一種綠色木霉突變株的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物培養技術領域，具體是一種綠色木霉突變株的培養方法。
【背景技術】
[0002] 綠色木霉(Trichoderma viride)為半知菌，屬一類廣布型真菌口半知菌亞口、絲 抱菌綱、絲抱目、粘抱菌類、木霉屬。該菌類常腐生于木材、種子和植物殘體上，能產生多種 具有生活性物質（如纖維素酶、幾下質酶等物質），通過產生并分泌于胞外，殺死±壤中的有 害菌物。
[0003] 由于綠色木霉可在多種營養基質上快速生長，對多種植物病原菌又重寄生作用， 能有效地競爭營養和生存空間，還可W產生抗生素和攻擊多種病原所需要的酶，所W被認 為是一種很有開發潛力的生防菌。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種綠色木霉突變株的培養方法，利用化學誘變對從腐爛 的木材殘體上混合菌物篩選的綠色木霉進行化學誘變，誘導出的綠色木霉突變株具有高效 抗小麥赤霉病、草替和番茄灰霉病等±傳病的作用。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0006] -種綠色木霉突變株的培養方法，包括W下步驟：
[0007] (1)綠色木霉菌株的培養與純化:先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26 °C接 種于PDA固體培養基上培養3~5天，篩選并鑒定出綠色木霉菌株，經二代連續培養出純化綠 色木霉困株；
[000引（2)純化綠色木霉菌株的擴大培養:純化綠色木霉菌株再經液態PDA培養基中擴大 培養，離屯、去清液，測定活性，再用二級純水洗涂，W8000r/min離屯、15min，取沉淀并重復一 次擴大培養，離屯、去清液，測定活性，再用二級純水洗涂，WSOOOr/min離屯、15min，取沉淀吹 干后保存于冰箱暗處；
[0009] (3)純化綠色木霉菌株的誘變:將步驟(2)中離屯、后的清液放入PDA培養基中，再 W幾下質或者結晶簇酸纖維素鋼為反應底物，W秋水仙堿或者硫酸二乙醋作為誘變劑，進 行誘變，誘變終止后，經離屯、取沉淀物，置于暗處穩定4~化，即得綠色木霉突變株;其中誘 變劑的濃度為0.005~0.0 Swt % ;誘變時間為6~12化。
[0010] 作為本發明進一步的方案:所述步驟(2)中，按照重量百分比，液態PDA培養基由W 下物質配置而成：馬鈴馨2~3%;魚蛋白粉0.5~3.3% ;FeS〇4〇.〇l~〇.〇3%;K也P040.02~ 0.20% ;MgS〇4〇.05~0.35% ;Na2B2〇7 ? 10出0 0.025~0.05% ;Na2Se〇3〇.025~0.05%， aiS〇4〇.〇l ~0.02%，余量為水。
[0011] 作為本發明進一步的方案:所述液態PDA培養基的pH值調至5.8~6.5，培養溫度為 27 ±1. (TC,培養時間為5天。
[0012] 作為本發明進一步的方案:所述步驟(3)中，按照反應底物與發酵物的質量體積比 為lOg/L，添加反應底物。
[0013] 作為本發明進一步的方案:所述步驟(3)中，誘變劑的濃度為0.01~0.05wt %，誘 變時間為30~SOh。
[0014] 作為本發明進一步的方案:所述步驟(3)中，誘變劑的濃度為0.03wt %，誘變時間 為48~6化。
[0015] 作為本發明進一步的方案:所述步驟(3)中，誘變劑的濃度為0.03wt %，誘變時間 為4她。
[0016] 作為本發明進一步的方案:還包括(4)綠色木霉突變株的鑒定，加入濃度為0.5~ 1.5wt%的薦糖作引子，啟動抱子的萌發。
[0017] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0018] 本發明利用化學誘變對從腐爛的木材殘體上混合菌物篩選的綠色木霉進行化學 誘變，誘導出的綠色木霉突變株具有高效抗小麥赤霉病、草替和番茄灰霉病等±傳病的作 用，可代替化學農藥運用于農作物的種植，防治由±壤所產生的病害，實現作物增產。
【具體實施方式】
[0019] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中 的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例， 都屬于本發明保護的范圍。
[0020] 實施例1
[0021] 本發明實施例中，一種綠色木霉突變株的培養方法，包括W下步驟：
[0022] (1)綠色木霉菌株的培養與純化:先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26°C接 種于PDA固體培養基上培養3~5天，對照國家微生物菌庫所公布圖樣M1、M2進行篩選鑒定 后，經二代連續培養出純化綠色木霉菌株；
[0023] (2)純化綠色木霉菌株的擴大培養:步驟（1)制得的純化綠色木霉菌株再經液態 PDA培養基中擴大培養，離屯、去清液(保留冰箱4°C)，測定活性（目的在于鑒別菌物特征功能 強弱，W供開發應用參考），再用二級純水洗涂，W8000r/min離屯、15min，取沉淀并重復一次 擴大培養，離屯、去清液(保留冰箱4°C)，測定活性，再用二級純水洗涂，W8000r/min離屯、 15min，取沉淀吹干后保存于冰箱暗處，W保障菌物優良特征改變較小；
[0024] 其中，液態PDA培養基，按照重量百分比由W下物質配置而成：馬鈴馨2~3% ;魚蛋 白粉0.5~3.3% ;FeS〇4〇.01 ~0.03% ;K出P040.02~0.20% ;MgS〇4〇.05~0.35% ;Na2B2〇7 ? 10此00.025~0.05 % ;Na2Se〇3〇. 025~0.05 %，ZnS〇4〇. 01 ~0.02 %，余量為水。所述液態PDA 培養基的pH值調至5.8~6.5，培養溫度為27 ± 1. (TC，培養時間為5天。
[0025] (3)純化綠色木霉菌株的誘變:將步驟(2)中離屯、后的清液放入PDA培養基中，W幾 下質或者結晶簇酸纖維素鋼為反應底物(其中幾下質的添加量是單獨按照發酵物體積容量 配制（lOg/L)加入發酵容器內，結晶簇酸纖維素鋼的加入也是單獨按照發酵物體積容量配 審iJ(l〇g/L)加入發酵容器內），W化學誘變劑一一秋水仙堿或者硫酸二乙醋作為誘變劑，進 行誘變，其中誘變劑的濃度為0.005~0.0 Swt % ;誘變時間為6~12化，誘變終止后，經離屯、 取沉淀物，即為綠色木霉突變株，置于暗處穩定4~化，避免遇光恢復突變而導致失敗；
[0026] (4)綠色木霉突變株的鑒定:鑒定檢測菌物時加薦糖(濃度0.5~1.5wt%)作引子， 啟動抱子的萌發。
[0027] 本發明實施例中，按照誘變劑的濃度依設計六個水平（0.005wt %、0.0 Iwt %、 0.02wt %、0.04wt %、0.06wt %、0.0 Swt % )，分水平加入PDA培養基中，誘導基因發生，密碼 缺陷，導致相關主要功能酶信息不能表達;誘變時間長短按所設計的9個因素(6h、12h、24h、 3化、4化、6化、7化、9化、120h)控制，具體的設計如表1所示。
[00%]其中，PDA培養基的具體制備步驟為:去皮馬鈴馨600g，切碎加水200ml煮沸30分鐘 后趁熱用240目濾布過濾去濾渣留汁;碎米慷45g，加水150ml煮沸40分鐘，用前述濾布過濾 去渣留汁，與前濾液合并量體積，加薦糖60g，蜂蜜(最佳槐蜜或向日葵蜜)90g，酵母粉15g， 按照幾下質與發酵物的質量體積比為lOg/L的比例添加膠態幾下質，注入粉針劑青霉素1 瓶，再加水至化，滅菌。
[0029] 表1誘變劑的濃度和誘變時間的設計
[0030]
[0031] 經過化學誘變劑的誘變后，W綠色木霉細胞增加為特征進行檢測。因微生物很小， 它生長過程計數是W細胞的分裂數"1個變2個，2個變4個，呈規律增加及細胞外表色澤 確定吸收波長，外表是綠色，選擇吸光度A645nm，然后根據下面公式計算：
[0032] A = QCL (1)
[0033] 式中，a為比例常數;C為單位面積細胞數(或溶液中細胞存在產生透光率）；L為計 算后的面積(一般為1而忽略）。
[0034] 在口出％7.2、0.05111〇1幾的憐酸緩沖液中的吸收光系數為82.04，即可列出上述式 (1)。
[0035] A663 = 16.75XaC (2)
[0036] 根據式（1)列出的A，代入上式(2)求出表2中各水平的抱子數或產生的透光率如表 2,其中Wb5為最佳，結合表1，誘變時間為4她最佳。
[0037] 表2木霉抱子(即細胞每cm2)增加的方差分析結果
[00；3 引
[0039] 本發明利用化學誘變對從腐爛的木材殘體上混合菌物篩選的綠色木霉進行化學 誘變，誘導出的綠色木霉突變株具有高效抗小麥赤霉病、草替和番茄灰霉病等±傳病的作 用，可代替化學農藥運用于農作物的種植，防治由±壤所產生的病害，實現作物增產。
[0040] 對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在 不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠W其他的具體形式實現本發明。因此，無論 從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有 變化囊括在本發明內。
[0041] 此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加 W描述，但并非每個實施方式僅包 含一個獨立的技術方案，說明書的運種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當 將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可W經適當組合，形成本領域技術人員 可W理解的其他實施方式。
【主權項】
1. 一種綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 綠色木霉菌株的培養與純化:先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26 °C接種于 roA固體培養基上培養3~5天，篩選并鑒定出綠色木霉菌株，經二代連續培養出純化綠色木 霉菌株； (2) 純化綠色木霉菌株的擴大培養:純化綠色木霉菌株再經液態PDA培養基中擴大培 養，離心去清液，測定活性，再用二級純水洗滌，以8000r/min離心15min，取沉淀并重復一次 擴大培養，離心去清液，測定活性，再用二級純水洗滌，以8000r/min離心15min，取沉淀吹干 后保存于冰箱暗處； (3) 純化綠色木霉菌株的誘變:將步驟(2)中離心后的清液放入TOA培養基中，再以幾丁 質或者結晶羧酸纖維素鈉為反應底物，以秋水仙堿或者硫酸二乙酯作為誘變劑，進行誘變， 誘變終止后，經離心取沉淀物，置于暗處穩定4~6h，即得綠色木霉突變株;其中誘變劑的濃 度為0 · 005~0 · 08wt % ;誘變時間為6~120h。2. 根據權利要求1所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，所述步驟(2)中，按 照重量百分比，液態PDA培養基由以下物質配置而成：馬鈴薯2~3%;魚蛋白粉0.5~3.3%; FeS04 0.01~0.03%;KH2P04 0.02~0.20%;MgS04 0.05~0.35%;Na2B207 *10H20 0.025~ 0.05% ;Na2Se〇3 0.025~0.05%，ZnS〇4 0.01 ~0.02%，余量為水。3. 根據權利要求2所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，所述液態PDA培養 基的pH值調至5.8~6.5，培養溫度為27 ± 1.0°C，培養時間為5天。4. 根據權利要求1所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，所述步驟(3)中，按 照反應底物與發酵物的質量體積比為1 〇g/L，添加反應底物。5. 根據權利要求1所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，所述步驟(3)中，誘 變劑的濃度為〇. 01~〇. 〇5wt%，誘變時間為30~80h。6. 根據權利要求5所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，所述步驟(3)中，誘 變劑的濃度為〇.〇3wt%，誘變時間為48~60h。7. 根據權利要求6所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，所述步驟(3)中，誘 變劑的濃度為〇.〇3wt%，誘變時間為48h。8. 根據權利要求1~7任一所述的綠色木霉突變株的培養方法，其特征在于，還包括(4) 綠色木霉突變株的鑒定，加入濃度為0.5~1.5wt %的蔗糖作引子，啟動孢子的萌發。
【專利摘要】本發明公開了一種綠色木霉突變株的培養方法，包括：先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26℃接種于PDA固體培養基上培養3～5天，篩選并鑒定出綠色木霉菌株，經二代連續培養出純化綠色木霉菌株；再經液態PDA培養基中擴大培養，離心去清液，測定活性，再用二級純水洗滌，離心，取沉淀并重復一次，吹干后保存于冰箱暗處；將離心后的清液放入PDA培養基中，再以幾丁質或者結晶羧酸纖維素鈉為反應底物，以秋水仙堿或者硫酸二乙酯作為誘變劑，進行誘變，誘變終止后，經離心取沉淀物，置于暗處穩定4～6h，即得綠色木霉突變株。該綠色木霉突變株可代替化學農藥運用于農作物的種植，防治由土壤所產生的病害，實現作物增產。
【IPC分類】C12N15/01, C12N1/14, C12R1/885
【公開號】CN105713894
【申請號】CN201610049069
【發明人】李曉白, 蔣立科
【申請人】李曉白