一種扇貝抗氧化肽的制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，通過生物酶解技術制備抗氧化肽的方法，屬于食品科學高新技術領域。
【背景技術】
[0002]扇本發明主要利用生物酶解技術，利用扇貝加工廢棄物制備抗氧化肽，實現扇貝加工廢棄物的綜合利用的目的。
[0003]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案實現的:
本發明是利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶進行水解，制備抗氧化肽的方法，其特點是:
1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；
2)稱取定量扇貝廢棄物，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解扇貝廢棄物，以水解度和抗氧化活性作為評價指標，篩選出制備扇貝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通過響應面法優化酶解工藝條件；
4)酶解產物進一步經過超濾、凝膠色譜層析、反向液相色譜等技術進行分離純化，獲得抗氧化肽，并利用質譜儀測定其分子量范圍。
[0004]本發明具有明顯的優點是:
I)產品活性強。通過此工藝可獲得扇貝抗氧化肽，其超氧陰離子的清除率達到70%以上。
[0005]2)工藝簡單易于實施。本發明只需要經過原料處理和酶解過程即可。
[0006]3)產品實現了無廢棄物加工，通過本發明可以使扇貝廢棄物的附加值得到很大的提高，實現了扇貝無廢棄物加工。
[0007]【具體實施方式】:
下面通過實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明。
[0008]實施例1:
1)將扇貝裙邊進行速凍后搗碎備用；
2)菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標，通過單因素及響應面法優化試驗得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。該工藝條件為反應溫度68.37°C，pH 9.35，底物濃度6.25%，加酶量6000U/g，反應時間6 ho在此最優酶解條件下測定DPPH的清除率達到70.32%。
[0009]3)利用超濾技術對扇貝裙邊酶解液進行初步分離，比較不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)獲得活性肽組分的體外抗氧化活性。結果表明:六種分子量多肽組分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的組分清除DPPH自由基和羥自由基能力最強。
[0010]4)利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對SSPH-Π進行進一步純化得到兩個組分SSPH-n-F^SSPH-n-F2。測定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-11士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分離純化 SSPH-m-Fi 并得到單一組分 SSPH-m-F1-P。
[0011]5) RH-HPLC分離純化SSPH-11-F1，得到SSPH-Π-F沖含量相對較高并且分離效果較好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海灣扇貝裙邊多肽的組分SSPH-11-F1-P7經過在線凈化液相色譜-四級桿靜電場軌道阱串聯質譜儀(Q Exative)分析鑒定可知該組份由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da-1700 Da之間。
[0012]貝是一種海產貝類，屬于軟體動物門、瓣鰓綱、珍珠貝目、扇貝科。世界上共有扇貝60多種。在我國分布的扇貝主要有四種，即櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝及蝦夷扇貝。目前我國沿海人工養殖量最大的是海灣扇貝。自20世紀80年代以來，隨著我國水產養殖業的迅速發展，扇貝的養殖量以及凍貝柱、干貝柱的加工和出口量也越來越大。在加工貝柱的過程中產生了大量的加工廢棄物，小部分扇貝加工廢棄物被作為飼料低價出售，大部分棄于海邊任其腐爛，造成極大的資源浪費和環境污染。扇貝外套膜及加工碎肉是加工扇貝柱時的加工廢棄物，其蛋白含量高、氨基酸組成齊全，綜合開發利用潛力巨大。
[0013]目前，制備活性肽的方法主要有以下幾種:酶解法，微生物發酵法，生物提取法，化學降解法，DNA重組法，化學合成法。(I)酶解法:采用商品蛋白酶對蛋白質進行適度水解，產品安全性高，生產條件溫和，這是目前制備抗氧化肽的主要手段；(2)微生物發酵法:從產酶菌中篩選出抗氧化活性肽高產菌株，將其與原料混合，置于最適條件下發酵，發酵后對發酵產物進行分離純化得到抗氧化肽；(3)生物提取法:存在于細菌、真菌、動植物等生物體內的激素、酶抑制劑等天然活性肽;(4)化學降解法:在密閉的容器里，將原料蛋白質置于適宜濃度的強酸或強堿溶液中，加熱至適宜溫度并持續一段時間后終止反應。該法操作簡單，成本低廉但會生成有毒物質；(5)DNA重組法:獲得抗氧化肽的基因片段，采用分子生物技術使基因在其它生物體上表達，以達到大規模生產；(6)化學合成法:采用液相或固相化學合成法制取，但該法生產成本高，副產物及殘留化合物多等因素而制約其發展。
[0014]本發明采用扇貝加工廢棄物作為主要原料，通過篩選優良的蛋白酶，優化酶解工藝，制備具有較強抗氧化活性的扇貝裙邊酶解產物，進一步分離純化得到活性最強的抗氧化組分，得到抗氧化肽產品，使原料變廢為寶達到綜合利用資源的目的。
[0015]
【發明內容】
[0016]本發明主要利用生物酶解技術，利用扇貝加工廢棄物制備抗氧化肽，實現扇貝加工廢棄物的綜合利用的目的。
[0017]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案實現的:
本發明是利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶進行水解，制備抗氧化肽的方法，其特點是:
1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；
2)稱取定量扇貝廢棄物，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解扇貝廢棄物，以水解度和抗氧化活性作為評價指標，篩選出制備扇貝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通過響應面法優化酶解工藝條件； 4)酶解產物進一步經過超濾、凝膠色譜層析、反向液相色譜等技術進行分離純化，獲得抗氧化肽，并利用質譜儀測定其分子量范圍。
[0018]本發明具有明顯的優點是:
I)產品活性強。通過此工藝可獲得扇貝抗氧化肽，其超氧陰離子的清除率達到70%以上。
[0019]2)工藝簡單易于實施。本發明只需要經過原料處理和酶解過程即可。
[0020]3)產品實現了無廢棄物加工，通過本發明可以使扇貝廢棄物的附加值得到很大的提高，實現了扇貝無廢棄物加工。
[0021]【具體實施方式】:
下面通過實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明。
[0022]實施例1:
1)將扇貝裙邊進行速凍后搗碎備用；
2)菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標，通過單因素及響應面法優化試驗得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。該工藝條件為反應溫度68.37°C，pH 9.35，底物濃度6.25%，加酶量6000U/g，反應時間6 ho在此最優酶解條件下測定DPPH的清除率達到70.32%。
[0023]3)利用超濾技術對扇貝裙邊酶解液進行初步分離，比較不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)獲得活性肽組分的體外抗氧化活性。結果表明:六種分子量多肽組分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的組分清除DPPH自由基和羥自由基能力最強。
[0024]4)利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對SSPH-Π進行進一步純化得到兩個組分SSPH-Π-F^SSPH-n-F2。測定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-Π 士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分離純化 SSPH-m-Fi 并得到單一組分 SSPH-m-F1-P。
[0025]5) RH-HPLC分離純化SSPH-Π -F1，得到SSPH-Π -F沖含量相對較高并且分離效果較好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海灣扇貝裙邊多肽的組分SSPH-11-F1-P7經過在線凈化液相色譜-四級桿靜電場軌道阱串聯質譜儀(Q Exative)分析鑒定可知該組份由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da-1700 Da之間。
【主權項】
1.一種扇貝抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下制備過程: (1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標，通過單因素及響應面法優化試驗得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件，在最優酶解條件下DPPH的清除率達到70%以上； (2)利用超濾技術對扇貝裙邊酶解液進行初步分離，比較不同截留分子量膜包獲得活性肽組分的體外抗氧化活性;利用葡聚糖凝膠Sephadex G_25和反相HPLC分離純化抗氧化肽，對抗氧化活性最高的組分進行在線凈化液相色譜-四級桿靜電場軌道阱串聯質譜儀(QExative)分析鑒定，抗氧化肽由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da?1700 Da之間。
【專利摘要】一種扇貝抗氧化肽的制備方法，本發明選用扇貝加工廢棄物——扇貝外套膜及加工碎肉為主要原料，通過生物酶解技術制備抗氧化肽的方法。以DPPH清除率即抗氧化活性為評價指標，設定反應溫度，pH值，底物濃度為三個待優化因素，利用響應面分析法進行優化分析，得到菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件，在此最優酶解條件下測定DPPH的清除率達到70.32%。所得產品可作為功能食品直接食用或作為附加材料添加到其他食品中，增強保健作用，實現廢棄物綜合環保利用。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/16, C07K1/36, C07K1/34, C07K1/20
【公開號】CN105713945
【申請號】CN201610271264
【發明人】桑亞新, 王向紅, 李榮喬, 李彩, 劉衛華, 韓軍
【申請人】河北農業大學