一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增引物及其試劑盒的制作方法

本發明屬于植物病原檢測技術領域。更具體地，涉及一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增引物及其試劑盒。

背景技術：

短體線蟲，也稱為根腐線蟲，是一種重要的遷移性內寄生線蟲，該類線蟲由70多個有效種組成。短體線蟲在植物根內移動、穿刺和取食引起根組織形成壞死斑、空腔進而使根組織壞死。由于植株根部壞死，被短體線蟲危害的植物會表現出缺水和營養不足的癥狀，短體線蟲是造成經濟損失最大的三類植物線蟲之一。

玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲均可危害甘蔗，而且會復合侵染；另外這三種短體線蟲不單分布廣泛，而且寄主也較廣，除侵染甘蔗外，還可以侵染其它重要的農作物，如玉米。只有正確鑒定區分這三種線蟲，才能在實際工作中制定合理的防治措施，避免更大的經濟損失。因此，正確、精確的鑒定三種短體線蟲對于實際工作具有重要的意義。

然而，目前對短體線蟲的鑒定主要是依據傳統形態學的方法，而根據形態鑒定玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲是一個復雜而費時的工作。特別是對于玉米短體線蟲和擬玉米短體線蟲，它們形態極為相似，可用于區分的特征很少，而且在甘蔗地里會混合出現，這就需要鑒定人員有非常豐富的形態鑒定經驗。此外，形態學的鑒定方法只能準確地鑒定短體線蟲的成熟雌蟲，但是在田間調查的時候，常常是大量的線蟲處于幼蟲階段，還包括其他種類的線蟲，要通過形態學方法準確地鑒定這些短體線蟲幼蟲，幾乎是不可能的，實際工作中往往會出現鑒定的準確性低的問題，因此，在實際的工作中，準確地區分玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲這三種線蟲，以評價三種線蟲的感染情況，是很困難的。

環介導等溫擴增（ loop-mediated isothermal amplification, LAMP）的方法具有方法簡單、快速高效的特點，國內外已有報道利用該方法檢測一些重要植物線蟲，如：松材線蟲、根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和柑橘半穿刺線蟲等。然而，目前國內外還未見有通過環介導等溫擴增方法鑒定和檢測短體線蟲的報道。由于玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲侵染甘蔗的根部，嚴重的影響甘蔗的產量與品質。因此，為避免更大的經濟損失，亟需一種能夠高效、準確鑒定這三種短體線蟲的分子生物學方法。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是克服現有玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲鑒定檢測技術的不足，尤其是難以區分三者的缺陷，提供一種更加安全、簡單、快速、高效、特異性好、靈敏性高的鑒定區分檢測玉米短體線蟲（Pratylenchus zeae）、擬玉米短體線蟲（P. parazeae）和最短尾短體線蟲（P. brachyurus）的環介導等溫擴增方法。該方法僅需要使用恒溫水浴，而且可以通過裸眼觀察直接判斷樣品中是否分別含有靶標的玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。

本發明的目的是提供一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增引物。

本發明另一目的是提供一種鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增試劑盒。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增引物，包括三組引物，分別為外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP，外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP，以及外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP；其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～12所示；所述三種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。

上述的鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增引物在鑒定或檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲方面的應用，或在制備鑒定或檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的試劑盒方面的應用，都應在本發明的保護范圍之內。

一種鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫檢測方法，是同時以待測樣品DNA為模板，分別利用所述的三組引物進行環介導等溫擴增反應，根據擴增反應的結果判斷樣品中所含線蟲的種類。

一種鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫檢測試劑盒，包含上述三組引物，所述三種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。

進一步優選地，所述試劑盒還包含環介導等溫擴增反應所需要的DNA聚合酶、甜菜堿、MgSO₄、緩沖液和/或dNTPS。

優選地，試劑盒的使用方法為：同時以待測樣品DNA為模板，分別利用所述的三組引物進行環介導等溫擴增反應，根據擴增反應的結果判斷樣品中所含線蟲的種類。

進一步地，所述根據擴增反應的結果判斷樣品中所含線蟲的種類的方法和標準是：

將擴增產物分別進行凝膠電泳，如果外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP組出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有玉米短體線蟲；如果外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP組出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有擬玉米短體線蟲；如果外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP組出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有最短尾短體線蟲；

或者分別向擴增產物中加入SYBR Green I或鈣黃綠素，如果外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP組的擴增產物顏色發生變化（具體是由橘紅色變為淺綠色），則判定樣品中含有玉米短體線蟲；如果外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP組的擴增產物顏色發生變化（具體是由橘紅色變為淺綠色），則判定樣品中含有擬玉米短體線蟲；如果外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP組的擴增產物顏色發生變化（具體是由橘紅色變為淺綠色），則判定樣品中含有最短尾短體線蟲。

另外，優選地，所述環介導等溫擴增反應的反應體系為：每25 μL 體系中加入1 μL DNA，0.2 μM外引物對，1.6 μM內引物對，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶緩沖液，4 μL甜菜堿（5 M），1.5 μL MgSO₄ (100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O補足。

優選地，所述三種短體線蟲環介導等溫擴增反應的反應條件為：64℃反應60 min。

上述方法或試劑盒在鑒定區分或檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲方面的應用，尤其是在同時檢測甘蔗上玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲這三種短體線蟲方面的應用，也在本發明的保護范圍之內。

本發明通過大量的研究和探索，最終得到的上述外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP，外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP，外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP，并建立了環介導等溫擴增方法，不僅能夠特異地鑒定區分玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲，而且檢測靈敏性達到了單條，甚至是0.1條，靈敏度是普通PCR方法的10倍，效果非常好，靈敏度很高。而且環介導等溫擴增方法不需要依賴于任何昂貴的儀器，對實驗檢測人員的要求也低，是一種安全、簡單、快速、成本低的檢測方法。結果判定方法簡單，兩種方式判斷：擴增產物進行電泳，出現特異階梯狀條帶的樣品判定為陽性；或通過向反應體系中加入SYBR Green I或鈣黃綠素，通過肉眼觀察出現顏色變化的樣品為陽性。

本發明具有以下有益效果：

本發明提供了的引物特異性強、靈敏度好、且具有很好的重復性，能夠特異性的鑒定區分檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲，克服了現有技術中三種線蟲難以區分的難題，而且檢測靈敏性達到了單條，甚至是0.1條，靈敏度很高。

本發明僅需使用簡單的恒溫儀器就能完成全部的檢測，不需要依賴于任何昂貴的儀器，并且檢測時間僅為60 min，比普通的PCR快了2～3 h，簡單快速、對環境要求低、無需大型儀器，非常適合在基層檢測單位中使用。

另外，本方法檢測結果的判定方法多樣，可根據實際情況進行選擇。本方法還可以實現擴增反應結果的可視化，準確可靠，無需電泳檢測，不使用溴化乙錠，保障了工作人員的安全，為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的檢測，尤其是檢驗檢疫工作提供了技術支持，具有非常好的推廣應用價值。

附圖說明

圖1為不同反應溫度對擴增效率的影響。A圖為玉米短體線蟲；B圖為擬玉米短體線蟲；C圖為最短尾短體線蟲；M：Marker 2000；1，2，3和4分別代表反應溫度為62℃，64℃，66℃和68℃；5表示在64℃的反應溫度下使用滅菌水作為模板滅菌水對照。

圖2為反應時間與LAMP產物的量的關系；A圖為玉米短體線蟲；B圖為擬玉米短體線蟲；C圖為最短尾短體線蟲；圖中100、80、40、10、1和0.1表示使用的DNA來自于100、80、40、10、1和0.1條線蟲，CK表示使用滅菌水作為模板；Y軸為熒光強度，X軸為反應時間。

圖3為LAMP檢測三種短體線蟲的電泳檢測圖；A圖為玉米短體線蟲；B圖為擬玉米短體線蟲；C圖為最短尾短體線蟲。圖中1-4表示使用的DNA來自于100、10、1和0.1條線蟲，5表示使用滅菌水作為模板，M為Marker 2000。

圖4為LAMP檢測三種短體線蟲的可視化檢測效果圖；A圖為玉米短體線蟲；B圖為擬玉米短體線蟲；C圖為最短尾短體線蟲；圖中1-4表示使用的DNA來自于100、10、1和0.1條線蟲，圖中5表示使用滅菌水作為模板。

圖5為LAMP反應后加入SYBR Green I 染料檢測三種短體線蟲引物組的特異性；A圖為玉米短體線蟲引物組特異性的結果；B圖為擬玉米短體線蟲引物組特異性的結果；C圖為最短尾短體線蟲引物組特異性的結果；圖中離心管上的編號為供試線蟲的種群編號，各種群編號對應的線蟲種類詳見表1；具體為：A圖第一行從左至右依次為SG209、ZC13、YNZT、GX1004、U19、A24、A39、HN297，A圖第二行從左至右依次為A65、GX655、GSY24S、SD1275、GSY24L、JXP、Miti、NMG，A圖第三行從左至右依次為TA、SW、CB、LX、MI、MJ、ddH₂O；B圖第一行從左至右依次為A65、A6L、A90、GX1043、HN297、GX655、GSY24S、SD1275，B圖第二行從左至右依次為GSY24L、JXP、Miti、NMG、TA、SW、CB、LX，B圖第三行從左至右依次為MI、MJ、ddH₂O；C圖第一行從左至右依次為GX655、HN336、HN340、HN297、A65、GSY24S、SD1275、GSY24L，C圖第二行從左至右依次為JXP、Miti、NMG、TA、SW、CB、LX、MI，C圖第三行從左至右依次為MJ、ddH₂O。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。

本發明以下實施例中所述的“0.1條線蟲的DNA模板”是指分別用1條玉米短體線蟲、1條擬玉米短體線蟲和1條最短尾短體線蟲提取的DNA稀釋10倍后的DNA模板，“10條線蟲的DNA模板” 是指分別用100條玉米短體線蟲、100條擬玉米短體線蟲和100條最短尾短體線蟲提取的DNA稀釋10倍后的DNA模板。其中用單條線蟲提取DNA的方法采用Subbotin et al. (2008)所述方法進行。

實施例1 引物設計

1、根據NCBI中玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲、最短尾短體線蟲和其他短體線蟲的線粒體DNA COI序列設計引物，引物設計使用軟件PRIMEREXPLORER v.4 software (http://primerexplorer.jp)進行。

（1）設計的玉米短體線蟲引物組及其序列如下：

PZF3（如SEQ ID NO.1所示）：

5’-GGTTTAGATCTTGATTCTCGG-3’

PZB3（如SEQ ID NO.2所示）：

5’-GTAAAAATAAATCCAAAGTGGCA-3’

PZFIP（如SEQ ID NO.3所示）：

5’-ACCAGGTAAAAACCTTAATTCCGGggatccGCTTATTTTAGGGGGGCT-3’

PZBIP（如SEQ ID NO.4所示）：

5’-TATTCGTTTTGGTCCGGTTTTTTTaaaaaaCAAAATAACCCCAGAGCAAC-3’

（2）設計的擬玉米短體線蟲引物組及其序列如下：

PPF3（如SEQ ID NO.5所示）：

5’-GGWTTTATTGGTTGTATGGTRTG-3’

PPB3（如SEQ ID NO.6所示）：

5’-GAGAAACCCCCCACAGTA-3’

PPFIP（如SEQ ID NO.7所示）：

5’-AGGCAATGGCTATTGTCGCCggatccGGGTTGGTCTAGATTTAGATTCC-3’

PPBIP（如SEQ ID NO.8所示）：

5’-CAGGGATTAAGGTTTTTACCTGGTTaaaaaaCCACAAAACCATTGTAGAGC-3’

（3）設計的最短尾短體線蟲引物組及其序列如下：

PBF3（如SEQ ID NO.9所示）：

5’-GTGTACGTTTTAATCGCTCC-3’

PBB3（如SEQ ID NO.10所示）：

5’-ACTATAGTGGCCACCCTAA-3’

PBFIP（如SEQ ID NO.11所示）：

5’-GCGCCTCTTATACCTTTTAAGCTAggatccGTTTGAGTAGTCAAATTCTTTCAAG-3’

PBBIP（如SEQ ID NO.12所示）：

5’-AAGTGTTGGTTTTGTTGGTTGTTaaaaaaATAACCACGGGAGTCTTG-3’

實施例2引物反應條件優化

1、反應溫度（引物退火溫度）優化

分別使用玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的DNA作為模板，優化上述引物的退火溫度。

（1）提取DNA

所述DNA的提取按照本領域常規方法進行。本實施例是采用Subbotin et al. (2008) 所述方法進行，具體如下：通過離心法收集線蟲或在體視鏡下挑取1條線蟲，然后加入16 μL 滅菌雙蒸水，2 μL 10×PCR buffer (無Mg²⁺) (購于Takara)和 2 μL 蛋白酶 K (600 mAnson U/mL) (購于Takara)，接著用針頭切割線蟲，隨后把該混合物置于65℃中1 h和95℃中15 min。

（2）環介導等溫PCR反應

環介導等溫PCR反應體系為：1 μL DNA，2.5 μL10×引物，引物包括內引物和外引物： 內引物PZFIP/ PZBIP或PPFIP/ PPBIP或PBFIP/ PBBIP各1.6 μM，外引物PZF3/ PZB3或PPF3/ PPB3或PBF3/ PBB3各0.2 μM，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶緩沖液，4 μL甜菜堿（5 M），1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O補足，共25 μL。

環介導等溫PCR反應條件：設計玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的退火溫度梯度分別為62℃、64℃、66℃、68℃；反應時間均為90 min。

（3）反應結束后，各組分別取10 μL 環介導等溫PCR產物用2 %瓊脂糖電泳分離，結果如附圖1所示。A圖、B圖和C圖分別表示玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲引物的不同退火溫度對擴增效率的影響。結果均表明玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的特異引物組在溫度為62~64℃時擴增出典型LAMP產物，其中，反應溫度為64℃時，合成效率最高，條帶最為清晰，因此選擇64℃作為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲引物組的最佳退火溫度。

2、反應時間優化

由于LAMP反應時間過長會增加假陽性機會，然而反應時間過短則會產生假陰性的結果，因此我們使用實時熒光定量PCR儀來優化反應的時間。

環介導等溫PCR反應體系為：1 μL DNA，內引物PZFIP/ PZBIP或PPFIP/ PPBIP或PBFIP/ PBBIP各1.6 μM，外引物PZF3/ PZB3或PPF3/ PPB3或PBF3/ PBB3各0.2 μM，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶緩沖液，4 μL甜菜堿（5 M），1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，另外再加入1.5 μL 20×EvaGreen熒光染料（購于廣州美津生物）余量ddH₂O補足，共25 μL。

反應在64℃下進行，每2 min采集一次熒光信號。

結果如附圖2所示，反應到達平臺期的時間與靶標線蟲的數量成負相關。結果表明在玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲數量較多時（100條）反應40 min熒光強度達到最大值，在線蟲數量較少時（0.1條），反應60 min能達到最大值。

綜上所述，三種短體線蟲環介導等溫擴增反應的反應條件為：64℃反應60 min。

實施例3 LAMP反應的可視化檢測及靈敏性檢測

1、綜上所述，本發明建立的分別快速檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的環介導等溫擴增方法如下：

環介導等溫PCR反應體系為：1 μL DNA， 內引物PZFIP/ PZBIP或PPFIP/ PPBIP或PBFIP/ PBBIP各1.6 μM，外引物PZF3/ PZB3或PPF3/ PPB3或PBF3/ PBB3各0.2 μM，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶緩沖液，4 μL甜菜堿（5 M），1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O補足，共25 μL。

所述三種短體線蟲環介導等溫擴增反應的反應條件為：64℃反應60 min。

2、根據上述反應體系和優化后的反應條件進行LAMP反應，反應結束后，不僅能通過2 %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，還能夠通過反應結束后直接添加SYBR Green I染料或鈣黃綠素進行可視化檢測，結果判斷方法更靈活、更簡便。

3、分別以不同濃度的玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的DNA為模板，以上述反應體系和反應條件進行LAMP反應，反應結束后，使用2 %的瓊脂糖凝膠電泳對上述產物進行檢測，結果如附圖3所示。

同時，在LAMP反應產物中加入1 μL 5000×SYBR Green I染料（購自鼎國生物，使用前加入滅菌水稀釋至5000X的濃度）混勻后觀察結果，陽性產物呈現出由橘紅色變為熒光黃或熒光綠色的顏色變化（如附圖4所示）（具體顏色的深淺由產物的含量決定），說明驗證可視化結果的準確。

電泳檢測與可視化的結果一致，也說明了本發明檢測方法結果的穩定性和可靠性。

同時上述結果也說明了本發明所述的LAMP反應方法能分別檢測到0.1條玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的DNA模板，具有很高的靈敏性。

實施例4 LAMP反應的特異性

1、為驗證本發明引物和LAMP反應體系的有效性和特異性，我們同時使用了多個不同種群的玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲和其他非靶標的線蟲作為模板進行檢測，具體線蟲種類如表1所示。

表1 實驗使用的線蟲種群及對應的可視化檢測結果

注：^a. 用外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP組進行環介導等溫PCR后，產物加SYBR Green I可視化結果。

^b. 用外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP組進行環介導等溫PCR后，產物加SYBR Green I可視化結果。

^c. 用外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP組進行環介導等溫PCR后，產物加SYBR Green I可視化結果。

2、環介導等溫PCR反應體系和條件與實施例3相同。DNA模板分別提取自表1中各種群的單條線蟲。

3、結果如附圖5所示，三組引物的檢測結果顯示，各自分別只有其靶標線蟲（玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲或最短尾短體線蟲）顏色發生變化，即出現了橘紅色變為淺綠色。說明本發明的三組引物及其LAMP反應方法能有效的檢測不同種群的靶標線蟲（玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲或最短尾短體線蟲）。并且對非靶標線蟲不會有特異性的擴增，即對非靶標線蟲均呈現陰性。

同時也說明了本發明所述的LAMP反應方法能有效的檢測到單條的靶標線蟲，不僅特異性非常好，還具有很高的檢測靈敏性，能夠滿足實際檢測、鑒定工作的需要。

實施例5 試劑盒組裝

1、一種鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫檢測試劑盒，包含三組引物，外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP，外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP，外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP；其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～12所示；所述三種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。

還包含環介導等溫擴增反應所需要的DNA聚合酶、甜菜堿、MgSO₄、緩沖液和/或dNTPS。

2、上述試劑盒的使用方法為：同時以待測樣品DNA為模板，分別利用所述的三組引物進行環介導等溫擴增反應，根據擴增反應的結果判斷樣品中所含線蟲的種類。

其中，所述環介導等溫擴增反應的反應體系為：每25 μL體系中加入1 μL DNA，0.2 μM外引物對，1.6 μM內引物對，3.5 μL dNTPS， 2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶緩沖液，4 μL甜菜堿，1.5 μL MgSO₄，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O補足25 μL。

所述三種短體線蟲環介導等溫擴增反應的反應條件為：64℃反應60 min。

另外，所述根據擴增反應的結果判斷樣品中所含線蟲的種類的方法和標準是：

將擴增產物分別進行凝膠電泳，如果外引物對PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP組出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有玉米短體線蟲；如果外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP組出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有擬玉米短體線蟲；如果外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP組出現特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有最短尾短體線蟲；

或者分別向擴增產物中加入SYBR Green I，如果外引物PZF3/ PZB3和內引物對PZFIP/ PZBIP組的擴增產物由橘紅色變為淺綠色，則判定樣品中含有玉米短體線蟲；如果外引物對PPF3/ PPB3和內引物對PPFIP/ PPBIP組的擴增產物由橘紅色變為淺綠色，則判定樣品中含有擬玉米短體線蟲；如果外引物對PBF3/ PBB3和內引物對PBFIP/ PBBIP組的擴增產物由橘紅色變為淺綠色，則判定樣品中含有最短尾短體線蟲。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農業大學

<120> 一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的環介導等溫擴增引物及其試劑盒

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物PZF3

<400> 1

ggtttagatc ttgattctcg g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物PZB3

<400> 2

gtaaaaataa atccaaagtg gca 23

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物PZFIP

<400> 3

accaggtaaa aaccttaatt ccggggatcc gcttatttta ggggggct 48

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物PZBIP

<400> 4

tattcgtttt ggtccggttt ttttaaaaaa caaaataacc ccagagcaac 50

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物PPF3

<400> 5

ggwtttattg gttgtatggt rtg 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物PPB3

<400> 6

gagaaacccc ccacagta 18

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物PPFIP

<400> 7

aggcaatggc tattgtcgcc ggatccgggt tggtctagat ttagattcc 49

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物PPBIP

<400> 8

cagggattaa ggtttttacc tggttaaaaa accacaaaac cattgtagag c 51

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物PBF3

<400> 9

gtgtacgttt taatcgctcc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物PBB3

<400> 10

actatagtgg ccaccctaa 19

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 引物PBFIP

<400> 11

gcgcctctta taccttttaa gctaggatcc gtttgagtag tcaaattctt tcaag 55

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物PBBIP

<400> 12

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