本申請涉及生物
技術領域：
：，具體地，涉及用于血小板發育研究、血小板減少癥研究及其大規模備選藥物篩選的斑馬魚模型。
背景技術：
：：血小板是血液系統中不可缺少的一部分，它的主要功能是凝血和止血，修補破損的血管。當血小板出現問題時，機體會呈現疾病狀態，例如血小板疾病，是由于血小板數量減少(血小板減少癥)或功能減退(血小板功能不全)導致止血栓形成不良和出血而引起的。血小板減少癥是外周血中血小板減少而導致皮膚粘膜及內臟出血的疾病，是臨床常見的以凝血功能障礙、出血為特點的一組疾病。為了更好地研究血小板的發育和功能，需要尋找到一個能夠特異標記血小板的基因，從而構建血小板特異性標記的轉基因系，實時跟蹤血小板的來源和分化。MPL(MPLproto-oncogene,thrombopoietinreceptor)是促血小板生成素TPO的受體，是一種造血生長因子，在人類與小鼠中調控多種造血祖細胞和血小板的生成。為了更好地研究MPL的功能以及了解人類血小板減少癥特別是胚胎發育期的血小板減少癥的相關機制，需要構建血小板減少癥的突變體，從而建立相應的疾病模型。特別地，現有技術中缺乏作為胚胎發育期的血小板減少癥的模型以及適合大規模穩定篩選血小板減少癥的備選藥物的動物模型。為了更好地研究血小板特別是胚胎發育期的血小板的相關機制，需要構建特異性標記血小板的轉基因斑馬魚，可以利用其進行實時觀察胚胎期血小板的生成以及發育。對血小板的研究非常必要。斑馬魚產卵多，在體外受精，體外發育且早期胚胎透明，適合在胚胎發育期進行觀察以及用于大規模高通量的備選藥物篩選。斑馬魚與人的血液組成以及基因調控機制的相似使得斑馬魚已經被用于研究造血發育1。斑馬魚已經作為疾病模式動物用于闡述一些造血疾病的新的分子機制2和篩選新的藥物3。已有文獻報道CD41可以作為血小板的一個標記物4，文獻中已經構建了一種可以標記血小板的轉基因斑馬魚，并且細胞分選實驗證明CD41:GFPhigh的熒光標記的細胞均為血小板。所以可以利用該轉基因斑馬魚系進行血小板減少的突變體篩選，以及藥物治療的實驗證明。白細胞介素-11(IL-11)為一種造血生長因子,能促進造血干細胞以及巨噬祖細胞的增殖,并且誘導巨噬細胞成熟,從而升高血小板數量。此類藥物用于提升血小板數目在小鼠中已有實驗證明，并且也已經成功運用于臨床治療人類的血小板減少癥5,6。為了方便對血小板的研究、監測血小板相關疾病治療效果等，能夠特異標記血小板的斑馬魚轉基因系尤為重要。技術實現要素：以下是對本文詳細描述的主題的概述。本概述并非是為了限制權利要求的保護范圍。本申請的第一方面提供了一種突變體斑馬魚在制備血小板減少癥的動物模型中的用途，其中所述突變體斑馬魚為mplsmu40突變體。在一些實施方案中，所述血小板減少癥是由mpl基因的敲除引起的。在進一步的實施方案中，所述血小板減少癥可以在通過造血生長因子治療后癥狀緩解，所述造血生長因子優選地是白細胞介素-11(IL-11)。本申請的第一方面還提供了一種突變體斑馬魚在篩選對血小板減少癥有效的藥物中的用途，其中所述突變體斑馬魚為mplsmu40突變體。在一些實施方案中，所述血小板減少癥是由mpl基因的敲除引起的。在進一步的實施方案中，所述血小板減少癥可以在通過造血生長因子治療后癥狀緩 解，所述造血生長因子優選地是白細胞介素-11(IL-11)。在更進一步的實施方案中，所述篩選可以包括以下步驟：(a)以相同濃度的備選藥物處理受精后1天到2.5天，優選2天的所述突變體斑馬魚和野生型同胞魚對照的胚胎；(b)一至兩天后觀察血小板的數目，以確定所述備選藥物對所述血小板減少癥的治療效果。本申請的第一方面還提供了一種利用突變體斑馬魚來篩選對血小板減少癥有效的藥物的方法，其中所述突變體斑馬魚為mplsmu40突變體。在一些實施方案中，所述血小板減少癥是由mpl基因的敲除引起的。在進一步的實施方案中，所述血小板減少癥可以在通過造血生長因子治療后癥狀緩解，所述造血生長因子優選地是白細胞介素-11(IL-11)。在更進一步的實施方案中，所述篩選可以包括以下步驟：(a)以相同濃度的備選藥物處理受精后1天到2.5天，優選2天的所述突變體斑馬魚和野生型同胞魚對照的胚胎；(b)一至兩天后觀察血小板的數目，以確定所述備選藥物對所述血小板減少癥的治療效果。本申請的第一方面還提供了一種突變體斑馬魚在制備凝血功能障礙的動物模型中的用途，其中所述突變體斑馬魚為mplsmu40突變體。在一些實施方案中，所述凝血功能障礙是由mpl基因的敲除引起的。本申請的第一方面主要涉及但不限于：a.通過TALEN靶向基因敲除技術，得到mpl基因序列缺失的突變體斑馬魚。b.胚胎時期，利用標記不同階段髓系細胞的探針進行WISH實驗來檢測詳細的血小板數目的改變，用CD41標記成熟血小板細胞，并進行凝血實驗檢測突變體幼魚的凝血功能。c.作為血小板減少癥的動物模型進行血小板減少癥的藥物篩選。通過獲得的Mpl突變體mplsmu40，發現具有以下表型：①Mpl突變體mplsmu40斑馬魚胚胎血小板數目顯著減少。②同時在幼魚期，Mpl突變體mplsmu40顯著影響了機體內的凝血機制。突變體的凝血時間顯著延長，并且出血量顯著增多。③已經運用白細胞介素11對突變體mplsmu40進行治療，結果證明，白細胞介素11可以有效提高突變體mplsmu40斑馬魚血小板數目。本申請的第一方面相對于現有技術的進步：可以利用斑馬魚進行胚胎期血小板疾病的研究；并且由于其具有穩定遺傳的特性可進行長期疾病追蹤和高通量藥物篩選。利用本發明的斑馬魚Mpl突變體mplsmu40，能夠進行血小板減少癥特別是胚胎發育期的血小板減少癥的研究，以及針對血小板減少癥的治療的備選藥物的大規模篩選。在本申請的第一方面中，Mpl突變體mplsmu40具有穩定遺傳的血小板減少的表型，能夠進行血小板減少癥特別是胚胎發育期的血小板減少癥的研究。此外，本申請的Mpl突變體mplsmu40還可以用來擴展研究血栓、凝血功能障礙等與血小板相關的各種疾病機制。本申請的第二方面提供了一種轉基因斑馬魚在制備血小板及其前體細胞特異性標記的動物模型中的用途，其中所述轉基因斑馬魚為Tg(mpl:eGFP)。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚中，髓系細胞與成熟紅細胞不被特異性標記。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚高表達血小板標記基因，低表達髓系基因和血紅蛋白基因，其中所述血小板標記基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血紅蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚中，GFP+的細胞數目響應于促血小板生成素而顯著增多。本申請的第二方面還提供了一種轉基因斑馬魚在制備凝血實驗的動物模型中的用途，其中所述轉基因斑馬魚為Tg(mpl:eGFP)。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚中，髓系細胞與成熟紅細胞不被特異性標記。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚高表達血小板標記基因，低表達髓系基因和血紅蛋白基因，其中所述血小板標記基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血紅蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚中，GFP+的細胞數目響應于促血小板生成素而顯著增多。本申請的第二方面還提供了一種轉基因斑馬魚在制備用于篩選增加 血小板數目的藥物的動物模型中的用途，其中所述轉基因斑馬魚為Tg(mpl:eGFP)。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚中，髓系細胞與成熟紅細胞不被特異性標記。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚高表達血小板標記基因，低表達髓系基因和血紅蛋白基因，其中所述血小板標記基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血紅蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些實施方案中，所述轉基因斑馬魚中，GFP+的細胞數目響應于促血小板生成素而顯著增多。本申請的第二方面進一步提供一種用mpl基因標記的轉基因斑馬魚，可以特異性標記血小板，可以用此轉基因斑馬魚實時觀察血小板的產生、成熟、分化、以及血栓形成等。所述mpl基因標記的轉基因斑馬魚還可以用于各種針對血小板相關疾病的治療的藥物效果監測，并可以利用斑馬魚的獨特優勢進行實時觀察藥物療效。所述mpl基因標記的轉基因斑馬魚作為極為方便快捷的動物模型，對于研究血小板的發育和功能來說更具有優勢。所述轉基因斑馬魚為Tg(mpl:eGFP)。本申請的第二方面主要涉及：a.通過Tol2轉座子介導技術，得到pTol2-mplpromoter–eGFP轉基因斑馬魚。b.胚胎時期，利用不同轉基因系斑馬魚細胞標記進行抗體染色共染來檢測mpl:eGFP標記的細胞是否為血小板。同時也利用熒光細胞分選方法比較不同血細胞轉基因系的細胞特異標記基因的差別。并與已知的Tg(CD41:eGFP)轉基因系標記的血小板細胞和造血干細胞進行比較。c.檢驗mpl:eGFP是否標記為血小板細胞，進行血管損傷實驗，以及Tpo(促血小板生成素)誘導增殖實驗。通過獲得的Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚，發現具有以下表型：①mpl:eGFP轉基因系得到可遺傳的F0代轉基因斑馬魚(F0代特指篩選到的第一代可遺傳的轉基因母本或父本)，標記的細胞所在位置與mpl探針原位雜交表達位置相同。②通過與髓系轉基因系和紅系轉基因系斑馬魚比較，細胞分選結果 表示，mpl:eGFP+細胞高表達血小板表面蛋白基因，低表達其他譜系的基因。抗體染色結果表明，mpl:eGFP+不與髓系或者血紅蛋白共同表達。與已知的CD41:eGFP+細胞比較，mpl:eGFP+的細胞更高表達血小板標記基因。③損傷實驗表明，在損傷情況下mpl:eGFP+的細胞會到傷口處，作為血小板的功能表現之一。在Tpo的刺激下，mpl:eGFP+的細胞響應Tpo信號，呈現出顯著增多狀態。④藥物處理實驗表明，在給予血小板增多藥物白細胞介素-11處理以后，表現出mpl:eGFP+細胞增多，證明了血小板增多藥物的有效性。本申請可以很好的展示斑馬魚實時觀察的優勢，將血小板特異性標記出來，對以后的血小板發育研究以及相關疾病研究以及臨床用于增加血小板數目的藥物篩選提供了很好的動物模型。在本申請中，Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚系能夠將斑馬魚血小板前體細胞和血小板特異性標記為綠色。該轉基因系確實具有穩定遺傳的血小板熒光標記，可以被用來擴展研究血小板的產生，分化，成熟，功能(例如血栓的形成)，以及與血小板相關的各種疾病機制和進行藥物篩選。通過獲得的Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚，發現具有以下用途：①綠色熒光特異性標記了斑馬魚血小板。②熒光信號從斑馬魚胚胎受精后2天開始出現，此后逐漸增多。③該轉基因系成為一個目前為止最特異性標記血小板的轉基因斑馬魚系。為血小板的發育以及功能的研究和藥物篩選提供了一個極為簡便的工具。本文所使用的術語“dpf”指受精后的天數。舉例來說，“3dpf”指受精后第三天，“8dpf”指受精后第八天。本文所使用的術語“hpf”指受精后的小時數。舉例來說，“72hpf”指受精后第72小時。本申請所使用的術語“GFP+”是指具有綠色熒光的細胞。本文所使用的術語“野生型”或者“WT”都是指野生型斑馬魚。附圖說明圖1：TALEN靶向基因敲除技術獲得斑馬魚突變體mplsmu40，是一種血小板減少的突變體(A)TALEN靶向基因敲除設計方案，選擇斑馬魚mpl基因轉錄本mpl-001(ENSDART00000124917)，1號外顯子序列作為靶點進行基因敲除。(B)經測序得到突變體mplsmu40在靶點位置序列-8bp+48bp的突變，并且突變后Mpl蛋白提前終止，缺失重要功能區域。(C)免疫化學染色結果。尾部信號點為CD41:eGFPhigh的細胞，標記成熟血小板。突變體mplsmu40中，信號點明顯減少，說明成熟血小板數目明顯減少。(D)WISH檢測野生型同胞魚和突變體mplsmu40的mpl基因表達，突變體mplsmu40中mpl基因的mRNA表達量顯著減少。尾部局部放大框為100×放大倍數。(E)血小板相關基因的mRNA表達量結果，黑色柱子代表野生型同胞魚，灰色柱子代表突變體mplsmu40。橫坐標所示這些基因的mRNA表達量在突變體mplsmu40中都明顯下調(每組n＝30)。統計學差異由t-檢驗得出，ns沒有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2：斑馬魚突變體mplsmu40在凝血實驗中表現為凝血功能障礙(A)針刺3dpf的斑馬魚胚胎尾部血管，圖示為血液停止流出時的尾部視野野生型同胞魚(WT，左欄)和突變體(mplsmu40，右欄)，突變體mplsmu40出血量較多，傷口凝血塊較大。(B)凝血實驗處理野生型同胞魚和突變體mplsmu40各組至少10條，顯微鏡下觀察其從損傷開始至流血停止的時間。分別在3dpf和6dpf時處理，統計分析凝血時長，突變體mplsmu40尾部血管凝血時長顯著多于野生型同胞魚(每組n≥10)。統計學差異由t-檢驗得出，ns沒有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3：白細胞介素-11(IL-11)可以有效提高斑馬魚突變體mplsmu40的血小板數目(A)上圖為未注射IL-11的突變體mplsmu40對照組，下圖為注射IL-11后的突變體mplsmu40處理組，圖示信號點為CD41:eGFPhigh的細胞，代表血小板的數目。注射IL-11后的突變體mplsmu40信號點明顯增多。(B、C)對 野生型與突變體mplsmu40同時進行IL-11注射，黑色柱子代表對照組(僅注射蒸餾水)，灰色柱子代表IL-11注射組(注射IL-11)。(B)中結果顯示注射IL-11使得野生型同胞魚中cd41基因的mRNA表達量相對于對照組增多約40％(P＝0.016)；(C)中結果顯示，注射IL-11使得突變體mplsmu40中cd41基因的mRNA表達量相對于對照組增多約97％(P＝0.005)。結果說明，突變體mplsmu40響應于IL-11的治療，并且與在野生型同胞魚中的作用相比，IL-11能夠顯著更多地提升突變體mplsmu40的血小板數目。圖4：利用Tol2轉座子介導技術，pTol2-mplpromoter-eGFP轉基因斑馬魚的獲得(A)Tol2轉座子介導技術設計方案，選擇斑馬魚mpl基因轉錄本mpl-201(ENSDART00000057297)，二號外顯子ATG序列為止，向前4641bp作為mpl啟動子區域。(B)上方小圖標出了斑馬魚胚胎期造血部位示意圖。AGM:主動脈-性腺-中腎；CHT：尾部血島；下圖左側為野生型胚胎2.5dpfAGM區域和2.5dpf及5dpfCHT區域mpl基因原位雜交的圖示；右側為Tg(mpl:eGFP)胚胎進行GFP抗體染色結果。兩者表達部位結果相同。(C)在Tg(mpl:eGFP)胚胎中進行GFP與Lcp1(髓系細胞表達基因)抗體共染結果，上：紅色為Lcp1+細胞，中：綠色為GFP+細胞，下：為兩者疊加在一起的圖示，結果為沒有任何重疊細胞。說明Lcp1與GFP沒有共同表達的細胞，即GFP不標記髓系細胞。(D)在Tg(mpl:eGFP)胚胎中進行GFP與Hbae1(α血紅蛋白，標記所有成熟紅細胞)抗體共染，上：紅色為Hbae1+細胞，中：綠色為GFP+細胞，下：為兩者疊加在一起的圖示，結果為沒有任何重疊細胞。說明Hbae1與GFP沒有共同表達的細胞，即GFP不標記成熟紅細胞。(E)本申請實施例5的Tg(mpl:eGFP)與Tg(coronin1a:eGFP)的胚胎分別進行GFP流式細胞分選，其中coronin1a標記所有髓系細胞。兩者GFP+細胞進行qPCR的檢測結果。結果顯示mpl-GFP+細胞與coronin1a-GFP+細胞相比，高表達血小板基因cd41，而低表達或不表達髓系細胞表達的基因。(F)Tg(mpl:eGFP)與Tg(gata1:DsRed)的胚胎分別進行綠色熒光GFP和紅色熒光DsRed流式細胞分選，其中gata1標記所有紅系細胞。兩者GFP+和DsRed+細胞進行qPCR的檢測結果。結果顯示 mpl-GFP+細胞與gata1-DsRed+細胞相比，高表達血小板基因cd41和lrrc32，而低表達血紅蛋白基因(hbbe1、hbae1)(每組n＝30)。統計學差異由t-檢驗得出，ns沒有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(G)Tg(mpl:eGFP)與Tg(CD41:eGFP)的胚胎分別進行GFP流式細胞分選，其中cd41標記斑馬魚造血干細胞和血小板細胞。兩者GFP+細胞進行qPCR的檢測結果。結果顯示mpl-GFP+細胞與CD41-GFP+細胞，雖然均高表達血小板標記基因(從左至右依次：gp9、kif1b、lrrc32、nfe2)，但這些血小板標記基因在mpl-GFP+細胞中比在CD41-GFP+細胞中的表達顯著更高。圖5：Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚標記細胞為血小板細胞，可以響應于損傷反應以及Tpo和白細胞介素-11。(A)在4dpfTg(mpl:eGFP)的胚胎中進行血管損傷實驗，損傷部位為頸部血管，GFP+的細胞響應損傷，并可抵達損傷部位，這為血小板功能之一。(B)在Tg(mpl:eGFP)的胚胎中顯微注射tpo的mRNA，3dpf的胚胎中，GFP抗體染色的結果顯示，注射了tpomRNA的胚胎顯著增多了GFP+的細胞數目。(C)與已轉入Tg(mpl:eGFP)轉基因背景的同胞魚野生型Tg(mpl:eGFP)相比，在血小板減少的mplsmu40；Tg(mpl:eGFP)突變體中mpl-GFP+細胞顯著減少。(D)白細胞介素-11可以顯著地提升Tg(mpl:eGFP)中mpl-GFP+細胞數目。每組n≥10，統計學差異由t-檢驗得出，ns沒有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。在閱讀并理解了附圖和詳細描述后，可以明白其他方面。具體實施方式下面將以實施例的方式對本申請作進一步的詳細描述，以使本領域技術人員能夠實踐本申請。應當理解，可以采用其他實施方式，并且可以做出適當的改變而不偏離本申請的精神或范圍。為了避免對于使本領域技術人員能夠實踐本申請來說不必要的細節，說明書可能省略了對于本領域技術人員來說已知的某些信息。因此，以下詳細描述不應以限制性的意義來理解，且本發明的范圍僅由所附權利要求界定。以下的實施例便于更好地理解本申請，但并不用來限制本申請的范圍。下述實施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。材料與方法TALEN靶向基因敲除技術TALEN靶點識別模塊由北京唯尚立德生物科技有限公司構建，將TALEN質粒對通過顯微注射方法注射到斑馬魚胚胎單細胞中可實現靶基因敲除7。實驗中，設計了斑馬魚mpl基因轉錄本mpl-001,一號外顯子上的一段序列TTTGGGATGCACCT(SEQIDNO:1)作為TALEN間隔區域，合成左右兩邊的靶點識別TALEN模塊質粒，對其進行定向敲除。Tol2轉座子介導技術啟動子序列從NCBI獲取，斑馬魚mpl基因轉錄本mpl-201二號外顯子ATG序列為止，向前4641bp作為mpl啟動子區域。將啟動子序列和eGFP序列與轉座子序列連接、克隆、轉化，終制備成pTol2-mplpromoter-eGFP質粒。斑馬魚突變體篩選TALEN顯微注射得到的第一代突變體為F0代，將每個F0代個體與野生型雜交得到F1代，將F1代成魚剪尾測序得到不同序列插入或者缺失的突變體，利用mpl原位雜交信號是否減少，CD41:GFP熒光信號是否減少進行表型篩選，經過測序，得到靶點間隔區域序列突變(-8bp+48bp)(TTTGAAAAGACTTTGAAGACTTGAAAAGACTTTTGCTTTTGAAAAGACTTTGCT)(SEQIDNO:2)的mplsmu40突變體斑馬魚。斑馬魚轉基因系篩選pTol2-mplpromoter-eGFP顯微注射得到的第一代突變體為F0代，F0代于3dpf到4dpf挑出帶有熒光標記、并且熒光表達位置正確的胚胎，將每個GFP+F0代個體培養至個體性成熟，與野生型雜交得到F1代，同時檢測F1代3-4dpf胚胎是否穩定遺傳熒光標記。經過熒光標記表型篩選， 得到穩定遺傳的標記斑馬魚血小板的轉基因斑馬魚品系Tg(mpl:eGFP)。斑馬魚的飼養與繁殖野生型、突變體mplsmu40斑馬魚和轉基因斑馬魚系Tg(mpl:eGFP)的培養方法如現有技術所述8。對于本文中提及的所有實驗，斑馬魚胚胎均被置于含有0.003％苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)以及0.002％美蘭的胚胎培養液中，以去除胚胎色素。整體原位雜交(whole-mountinsituhybridization,WISH)地高辛標記的反義RNA探針的合成以及WISH操作均按照標準實驗操作流程完成9。使用的mpl探針序列為：AACAGCAGGTGACATAGAGTTCAGGTGCCACACTTCTGATCTGATTCAAATCATTTGCAAATGGAGGGGAGACTTATATAAGGACAATACATACAGCTTCTACTATAAACAATTAAACAGAAGTTCATGGAGCAGTTGGAAGTTGTGTCCCAATTGCAATAACTCCATCCATCAGTGTGTCCTGTATGGCCAGAAGTCCAATGTCTTTAAGTTTTACCTCAATACAGGGTTGCAACCATTCAGCCGAACATTTTATGCAGAGACTTTCTATATGAACAGTAAAGTTCAGACAAGGCCTCCAGAAGGTCTGAAGGTACAGATTGGGGAAGAAAGGCTTTGTTTGACATGGGATTCACCATTTCTGATCATTTCTAAGCATCTAATGTACCAGATCCGTTATCAGCATCATGAAGAGAATCAGTGGAAGGGTTTTAAAGCTTCTGGATCCAAGACCAGCACTTGTCTAGATGTGCACAGAGGGGGTCGATACACCATCCAGGTTCGAGCACAACCCAATGGATCTGTGTACAGCGGAAACTGGAGTGACTGGTCAAAACCTGTTACAACCAACCTACCTTTAAGCAAAGAGTGGATTATTTTTGTTTGCATACCAGTGGCTCTGATCATCATTGCAACTGCAGTCATCTCTTTCTTCTCCAGATACTTCCGAAAGGTCAAGAGGTCCCTGTGGCCACCAGTACCAAACCTTAACAAGGTCCTGGAAAACATCCTGACTGATATCAGTGGATCACACTGGGAGCCAACCTTCAACATTAAGCAATGTGATGATGACACTGCTACATCAGTGGTGGAGGTTCTCACTGAGGGGGAATCTGCGGTCAAAACCTGTAAGAACACCTGTCCTCTGCTCTCTGAGCACAGTGAAAAACATGGAGAACATTTCAGAGAGGACTTGGAAATGGCGCAAGATTATGTGATTTTGA ACAACAATATAATCCCCTGCCTTACGGGAAACGACTACGTGTATAAGGATGTTGCTTCAACACATCTGGCCAATGAAAAACAACACTCTTGCTCCAGCACTTCTTACACCTCCCTACCAGATCACACCACAGATATTCTCAACCAATCCTATCTCCTTTTGGCAGAACAATCCGATCTTGGGGCGTATCAAACAACCTGTGGCCAGTACACCAATCTGGAGATCACAGCAGTATCATGTGTAGCAATTGGAGAGTGAGGTTTACTGTCAAAATGAAGCTCATAATCATGTATATATTAAGGGTTCTCTCACAAATGTAAAAAAGACATTCAGTTTCTGTGGAATGAATGAGAAACAAAGGAAAAGCAAAGCTTACGTTAATGGAGCACTTATGAAGGTAATC(SEQIDNO:17)。免疫化學染色(Immunochemistrystaining)運用Anti-GFPantibody(Biotin)(ab6658)一抗(購買自abcam公司)，Donkeyanti-GoatIgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa488conjugate二抗(購買自invitrogen公司)，donkeyanti-rabbitAlexa-555(購買自Invitrogen)，以及Lcp1和Hbae1一抗(由香港科技大學饋贈)10，將突變體mplsmu40與轉基因品系斑馬魚Tg(CD41:eGFP)交配4，從而獲得帶有Tg(CD41:eGFP)轉基因背景的突變體mplsmu40。對其進行免疫化學染色，操作方法如本領域已知的11；利用同樣方法對帶有Tg(mpl:eGFP)轉基因背景的斑馬魚系進行免疫化學染色，熒光顯微鏡下觀察高亮綠色熒光的細胞，其數量將代表血小板細胞的數量。qRT-PCR使用RocheTripureRNAIsolationReagent(購買自Roche公司)來提取斑馬魚胚胎的總RNA，其操作步驟按照相關說明執行。使用M-MLV反轉錄酶(Promega)，來制備cDNA，其操作步驟按照相關說明執行。用斑馬魚基因β-actin作為內參進行qRT-PCR，操作方法如本領域已知的12。qRT-PCR引物序列斑馬魚尾部凝血實驗利用0.03mm直徑的顯微注射用針(borosilicateglasscapillaries1B100F-4，購買自WorldPrecisionInstrumentsInc公司)，作為損傷工具，選取受精后72至84小時的斑馬魚胚胎進行尾部凝血實驗。將斑馬魚胚胎放在含有0.02％三卡因(tricaine)的胚胎培養液中麻醉，然后置于瓊脂糖平板上。利用顯微注射從尾部內側血管區域進行針刺損傷。數量為野生型同胞魚和突變體mplsmu40各110條以上。顯微鏡下觀察計時，從損傷開始到凝血塊形成，流血停止。藥物實驗選用齊魯制藥有限公司生產的巨和粒注射用重組人白細胞介素-11，選取受精后48-52hpf的斑馬魚胚胎進行藥物注射。選取頸部或者卵黃囊表面血管注射。濃度為6μg/μL，每個胚胎用藥約5ng。觀察一天后，對斑馬魚胚胎進行血小板計數。斑馬魚頸部凝血實驗利用0.03mm直徑的顯微注射用針(borosilicateglasscapillaries 1B100F-4，購買自WorldPrecisionInstrumentsInc公司)，作為損傷工具，選取受精后4dpf的斑馬魚胚胎進行頸部凝血實驗。將斑馬魚胚胎放在含有0.02％三卡因(tricaine)的胚胎培養液中麻醉，然后置于瓊脂糖平板上。利用顯微注射從頸部卵黃囊上側血管區域進行針刺損傷。數量為10條以上。從損傷開始到血小板到達損傷處血栓形成在顯微鏡下觀察計時。Tpo實驗選用mMSSAGEmMACHINESP6Kit(AM1340)購買自公司，體外合成tpomRNA，選取受精后1個細胞時期的Tg(mpl:eGFP)斑馬魚胚胎，進行單細胞顯微注射。濃度為800g/μL，每個胚胎用量約400pg。觀察3天后，對斑馬魚胚胎進行GFP抗體染色。流式細胞分選選取各轉基因系斑馬魚即Tg(mpl:eGFP)、Tg(coronin1a:eGFP)10全部髓系細胞特異性標記轉基因系、Tg(gata1:DsRed)13全部紅系細胞特異性標記轉基因系、Tg(CD41:eGFP)4血小板以及造血干細胞標記轉基因系斑馬魚，于4dpf時期，各轉基因系取200個以上的斑馬魚胚胎進行綠色熒光或者紅色熒光細胞分選實驗，實驗具體方法參照文獻所述14。實施例1.mpl基因序列缺失的突變體斑馬魚的獲得本實驗中，設計了斑馬魚mpl基因轉錄本mpl-001ENSDART00000124917,一號外顯子上的一段序列TTTGGGATGCACCT作為TALEN間隔區域，合成左右兩邊的靶點識別TALEN模塊質粒，對其進行定向敲除，得到了一個缺失8bp、插入48bp的Mpl蛋白提前終止的突變體mplsmu40(參見圖1A、圖1B)。mpl基因表達為了檢測突變的有效性，以mpl作為標記血小板和血小板前體細胞的標記基因。利用原位雜交技術，檢測3dpf的野生型同胞魚和mplsmu40突變體中mpl基因的mRNA表達情況。結果如圖1D中所示，信號點代表mpl基因的mRNA表達情況。結果顯示，突變體mplsmu40中的mpl基因的mRNA表達量與野生型同胞魚相比 有非常明顯的減少。實施例2.本發明實施例1的突變體斑馬魚可作為血小板減少癥的動物模型血小板數目取5dpf的斑馬魚胚胎，將突變體mplsmu40與轉基因品系斑馬魚Tg(CD41:eGFP)交配4，獲得帶有Tg(CD41:eGFP)轉基因背景的突變體。對野生型同胞魚進行同樣處理。對帶有Tg(CD41:eGFP)轉基因背景的mplsmu40突變體和野生型同胞魚進行免疫化學染色，在熒光顯微鏡下觀察血液中流動的血小板中高亮熒光的細胞，信號點為CD41:eGFPhigh的信號點，其數量將代表血小板細胞的數量。結果如圖1C所示，mplsmu40突變體中血小板數目與野生型同胞魚相比大幅度減少。多個與血小板相關的基因的mRNA表達選取了mpl、cd41、lrrc32、gp1bb、fog1、nfe2這些已有文獻報道與血小板相關的基因15-18，對5-dpf野生型同胞魚與突變體mplsmu40斑馬魚胚胎進行熒光定量PCR實驗。這些基因中，Lrrc32、Gp1bb都是血小板膜蛋白；Fog1與Nfe2，是與哺乳動物巨核細胞產生和成熟相關的轉錄調控因子。結果如圖1E所示，表明，這些基因在突變體mplsmu40中的mRNA水平都顯著低于野生型同胞魚，說明突變體mplsmu40確實是血小板減少的突變體。總之，以上結果表明，在突變體mplsmu40中，由于mpl基因的敲除，血小板的數目顯著減少。由此，本發明實施例1的mplsmu40突變體可作為血小板減少癥的動物模型。實施例3.利用本發明實施例1的突變體斑馬魚進行由血小板減少癥引起的凝血功能障礙模型構建。由于突變體mplsmu40表現為血小板減少，所以可以用該突變體來研究血小板對斑馬魚止凝血的作用，進而構建斑馬魚凝血功能障礙實驗模型19。 首先利用3dpf的斑馬魚胚胎，每組至少10條，分別對野生型同胞魚組和突變體mplsmu40組的斑馬魚進行尾部血管針刺損傷，通過光學顯微鏡鏡下20倍觀察血管損傷后傷口血塊大小，并記錄每一條斑馬魚胚胎從損傷開始出血的時間到出血停止的時間。圖2A所示為血管損傷后傷口血塊大小，左圖為野生型同胞魚，右圖為突變體mplsmu40，可以明顯區別出相比于野生型同胞魚，mplsmu40突變體損傷后傷口出血量較多，傷口附近形成的血塊較大。凝血時長的具體實驗數據見下表。分別對3-dpf和6-dpf的斑馬魚進行實驗，對數據進行了兩樣本t檢驗，以確定野生型同胞魚組和突變體mplsmu40組兩組間是否存在顯著性差異。結果見圖2B，所示為每組凝血時長的統計圖。mplsmu40突變體的凝血時長顯著地比野生型同胞魚更長。以上結果表明，mplsmu40突變體可作為血小板減少導致的凝血功能障礙的模型，以利于后續研究。實施例4.利用本發明實施例1的突變體斑馬魚進行備選藥物篩選由于mplsmu40突變體表現為血小板減少，所以選取了臨床針對血小板減少癥的常用藥物對其進行藥物治療。選擇了IL-11，其通過增加血系祖 細胞的增殖來得到血小板增加的效果。如圖3A所示，IL-11注射一天后，觀察突變體中血小板的數目。上圖為對照組(僅僅注射蒸餾水)，下圖為注射IL-11組，可以明顯看到CD41:eGFPhigh信號點增多。同時還使用qPCR實驗進行定量分析，結果如圖3B-C所示，在野生型同胞魚和突變體mplsmu40中注射IL-11后均出現cd41基因的mRNA的表達量上調，但在突變體mplsmu40中的上調倍數顯著更大97％(P＝0.005)，相比于野生型同胞魚中的40％(P＝0.016)。圖3B-C的結果說明，突變體mplsmu40響應于IL-11的治療，并且與在野生型同胞魚中的作用相比，IL-11能夠顯著更多地提升突變體mplsmu40的血小板數目。以上結果表明，可以利用本發明的mplsmu40突變體作為動物模型，對那些針對mpl基因缺陷引起的血小板減少癥的備選治療藥物進行藥物篩選。實施例5.Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚的獲得本實驗中，設計了斑馬魚mpl基因轉錄本mpl-201二號外顯子ATG序列為止，向前4641bp作為mpl啟動子區域，將此段序列(SEQIDNO:30)插入到pTol2轉座子質粒中，合成pTol2-mplpromoter-eGFP，對野生型斑馬魚胚胎DNA進行基因插入，得到了一個能夠特異性標記血小板的轉基因斑馬魚系Tg(mpl:eGFP)。圖4A示出了Tol2轉座子介導技術設計方案。圖4B中，上方小圖標出了斑馬魚胚胎期造血部位示意圖，其中AGM:主動脈-性腺-中腎；CHT：尾部血島。下方的圖中，左側為野生型胚胎2.5-dpfAGM區域及2.5-dpf和5-dpfCHT區域mpl基因原位雜交的結果，右側為對轉基因斑馬魚系Tg(mpl:eGFP)胚胎進行GFP抗體染色的結果。兩者表達部位結果相同，說明GFP的熒光表達位置確實是mpl基因表達的位置。以上結果表明，獲得了轉基因斑馬魚系Tg(mpl:eGFP)。實施例6.本發明實施例5的轉基因系斑馬魚的特征的研究mpl不標記成熟紅細胞和髓系細胞取4dpf的斑馬魚胚胎Tg(mpl:eGFP)，對其進行免疫化學染色，在熒 光顯微鏡下觀察Lcp1(髓系細胞)20與Hbae1(成熟紅細胞)21染色結果，信號點分別為Lcp1、Hbae1與mpl-GFP+的信號點，其數量將代表各類細胞的數量。結果如圖4C-D所示，Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚胚胎中不存在mpl與lcp1或mpl與hbae1共同表達的細胞。說明，本發明的Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚系Tg(mpl:eGFP)中，髓系細胞和成熟紅細胞沒有被特異性標記。與已存在的斑馬魚轉基因系比較，mpl-GFP+細胞高表達血小板標記基因，低表達其他譜系基因。以mpl作為標記血小板和血小板前體細胞的標記基因，coronin1a作為標記髓系細胞的標記基因，gata1作為標記全部紅系細胞的標記基因，利用流式細胞分選技術，檢測4dpf的Tg(coronin1a:eGFP)10，Tg(gata1:DsRed)13，Tg(CD41：eGFP)4和本發明實施例5的Tg(mpl:eGFP)中DsRed+細胞和GFP+中的mRNA表達情況。結果如圖4E-F所示，Tg(mpl:eGFP)中GFP+的細胞均高表達血小板基因(cd41，lrrc32)，低表達或不表達髓系基因(mpo，lyz，mfap4)22-24和血紅蛋白基因(hbbe1，hbae1)21。結果顯示，mpl不標記成熟紅細胞和髓系細胞。進一步地，選取了gp9、lrrc32、kif1b、nfe215,17,18,25這些已有文獻報道與血小板相關的基因，對4-dpfTg(CD41:eGFP)4和本發明實施例5的Tg(mpl:eGFP)斑馬魚胚胎分別進行綠色熒光蛋白GFP流式分選，將分選得到的細胞進行熒光定量PCR實驗。結果如圖4G所示，表明，這些與血小板相關的基因在mpl-GFP+的細胞中比在CD41-GFP+的細胞中具有顯著更高的表達，說明本發明實施例5的Tg(mpl:eGFP)轉基因系斑馬魚確實是更特異標記血小板的轉基因系斑馬魚。實施例7.利用本發明實施例5的轉基因系斑馬魚進行凝血模型和Tpo以及白細胞介素-11增殖血小板響應機制構建。由于本轉基因系斑馬魚可以很好地熒光可視化標記的血小板，所以可 以用此轉基因品系來研究血小板對斑馬魚止凝血的作用，從而構建斑馬魚凝血實驗模型19。首先利用4dpf的斑馬魚胚胎，每組至少10條，對本發明實施例5的Tg(mpl:eGFP)轉基因系斑馬魚胚胎進行頸部血管針刺損傷，通過光學顯微鏡下64倍觀察血管損傷后GFP+細胞是否到達損傷處。如圖5A所示，血管損傷后mpl-GFP+的細胞可到達損傷處，作為血小板的功能之一，左圖為損傷后1min，右圖為3min，3min血栓面積比1min血栓面積大，說明血栓面積隨時間增大。由于血小板主要生成途徑為Tpo/Mpl，當給予Tpo時，血小板會響應于Tpo而大量增殖26。通過免疫熒光染色技術，在Tg(mpl:eGFP)中注射tpomRNA以后，觀察mpl-GFP+的細胞數目是否會明顯增多。如圖5B所示，對單細胞時期Tg(mpl:eGFP)進行顯微注射tpomRNA，檢測3dpfTg(mpl:eGFP)斑馬魚胚胎GFP+細胞增殖情況。結果顯示，Tpo使得GFP+的細胞明顯增多。利用本發明實施例1的突變體斑馬魚mplsmu40，我們觀察了在血小板減少癥模型當中mpl-GFP+細胞是否會減少。如圖5C所示，通過免疫熒光染色技術檢測mplsmu40；Tg(mpl:eGFP)(將實施例1的mplsmu40純合突變體與實施例5的Tg(mpl:eGFP)轉基因系斑馬魚雜交，對其后代篩選得到既有mplsmu40基因突變又具有Tg(mpl:eGFP)轉基因背景的斑馬魚系，將其命名為mplsmu40；Tg(mpl:eGFP))中，4-dpf斑馬魚胚胎GFP+細胞與已轉入Tg(mpl:eGFP)轉基因背景的野生型同胞魚相比，統計結果顯示GFP+細胞數目顯著減少。我們還研究了白細胞介素-11作為增加血小板的藥物之一，是否也可以作用于Tg(mpl:eGFP)，使得GFP+的細胞增多。如圖5D所示，通過免疫熒光染色技術檢測在注射了IL-11的斑馬魚胚胎Tg(mpl:eGFP)中，相比于對照組，GFP+細胞顯著增多，結果說明本發明Tg(mpl:eGFP)轉基因斑馬魚可作為血小板藥物篩選模型。以上結果表明，Tg(mpl:eGFP)轉基因系確實可作為血小板特異性標記的可視化模型，以利于后續研究。綜上所述，以上僅為本申請的較佳實施例而已，并非用于限定本申請的保護范圍，因此，凡在本申請的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護范圍之內。參考文獻1.OrkinSH,ZonLI.Hematopoiesis:anevolvingparadigmforstemcellbiology.Cell.2008；132:631-644.2.StoletovK,KlemkeR.Catchoftheday:zebrafishasahumancancermodel.Oncogene.2008；27:4509-4520.3.SuzanneR,HeatonWL,DeepaJ,etal.Zebrafishscreenidentifiesnovelcompoundwithselectivetoxicityagainstleukemia.Blood.2012；119:5621-5631.4.LinHF.AnalysisofthrombocytedevelopmentinCD41-GFPtransgeniczebrafish.Blood.2005；106:3803-3810.5.PeetersK,StassenJ,CollenD,VanGeetC,FresonK.Emergingtreatmentsforthrombocytopenia:Increasingplateletproduction.DrugDiscovToday.2008；13:798-806.6.Thrombocytopeniainthenewborn.CurrOpinPediatr.1992；88:217-218.7.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ,LinS,ZhangB.HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.NatBiotechnol.2011；29:699-700.8.WesterfieldM.Thezebrafishbook:aguideforthelaboratoryuseofzebrafish(Daniorerio):M.Westerfield；2007.9.ThisseC,ThisseB.Thisse,C.&Thisse,B.High-resolutioninsituhybridizationtowhole-mountzebrafishembryos.Nat.Protoc.3,59-69.NatureProtocol.2008；3:59-69.10.LiL,YanB,ShiYQ,ZhangWQ,WenZL.LiveImagingRevealsDifferingRolesofMacrophagesandNeutrophilsduringZebrafishTailFinRegeneration.JBiolChem.2012；287:25353-25360.11.JinH,SoodR,XuJ,etal.Definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishVDAandPBI.Development.2009；136:1397.12.WangK,FangX,MaN,etal.Myeloperoxidase-deficientzebrafishshowanaugmentedinflammatoryresponsetochallengewithCandidaalbicans.FishShellfishImmun.2015；44:109-116.13.YaqoobN,HolottaM,PremC,KoppR,SchwerteT.Ontogeneticdevelopmentoferythropoiesiscanbestudiednon-invasivelyinGATA-1:DsRedtransgeniczebrafish.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA:Molecular&IntegrativePhysiology.2009；154:270-278.14.DuL,XuJ,LiX,etal.RumbaandHaus3areessentialfactorsforthemaintenanceofhematopoieticstem/progenitorcellsduringzebrafishhematopoiesis.Development.2011；138:619-629.15.LANGMR,GIHRG,GAWAZMP,MLLERII.HemostasisinDaniorerio:isthezebrafishausefulmodelforplateletresearch？JThrombHaemost.2010；8:1159-1169.16.Timme-LaragyAR,KarchnerSI,FranksDG,etal.Nrf2b,NovelZebrafishParalogofOxidant-responsiveTranscriptionFactorNF-E2-relatedFactor2(NRF2).JBiolChem.2012；287:4609-4627.17.AmigoJD,AckermannGE,CopeJJ,etal.TheroleandregulationoffriendofGATA-1(FOG-1)duringblooddevelopmentinthezebrafish.Blood.2009；114:4654-4663.18.O'ConnorMN,SallesII,CvejicA,etal.Functionalgenomicsinzebrafishpermitsrapidcharacterizationofnovelplateletmembraneproteins.Blood.2009；113:4754-4762.19.JagadeeswaranP,LiuYC.Ahemophiliamodelinzebrafish:analysisofhemostasis.BloodCellsMolDis.1997；23:52-57.20.JinH,SoodR,XuJ,etal.Definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishVDAandPBI.Development.2009；136:1397.21.AlisonB,CandaceH,OatesAC,etal.Characterizationofembryonicglobingenesofthezebrafish.DevBiol.2003；255:48-61.22.BermanJN,KankiJP,AThomasL.Zebrafishasamodelformyelopoiesisduringembryogenesis.ExpHematol.2005；33:997-1006.23.LieschkeGJ,OatesAC,CrowhurstMO,WardAC,LaytonJE.Macrophagesinembryonicandadultzebrafish:morphologicandfunctionalcharacterization.Blood.2001；98:3087-3096.24.ZakrzewskaA,CuiC,StockhammerOW,BenardEL,SpainkHP,MeijerAH.Macrophage-specificgenefunctionsinSpi1-directedinnateimmunity.Blood.2010；116:e1-e11.25.ShivdasaniRA,RosenblattMF,Zucker-FranklinD,etal.TranscriptionfactorNF-E2isrequiredforplateletformationindependentoftheactionsofthrombopoietin/MGDFinmegakaryocytedevelopment.Cell.1995；81:695-704.26.SvobodaO,StachuraDL,MachoOvaO,etal.Dissectionofvertebratehematopoiesisusingzebrafishthrombopoietin.Blood.2014；124:220-228.當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3