一種銅綠假單胞菌基因及其dna疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于分子生物學和感染免疫領域，具體設及一種銅綠假單胞菌化rF-VP22 基因和含有該基因的DNA疫苗。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，種化)又稱綠脈桿菌，假單胞桿菌屬，是 一種專性需氧的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，上壤、水、空氣，正常人的皮膚、呼吸道 和腸道等都有該菌存在。該菌是一種條件致病菌，機體在某些條件下，如抵抗力降低，被嚴 重燒傷或患代謝性疾病、血液病、惡性腫瘤，W及術后或某些治療后容易感染該菌。銅綠假 單胞菌是院內獲得性感染的重要致病菌，我國全國性監測數據顯示:從1994年到2006年，銅 綠假單胞菌在所有院內感染的革蘭氏陰性菌中排第1位;2008年9月至2011年8月住院患者 標本中分離出的革蘭氏陰性桿菌進行分析發現，銅綠假單胞菌連續3年名列第1，并成為呼 吸機相關性肺炎的首位致病菌。
[0003] 隨著抗生素不合理的應用，該菌對抗菌藥的耐藥性呈現逐年上升的趨勢，并且開 始產生對3類或3類W上抗菌藥均表現耐藥的多重耐藥，甚至泛耐藥的現象。化因耐藥率高 導致抗菌藥物治療困難的現狀已成為目前國內外臨床抗感染治療的棘手問題，2012年的中 國CHI肥T細菌耐藥性檢測結果顯示:除阿米卡星和多粘菌素 BW外，銅綠假單胞菌對其他臨 床常用的抗菌藥物耐藥率為17%-35%，其中對美羅培南和亞胺培南的耐藥率高達27.1% 和29.0%，與10年前相比有了明顯的上升。銅綠假單胞菌存在天然耐藥、獲得性耐藥及適應 性耐藥等復雜的耐藥機制。
[0004] 鑒于化日益嚴重的耐藥現狀，迫使我們急切需要尋求抗菌藥物之外的其他手段來 治療和預防化感染。免疫預防一直都是人們防治疾病的一個重要手段，因此研究有效的疫 苗成為防治化感染的重要策略之一。隨著分子生物技術及基因工程技術的發展，DNA疫苗逐 漸成為人們關注的焦點。DNA疫苗，又稱核酸疫苗或基因疫苗，是把編碼目的抗原基因序列 的真核表達質粒DNA，經過一定的途徑導入人或動物體內，通過宿主細胞的轉錄翻譯系統， 在體內表達出抗原蛋白，從而刺激機體產生免疫應答起到免疫保護的作用。作為新一代的 疫苗形式，與傳統疫苗相比，DNA疫苗具有許多潛在的優勢:如制備簡單，成本低廉，易于大 規模生產;可W制成凍干疫苗，便于保存和運輸;既能介導體液免疫又能介導細胞免疫，可 W將多種質粒DNA組成多價疫苗等。
[0005] 關于化疫苗的研究已有半個多世紀的歷史，對化疫苗的研究大致經歷了滅活與減 毒活疫苗^結合疫苗^基因工程疫苗幾個階段，做為一種新型的基因工程疫苗，迄今銅綠 假單胞菌DNA疫苗尚處于動物實驗研究階段，雖取得了一定進展，但在研究中發現，DNA疫苗 普遍存在免疫效力較低的缺點，即使W免疫原性較強的外膜蛋白F(the outer membrane protein F，0prF)為抗原的DNA疫苗仍然存在運樣的問題。因此，至今還沒有一種能真正有 效防治化感染的DNA疫苗問世。
[0006] 具有蛋白轉導功能的細胞穿透膚(cell pene化ating P邱tide，CPP)逐漸成為科 研者關注和研究的對象，CPP是一類能夠順利通過生物膜進入細胞的多膚，能夠攜帶不同種 類的外源物質，包括蛋白質、核酸及多膚等大分子物質通過生物膜和生理屏障(包括血腦屏 障和胎盤屏障)進入細胞，并且不受細胞類型的限制，在體內外均能發揮作用。
[0007] I型單純瘤疹病毒間層蛋白VP22已被證實是一種含有CPP結構的蛋白質，在a瘤疹 病毒中有較高的同源性。VP22具有高效的細胞間轉導功能，能夠在沒有媒介物或受體的情 況下攜帶外源物質跨越生物膜質結構進入細胞，并介導被轉運物質從轉染細胞傳遞至鄰近 細胞，且保留轉運物質的生物學活性和功能。VP22與抗原DNA融合的VP22-DNA疫苗有著較大 的研究價值。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種銅綠假單胞菌外膜蛋白F與I型單純瘤疹病毒間層蛋 白VP22融合表達的銅綠假單胞菌化rF-VP22基因及其DNA疫苗。該基因編碼的蛋白質可有效 地穿透細胞膜，可W促進抗原蛋白化rF進入細胞，從而提高抗原遞呈細胞提呈抗原蛋白的 能力，進而增強DNA疫苗的免疫效力。
[0009] 本發明的一種銅綠假單胞菌化巧-VP22基因，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發明的一種銅綠假單胞菌化巧-VP22基因在制備銅綠假單胞菌疫苗中的用途。
[0011] 本發明的目的還在于提供一種銅綠假單胞菌DNA疫苗，包含銅綠假單胞菌化rF-VP22基因，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 上述本發明的DNA疫苗，所述基因構建于表達載體上，所述所述表達載體為pVAX- Io
[0013] 本發明的有益效果如下：
[0014] 1. W銅綠假單胞菌PAOl為模板擴增OprF基因，WpcDNA3-VP22為模板擴增VP22基 因，W抑A批準人DNA疫苗質粒pVAXl為載體，采用Overlapping PCR方法獲得DNA疫苗pVAXl-0prF-VP22。
[0015] 2.酶聯免疫吸附實驗化LISA)間接法確證pVAXl-〇prF-VP22免疫BALB/c小鼠的抗 體效價高于pVAXl-OprF免疫BALB/c小鼠，說明pVAXl-〇prF-VP22增強了OprF DNA疫苗的體 液免疫效力。
[0016] 3.T淋己細胞增殖實驗和IFN-丫酶聯免疫斑點法確證pVAXl-0prF-VP22免疫BALB/ C小鼠 T淋己細胞的增殖能力與T淋己細胞分泌IFN-丫的能力均高于pVAXl-化rF免疫BALB/c 小鼠，說明pVAXl-〇prF-VP22增強了OprF DNA疫苗的細胞免疫效力。
[0017] 4.pVAXl-〇prF-VP22對BALB/c小鼠銅綠假單胞菌肺部感染模型的保護作用強于 pVAXl-OprF免疫小鼠，說明pVAXl-〇prF-VP22增強了OprF DNA疫苗的動物免疫保護作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1是pVAXl-〇prF-VP22DNA疫苗的酶切鑒定結果，其中圖中1泳道為pVAXl-OprF-VP22DNA疫苗，2泳道為pVAXl-〇prF-VP22BamHI和EcoRI雙酶切產物，M泳道為核酸分子量標 準
[0019] 圖2為小鼠血清化巧抗體效價盒形圖。
【具體實施方式】
[0020] W下實施例用于進一步理解和說明本發明質，但不W任何方式限制本發明的范 圍。
[0021] 實施例1 pVAXl-Op巧-VP22構建方法
[0022] 采用overlapping PCR的方式構建銅綠假單胞菌DNA疫苗pVAXl-Op巧-VP22
[002引 UPCR擴增化rF基因：按北京天根生物有限公司細菌基因組提取試劑盒說明書，從 銅綠假單胞菌PAOl提取銅綠假單胞菌基因組，再采用引物擴增化rF基因序列開放閱讀框1 ~IOSObp(GenBank:NC_002516.2) 0P3:5' -CGCGGATCCACCATGAAACTGAA GAACAC-3 '），其中 W 下劃線表示BamHI酶切位點;P7: 5^CTGAAGCCAAGATGACCTCTCGCCG-3/PCR參數:預變性溫度 與時間94°C3min;變性溫度與時間94°C30sec，退火(復性)溫度與時間55°C30sec，延伸溫度 與時間72 "Clmin，共30個循環;72 °C5min后終止反應。
[0024] 2、PCR擴增VP22基因：WpcDNA3-VP22為模板，采用引物擴增VP22基因序列開放閱 讀框 1 ~906bp。P8:5/-CGGCGAGAGGTCATCTTGGCTTCAG-3/，P2:5'-ATT^^絲22^TCACTCGACGGGCCG-3' ，其中W下劃線表示EcoRI酶切位點。PCR參數:預變性溫度 與時間94°C3min;變性溫度與時間94°C30sec，退火(復性)溫度與時間55°C30sec，延伸溫度 與時間72 "Clmin，共30個循環;72 °C5min后終止反應。
[0025] 3、構建銅綠假單胞菌DNA疫苗pVAXl-化rF-VP22:步驟巧日步驟2中得到的化rF基因 與VP22基因各IOOng做模板，3化1體系進行PCR，參數:預變性溫度與時間94 °C 3min;變性溫 度與時間94°C30sec，退火(復性)溫度與時間55°C30sec，延伸溫度與時間72°Clmin，共10個 循環；72°C5min后終止反應。W產物為模板，P3和P2引物，5化1體系進行PCR，參數同1。用 Bamm和EcoRI分別雙酶切擴增化rF-VP22重組基因與DNA疫苗載體pVAXl后回收目的片段， 用如ick T4DNA Iigase連接酶在25°C連接lOmin。然后，將連接產物轉化至大腸桿菌D冊a感 受態細胞中，通過卡那霉素抗性篩選、限制性內切酶酶切鑒定，得到DNA疫苗pVAXl-OprF-VP22,經基因測序，得到序列表SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列。酶切結果如圖1所示。
[00%] 實施例2 pVAXl-Op巧-VP22DNA疫苗免疫小鼠及制備小鼠抗血清
[0027] 1. DNA疫苗免疫小鼠：將SPF級6-8周齡健康雌性BALB/c小鼠隨機分成PBS免疫組 (陰性對照）、口乂4乂1-0口'尸、口￥4乂1-0口評-￥口22組，每組8只小鼠。口￥4乂1-0口'尸、口￥4乂1-0口'尸-VP22組小鼠肌肉注射相應質粒20ug，陰性對照組注射PBS，共免疫3次，每次間隔2周。
[00%] 2.小鼠血清的制備：于末次免疫后1周處死小鼠，眼球摘除法取靜脈血，采集的血 樣于37°C放置化充分凝固后4°C過夜，在4°C下，400化pm離屯、IOmin收集血清，分裝后-70°C 保存。
[0029] 3.小鼠 T淋己細胞制備:于末次免疫后1周處死小鼠，獲取脾臟，將脾細胞懸液調整 濃度為1 X 108cells/mL，免疫磁珠法分選T淋己細胞。
[0030] 實施例3 pVAXl-Op巧-VP22增強化巧DNA疫苗的體液免疫效力
[0031] 1. ELISA間接法測定：
[0032] 1)抗原包被:將純化的化rF用0.05M的pH 9.6的碳酸鹽緩沖液W最適稀釋度稀釋 (lug/ml)后，加入聚苯乙締微量塑料板中，每孔100ul，4°C包被過夜（1化-24h)。
[0033] 2)洗涂：甩掉其中液體，吸水紙上拍干，加入洗涂液，300ul/孔，震蕩，室溫放置 5min，共洗涂3次。
[0034] 3)封閉：封閉液300ul/孔。37 °C培養箱化，封閉之后洗涂3次（同前）。
[0035] 4) 一抗解育：加入系列倍比稀釋的待檢血清（1:500始），每孔加入IOOuK雙復孔）， 同時設空白對照孔和陰性對照，37 °C解育化。
[0036] 5)洗涂3次（同前）。
[0037] 6)二抗解育：用封閉液稀按1:250稀釋二抗，IOOul/孔，解育:37°C，化。
[003引7)洗涂5次（同前）。
[0039] 8)加入 TMB 顯色液 aOOul/孔，37°C 下解育 10-15min。
[0040] 9)終止反應，30-50ul/孔，預熱酶標儀，5min內讀數450nm和630nm吸光值(OD值= 0〇4加 -〇〇630)。
[0041] 10)結果判定:試驗中WPBS免疫小鼠血清（1:500稀釋)為陰性對照，樣本血清的OD 值〉〇. 1且OD樹/OD陰斷服含2.1時判為陽性;將抗體效價定義為：陽性血清與陰性對照血清的 OD比值（即OD附抽慮/OD陰啦服）含2.1時最大的血清稀釋倍數。小鼠血清化rF抗體效價:pVAXl-化rF免疫組血清化rF抗體效價中位數為6000，pVAXl-0prF-VP22免疫組血清化rF抗體效價 中位數為48000，pVAXl-化rF-VP22免疫組血清化rF抗體效價顯著高于pVAXl-化巧免疫組(P <0.OOl)。因此，pVAXl-〇prF-VP22增強了化rF DNA疫苗的體液免疫效力。抗體效價結果見圖 2(圖中 ** 沖 <0.001)
[0042] 實施例4 pVAXl-Op巧-VP22增強化巧DNA疫苗的細胞免疫效力
[0043] (一)T淋己細胞增殖
[0044] 1.CCK-8 法檢測
[0045] 1)將T淋己細胞調至濃度為4X106cells/mL，取IOOiil加入到96孔板中，每組設S 個復孔，一個對照孔，一個調零孔(對照孔加細胞和培養基，調零孔只加培養基）。
[0046] 2)將96孔板置于5 % C〇2，37 r培養箱中解育過夜。
[0047] 3)用純化的化巧分別刺激細胞，培養箱中解育60h。
[004引4)取出96孔板后，更換新鮮無血清培養基10化1，每孔加入lOiilCCK-8溶液，37°C解 育地。
[0049] 5)檢：J則450nm處的吸光值。刺激指數=(A養E-A麗LV(A^i-Aiam)
[0050] 2 .T淋己細胞增殖結果:PBS組刺激指數為1.02±0.02，pVAXl-化rF組刺激指數為 1.47±0.02、9￥4乂1-化巧-￥?22組刺激指數為2.24±0.04沖￥4乂1-化巧-￥?22免疫組1'淋己細 胞增殖能力顯著高于pVAXl-OprF免疫組(P<0.0 Ol)。
[0化1 ](二)T淋己細胞分泌IFN- 丫的能力 [0化2] 1. ELISPOT 檢測
[00對 1)將捕獲抗體加入到PBS無菌包被液中，混勻，向96PVDF微孔板中每孔加10化1，4 °C解育過夜。
[0化4] 2)倒去液體，用20化LPBS洗涂兩次。
[0055] 3)每孔加入20化1 RPMI-1640完全培養基，在室溫下解育化，倒去液體。
[0化6] 4)調節細胞濃度為2X106cells/mL，每孔加入100山細胞懸液和100i^l純化的化rF (終濃度為祉g/ml)進行刺激，陰性對照孔不加純化蛋白，加入等量的RPMI-1640完全培養 基，每組各設3個復孔。
[0化7] 5) 5 % C〇2，37 °C培養箱中解育24h。
[005引6)移去孔中的液體，用化ISPOT洗涂緩沖液清洗S次。
[0059] 7)將檢測抗體加入到檢測稀釋液中，每孔加入10化1，37°C解育化。
[0060] 8)倒去液體，用洗涂液沖洗4次(每次洗涂需等待Imin后再倒去液體）。
[0061] 9)將HRP標記的親和素用稀釋液稀釋，每孔加入10化1，室溫解育化。
[0062] 10)倒去液體，然后用洗涂液洗3次，PBS洗2次。
[0063] 11)每孔加入10化1新鮮配置的AEC底物顯色液，室溫下反應10~30min。
[0064] 12)完全顯色后，每孔加 20化1蒸饋水終止反應，洗涂=次。
[0065] 13)膜風干后，在低倍顯微鏡下讀取斑點數。4°C下放置一夜，點會比較明顯。
[0066] 2 . T淋己細胞分泌IFN- 丫的實驗結果：PBS組分泌IFN- 丫 T淋己細胞斑點數8.6 ± 1.2，pVAXl-OprF組31.6 ± 2.1，pVAXl-〇prF-VP22組 72.0 ± 2.6 epVAXl-〇prF-VP22 組T淋己細 胞分泌IFN-丫能力顯著高于pVAXl-化rF免疫組(P<0.0 Ol)。因此，綜合T淋己細胞增殖與T淋 己細胞分泌IFN-丫的實驗結果，表明pVAXl-〇prF-VP22增強了化rF DNA疫苗的細胞免疫效 力。
[0067] 實施例5 pVAXl-Op巧-VP22增強化巧DNA疫苗的免疫保護作用
[006引小鼠如實施例2的1的方法免疫后1周腹腔內注射5 X IO6C即銅綠假單胞菌PAOl，觀 察小鼠 10天的死亡率。PBS組小鼠在感染7天內全部死亡，pVAXl-化rF組小鼠在感染9天內全 部死亡，而pVAXl-0prF-VP22組小鼠感染10天后仍有40%存活。說明pVAXl-0prF-VP22組的 免疫保護作用顯著強于pVAXl-OprF組（P<0.001)。因此，pVAXl-0prF-VP22增強了OprF DNA 疫苗的免疫保護作用。
[0069] <110〉重慶醫科大學附屬第二醫院 〈12日> 一種銅綠假單胞菌基因及其DNA疫苗 <化日〉1 <210〉 1 巧;11〉巧飄 <212> DNA <213〉銅綠假單胞茜 <400〉 1
【主權項】
1. 一種銅綠假單胞菌0prF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 權利要求1的0prF-VP22基因在制備銅綠假單胞菌疫苗中的用途。3. -種銅綠假單胞菌DNA疫苗，包含銅綠假單胞菌0prF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 如權利要求3所述的疫苗，所述基因構建于表達載體上。5. 如權利要求4所述的疫苗，所述表達載體為pVAXl。
【專利摘要】本發明公開一種銅綠假單胞菌OprF?VP22基因，以及該基因作為制造防治銅綠假單胞菌感染疫苗的用途，以及一種含有該基因的銅綠假單胞菌DNA疫苗。
【IPC分類】C12R1/385, C12N15/62, A61K39/104, A61P31/04, A61K48/00
【公開號】CN105713916
【申請號】CN201610085884
【發明人】余嫻, 趙春景
【申請人】重慶醫科大學附屬第二醫院