熒光，所以可以有利地確保FRET效應僅在所需位置產生。

圖6顯示了用于檢測患者的組織和/或細胞和/或體液樣品中蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20的第一和第二表位11,21的空間接近性的方法的第四實施方案。

此實施方案基本上類似于圖2（a）-（e）中所示的第一實施方案。然而，不同之處在于，在結合第一和第二結合構件30,40（這里是第一和第二抗體）之后，提供其中PI電子沿著分子離域的聚合物60，其中所述聚合物60能夠結合第一和第二寡核苷酸31，41，并且能夠從供體熒光團32轉移能量到受體熒光團42，或作為供體熒光團32和/或受體熒光團42的受體和/或供體。

由于在此實施方案中，能量轉移借助第三元件，即聚合物60實現，所以第一和第二寡核苷酸31，41不必至少部分互補。這具有的優點是，如果第一和第二寡核苷酸31,41基本上完全不互補，則不必須提供第一和第二寡核苷酸31,41的屏蔽，這可以導致更簡單的過程，因為在這種情況下，還可以避免去除屏蔽的步驟。

優選地，一種或多種聚合物可以連接到一個寡核苷酸上并且一個或多個量子點連接到互補的寡核苷酸上，導致非常緊湊的檢測元件，其可以容易地擴散到樣品中。

雖然在參照上圖2至6描述的第一至第四實施方案中，第一和第二結合構件30,40是第一和第二抗體，優選第一和第二單克隆抗體，但是在其它實施方案中，它們也可以是例如第一和第二抗體片段，諸如駱駝抗體，適體或寡肽。更一般地，第一和第二結合構件30,40可以是能夠分別結合第一和第二表位11,21，并且第一和第二寡核苷酸31,41可以綴合到其上的任何種類的元件或結構。

雖然在參照上圖2至6描述的第一至第四實施方案中，第一和第二抗體30,40的結合在兩個步驟中限定，但這并不意味著這兩個步驟不能以不同的順序或優選基本上同時進行。對于在第一和第二抗體30,40結合后，從第一和第二寡核苷酸31,41去除第一和第二分離的屏蔽元件33,43以及將供體熒光團32和受體熒光團42連接到第一和第二寡核苷酸31,41上的步驟也是如此。

雖然在參照圖5描述的第三實施例中，僅第二寡核苷酸41用受體熒光團42標記，并且在第一和第二抗體30,40結合之后，添加供體熒光團32，其嵌入通過雜交第一和第二寡核苷酸31,41形成的雙鏈，但是其也可以是相反的。換句話說：在另一個實施方案中，只有第一寡核苷酸31可以用供體熒光團32標記，并且在第一和第二抗體30,40結合后，可以添加受體熒光團42，其嵌入到通過第一和第二寡核苷酸31,41的雜交形成的雙鏈中。

在參照上圖2至圖6描述的第一至第四實施方案中，優選選擇第一和第二抗體30,40，使得第一和第二表位11,21在蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20上不被遮蔽。

在參照圖2至圖6描述的第一至第四實施方案中，本發明已經關于蛋白復合物1的第一和第二蛋白10,20的第一和第二表位11,21的空間接近度的檢測進行了說明。然而，本發明也可以用于檢測（單一）蛋白的第一和第二表位的空間接近度。

在本發明中，如本文所述，術語“寡核苷酸”也用于還包括PNA（肽核酸）和LNA（鎖定的核酸）分子。

對于第一和/或第二寡核苷酸31,41，使用PNA和/或LNA可能是有利的，因為已知兩者都以更高的特異性結合DNA（和RNA）。該性質可以用于例如通過甚至更好地防止第一和第二寡核苷酸31,41的過早雜交來制備其中第一和第二寡核苷酸31,41至少互補甚至更特異和更強的實施方案。此外，如果第一和/或第二寡核苷酸31,41使用PNA分子和/或LNA分子，則除去第一和第二分離的屏蔽元件33,43所需的溫度升高可能較低。此外，人造核酸諸如PNA和LNA可以具有較小的持續長度（persistence length）。

此外，通過例如增加鹽濃度可以改善寡核苷酸的靈活性，因為在這種情況下，持續長度因此降低。Manning G.S., "The persistence length of DNA is reached from the persistence length of its null isomer through an internal electrostatic stretching force", Biophysical Journal, 第91卷, 第10期, 2006, 第3607-3616頁表示通過增加鹽濃度高于0.1M，可以使雙鏈DNA的持續長度降低到30nm而不是通常的50nm。

本發明可以應用于疾病診斷領域，特別是癌癥診斷領域。可以通過本發明檢測的多聚蛋白聚集體諸如蛋白二聚體和/或蛋白翻譯后修飾的實例包括：

-HER2-HER2二聚體，

-HER2-HER3二聚體，

-HER2磷酸化，

-AKT磷酸化，

-ER-ER二聚體，

-ER-p300二聚體，

-AR-p300二聚體，

-TCF4-β-連環蛋白二聚體等。

一般來說，本發明還涉及對患有疾病的對象，優選患者，更優選癌癥患者的分層的方法，所述方法用于評估治療適用性，其中所述治療針對信號傳導途徑，和/或用于對象疾病優選癌癥患者的癌癥結果的預后，和/或用于患有疾病的對象，優選癌癥患者對治療的治療抗性的預測和/或檢測。該方法包括通過應用如上文所定義的本發明的方法來確定信號通路的激活狀態，以在對象的樣本中檢測是否存在至少一個轉錄因子。

這樣的方法可以例如用于檢測特定蛋白，優選轉錄因子諸如膜受體HER2或兩個或更多個空間上接近的蛋白的存在，優選地，兩個或更多個蛋白是轉錄因子復合物的部分，諸如ER和p300（見上文）。

例如，為了以半定量的方式顯示HER2的存在，常規地對組織活組織檢查樣品進行免疫組織化學（IHC）實驗。該受體的存在或不存在是臨床相關的，因為它指示患者是否將對靶向藥物赫賽汀作出反應。這種臨床IHC測試的其它實例包括例如激素受體如ER和PR的存在的檢測，以及例如增殖標記Ki67的檢測。

盡管IHC具有證明的臨床價值，但是其受限于如下事實，即對于僅存在蛋白不能證明其在細胞信號傳導中的活性作用。為了能夠判斷蛋白是否積極發出信號，需要本申請的方法來檢測其磷酸化狀態或者是否其與其他蛋白形成復合物。例如，上述HER2蛋白可以與蛋白HER3形成二聚體并且避開赫賽汀的作用。相關相互作用的另一個實例是轉錄因子復合物，其是多種蛋白的聚集體，其存在可表明基因轉錄的激活。它們的存在可能指示腫瘤驅動途徑，并因此與所述腫瘤的治療相關。一個實例是轉錄因子復合物TGF-β/β-連環蛋白：如果這些蛋白可以顯示在細胞核中緊密的空間接近，則Wnt通路最有可能處于開狀態，而僅存在單獨的兩種蛋白其中之一不具有相同的含義。

如上所述，本發明還涉及一種用于執行根據本發明的方法的試劑盒。根據要執行的方法，必須相應地選擇這種試劑盒的組件。例如，為了進行用于評估赫賽汀治療適用性的方法，這種試劑盒可以包含第一結合構件30，例如具有與其綴合的第一寡核苷酸31的第一抗體，其中第一結合構件30被引導針對第一表位11，第二結合構件40，例如具有與其綴合的第二寡核苷酸41的第二抗體，其中第二結合構件40針對第二表位21，以及供體熒光團32和受體熒光團42，其中第一表位11是HER2，并且第二表位21是HER3。

通過研究附圖，公開內容和所附權利要求，本領域技術人員在實施要求保護的本發明時可以理解和實現所公開的實施方案的其它變型。

在權利要求中，“包括”一詞并不排除其他元素或步驟，并且不定冠詞“a”或“an”不排除多個。

權利要求中的任何參考文獻標記不應被解釋為限制范圍。