一種利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法與流程

本發明涉及微生物應用技術領域，尤其涉及一種利用新的微生物菌株，降解被三唑醇污染土壤的方法。

背景技術：

三唑醇是德國拜爾公司開發的一種三唑類殺菌劑，由于其具有高效、廣譜、殘效期長和內吸傳導性強等特性，對作物具有保護和治療作用,廣泛應用于水果和禾谷類等農作物上。三唑醇本身是殺菌劑，又是三唑酮的主要代謝產物，具有神經毒性，對嚙齒類動物胚胎咽部形態有一定影響，能夠通過改變正常后腦發育模式使小鼠胚胎發生嚴重畸形，有致畸作用。不同濃度的三唑醇對人肝細胞具有不同毒性：低濃度時，顯著促進細胞增殖，并且隨著濃度的增大，促進作用增大；在高濃度時，顯著抑制細胞的增殖，當濃度大于222.584μg/mL時，細胞全部死亡。三唑醇在pH4～7(20℃和40℃)條件下十分難水解(very persistent)，降解半衰期＞250天，在土壤中降解半衰期為47.3-250天，屬于在土壤中比較難降解的農藥(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/en/index.htm)，隨著其大量使用，勢必會導致其在土壤中殘留，因此極容易造成在農產品中超標，進而對人體健康和國際貿易產生影響。目前歐盟和日本已對該農藥在食品中的殘留量作出了嚴格的限制，如日本肯定列表規定多數食品中三唑醇的殘留量不得超過0.1mg/kg。2007年1月歐盟公布了進口的中國產蜂蜜中檢測出三唑醇殘留量超標的預警通報。同年由于辣椒中三唑醇超標，出口日本的農產品被扣押。2010年至今，我國出口日本的胡蘿卜每年均有因三唑醇超標而被扣押的事件發生。因此，三唑醇殘留引起的農產品安全問題亟待解決。

與物理和化學去除技術相比，生物降解技術具有經濟性強、二次污染少，去除效率高等顯著優點，是迄今為止處理環境和農產品污染一種較好的方法，具有廣闊的應用前景。介質中微生物的選擇性降解是環境中農藥的主要降解途徑。但目前還沒有有關微生物降解三唑醇的報道。

技術實現要素：

本發明目的是，針對目前三唑醇殘留問題，提供一種降解三唑醇效能較高的新微生物菌株；其次是提供一套利用該菌株快速、高效降解污染土壤中三唑醇的方法。

以下是本發明技術方案的詳細描述。

微生物菌株的篩選與鑒定：

本發明從江蘇省某農藥廠取土樣8份，取完后在48h之內迅速篩選菌種，篩選的具體方法是：將樣品在含三唑醇的富集培養基中逐步富集培養后，再在含三唑醇的無機鹽培養基中馴化2-5次，然后涂布于普通培養基平板上進行分離、純化；最后經過液體培養基中的降解試驗，最終得目標菌株E-9。

本發明篩選得到的菌株E-9，委托武漢大學中國典型培養物保藏中心對其進行16S rRNA基因序列的測定與分析、菌株的形態觀察、生理生化特性鑒定。根據上述結果確定該菌株為木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)，革蘭氏陰性。

生物樣品材料保藏：木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)菌株E-9已于2016年6月24日保存在武漢中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016348。

根據以上微生物學特征鑒定，該新菌株E-9屬于木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)，該株微生物不屬于現己公開專利菌種的任何一種，該株微生物具有降解三唑醇的能力，可以用于土壤中三唑醇的降解。

一種利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法，該方法按以下步驟進行：

(1)普通培養基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，經滅菌后，備用；

(2)菌種發酵培養基：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，經滅菌后，備用；

(3)種子液的制備：挑取1環木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)斜面保藏菌株E-9CCTCC NO:M 2016348，接入步驟(1)培養基，于30℃、180rpm條件下振蕩培養24h后得到種子液，備用；

(4)降解菌劑的制備：將步驟(3)種子液按體積5％接種量接入步驟(2)培養基中；于30℃、180rpm條件下振蕩培養48h后得到降解菌劑，備用；

(5)降解菌劑對土壤中三唑醇的降解：將步驟(4)降解菌劑與含三唑醇的土壤樣品按重量1︰10的比例，混勻，利用菌體降解7-45d；

(6)土壤樣品三唑醇殘留量的測定：采用高效液相色譜方法對步驟(4)經菌體降解后的土壤樣品進行三唑醇殘留量的測定；土壤樣品用100mL丙酮/蒸餾水(V/V，5/1)振蕩提取2h后過濾，濾渣用40mL丙酮/蒸餾水(V/V，5/1)分3次洗滌，合并濾液于旋轉蒸發儀上減壓抽去丙酮。濃縮液中加入50mL飽和氯化鈉水溶液，依次用50、40和30mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，濃縮至2mL左右。玻璃層析柱內依次加入2g無水硫酸鈉、6g弗羅里硅土和2g無水硫酸鈉，將提取液轉移至柱內，用50mL二氯甲烷/丙酮(V/V＝9/1)淋洗，收集洗脫液，濃縮至1mL，用甲醇定容至10mL，進行高效液相色譜儀檢測條件：檢測波長223nm，流動相為甲醇：水(V:V＝70:30)，流速為0.8mL/min，采用SUPELCO C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，進樣量為20μL，柱溫為25℃。三唑醇的出峰時間為7.12min，可測定出樣品中三唑醇的含量，并計算出菌種對三唑醇的降解率。

所述的方法，其中所述降解菌劑發酵培養基的組分與各組分的重量百分比含量為：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

所述的方法，其中所述培養條件為：溫度30℃，初始pH為7.0，在攪拌、通風、振蕩條件下培養48h。

生物材料保藏信息

木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)菌株E-9，保存在武漢中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M 2016348，保藏日期為：2016年6月24日。

有益效果

一、本發明從微生物群中篩選得到可降解三唑醇的木糖氧化無色小桿菌E-9：CCTCC NO:M 2016348，其在適合條件下，能有效降解三唑醇。

二、本發明將木糖氧化無色小桿菌E-9用于土壤中三唑醇的降解實驗，結果表明，該菌可有效降解土壤中的三唑醇，30天時對土壤中三唑醇的降解率可達56％，45天時對土壤中三唑醇的降解率可達66％(見實施例3、4、5、6)，因此該菌在降解土壤中三唑醇的領域中具有較廣泛的應用前景。

說明書附圖說明

圖1為本發明篩選的E-9菌株顯微鏡(1000X)觀察照片。

圖2為本發明篩選的E-9菌株的平板菌落形態結果圖。

圖3為本發明篩選的E-9菌株的電鏡照片。

圖4為菌株E-9降解土壤中三唑醇的效果比較圖(實施例子3).

圖5為菌株E-9降解土壤中三唑醇的效果圖(實施例子4)。

圖6為菌株E-9降解土壤中三唑醇的效果圖(實施例子5)。

具體實施方案

通過下面實施例旨在對本發明作進一步的詳細說明，而不是限制本發明的范圍。以下實施例中采用的：

微生物：為木糖氧化無色小桿菌E-9CCTCC NO:M 2016348；

三唑醇：美國Sigma公司，純度為98.5％

實施例1：新菌株E-9的篩選

本發明從浙江省某農藥廠采集曝氣池活性污泥，在24h之內迅速從中篩選菌種；篩選的具體方法是：稱取10g活性污泥，置于100mL富集培養基中，同時分別添加100g/L的三唑醇原藥0.1mL使其終濃度為100mg/L，并于30℃，180r.min^-1搖床培養，以后每7d移種一次，以10％的接種量接入新鮮培養基中，并以100mg/L為提高單位逐漸提高供試農藥的濃度至600mg/L。然后將培養液加入以供試農藥三唑醇(600mg/L)為唯一碳源的無機鹽培養基中馴化2-5次，每次7d，最后用涂抹法在普通培養基上進行分離。選取生長快，菌落規則，傳代穩定的菌落，在普通培養基平板上純化2或3次，鏡檢為單一形態后得到初篩菌株。將初篩菌株在降解培養基中進行降解性能測試，根據三唑醇的降解率大小，從中篩選出降解能力顯著的菌株E-9，作為進一步研究的出發菌株；

所述富集培養基配方為：向普通培養基中加入不同質量濃度的三唑醇溶液，使其最終的三唑醇質量濃度分別為100、200、300、400、500、600mg/L；

所述馴化無機鹽培養基為：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蒸餾水1000mL，pH值7，三唑醇600mg/L；

所述發酵培養基配方為：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

實施例2：新菌株E-9的鑒定

對實施例1篩選得到的菌株E-9委托武漢大學菌種保藏中心進行微生物菌株16S rRNA基因序列的測定與分析、菌株的形態觀察、微生物菌株的生理生化特性鑒定。根據上述檢測結果，菌株E-9鑒定為木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)，革蘭氏陰性，此株菌已于2016年6月24日保藏在武漢中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2016348。

菌株E-9CCTCC NO:M 2016348 16S rRNA基因序列:

GGCACGATCTACGTGGTATCGCCCCCCTTGCGGTTAGGCTAACTACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGACATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGGTTTCTGGGATTGGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCGACCCTCTGTCCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCTTTCGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCGGTTCTCTTGCGAGCACTGCCAAATCTCTTCGGCATTCCAGACATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTGCGCTACCAAGGCCCGAAGGCCCCAACAGCTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTGTTATCCCAGGAGGCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCACCTCCCTCTGACACACTCTAGCCCGGTAGTTAAAAATGCAGTTCCAAAGTTAAGCTCTGGGATTTCACATCTTTCTTTCCGAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCAGGTACCGTCAGTTTCGCGGGGTATTAACCCACGACGTTTCTTTCCTGCCAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCGCACACGCGGGATGGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAAACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGATATCGGCCGCTCCAATAGTGCAAGGTCTTGCGATCCCCTGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCTACGCTTTCGCGTAGTTATCCCCCGCTACTGGGCACGTTCCGATACATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGACCGAAGTCCGTGCTGCCGTTCGACTGCATG

表1菌株E-9生理生化特性–酶活、碳源同化

+：陽性反應；-：陰性反應

表2菌株E-9生理生化特性—利用碳源產酸

+：陽性反應；-：陰性反應

實施例3：利用菌株E-9降解土壤中三唑醇的方法1

按以下步驟進行：

(1)菌種活化培養基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。經滅菌后，備用；

(2)菌種發酵培養基：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。經滅菌后，備用；

(3)種子液的制備：挑取1環木糖氧化無色小桿菌(Achromo bacterxylosoxidans)斜面保藏菌株E-9CCTCC NO:M 2016348，接入步驟(1)培養基，于30℃、180rpm條件下振蕩培養24h后得到種子液，備用；

(4)降解菌劑的制備：將步驟(3)種子液按體積5％接種量接入步驟(2)培養基中；于30℃、180rpm條件下振蕩培養48h后得到降解菌劑，備用；

(5)將步驟(4)降解菌劑以10％的比例分別加入含有5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg三唑醇的土壤樣品中，加入無菌水，保持土壤濕度在田間持水量的60％左右，充分混勻，使三唑醇和菌劑分布均勻。按時補加無菌水，盡量保持土壤濕度在田間持水量的60％左右，以添加同等質量濃度三唑醇不加菌劑土壤樣品為對照。30℃下避光降解7天；測定7天時土壤中三唑醇殘留量。

(6)土壤樣品三唑醇殘留量的測定：采用高效液相色譜方法對步驟(5)的土壤樣品進行三唑醇殘留量的分析，土壤樣品用100mL丙酮/蒸餾水(V/V,5/1)振蕩提取2h后過濾，濾渣用40mL丙酮/蒸餾水(V/V＝5/1)分3次洗滌，合并濾液于旋轉蒸發儀上減壓抽去丙酮。濃縮液中加入50mL飽和氯化鈉水溶液，依次用50、40和30mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，濃縮至2mL左右。玻璃層析柱內依次加入2g無水硫酸鈉、6g弗羅里硅土和2g無水硫酸鈉，將提取液轉移至柱內，用50mL二氯甲烷/丙酮(V/V＝9/1)淋洗，收集洗脫液，濃縮至1mL，用甲醇定容至10mL，進行高效液相色譜儀檢測條件：檢測波長223nm，流動相為甲醇：水(V:V)＝70:30，流速為0.8mL/min，采用SUPELCO C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，進樣量為20μL，柱溫為25℃。三唑醇的出峰時間為7.12min。經測定0天時不同三唑醇添加土壤樣品(5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)中三唑醇含量分別為4.79mg/kg、24.31mg/kg、48.12mg/kg，7天對照土壤樣品中三唑醇殘留量分別為4.63mg/kg、23.40mg/kg、47.60mg/kg，接菌劑土壤樣品中三唑醇殘留量分別為3.40mg/kg、17.89mg/kg、36.56mg/kg，按菌種降解率(％)＝(未接種的土壤三唑醇含量-接種土壤三唑醇含量)/未接種的土壤三唑醇含量*100的公式計算，對照土壤中三唑醇降解率分別為3.34％、3.74％、1.08％，菌劑對三唑醇的降解率分別為29.03％、26.41％、24.02％，詳見圖4。

實施例4：利用菌株E-9降解土壤中三唑醇的方法2

(1)菌種活化培養基：同實施例3；

(2)菌種發酵培養基：同實施例3；

(3)種子液的制備：同實施例3；

(4)降解菌劑的制備：同實施例3；

(5)將步驟(4)降解菌劑以10％的比例分別加入含有5mg/kg三唑醇的土壤樣品中，加入無菌水，保持土壤濕度在田間持水量的60％左右，充分混勻，使三唑醇和菌劑分布均勻。按時補加無菌水，盡量保持土壤濕度在田間持水量的60％左右，以添加同等質量濃度三唑醇不加菌劑土壤樣品為對照。30℃下避光降解30d；當天采樣，測定三唑醇原始沉積量，以后定期采樣，測定三唑醇殘留量。

(6)土壤樣品三唑醇殘留量的測定：測定方法同實施例3；經測定30天對照土壤樣品中三唑醇含量為4.32mg/kg，30天接種土壤樣品中三唑醇殘留量為3.65mg/kg，按菌種降解率(％)＝(未接種的土壤三唑醇含量-接種土壤三唑醇含量)/未接種的土壤三唑醇含量*100的公式計算，該菌劑對三唑醇的降解率為24.46％，詳見圖5。

實施例5：利用菌株E-9降解土壤中三唑醇的方法3

(1)菌種活化培養基：同實施例3；

(2)菌種發酵培養基：同實施例3；

(3)種子液的制備：同實施例3；

(4)降解菌劑的制備：同實施例3；

(5)土壤加富營養液：葡萄糖3g、蛋白胨0.5g，蒸餾水1000mL，滅菌，備用。

(6)將步驟(4)降解菌劑以10％的比例分別加入含有25mg/kg三唑醇的土壤樣品中，加入步驟(5)土壤加富營養液，保持土壤濕度在田間持水量的60％左右，充分混勻，使三唑醇和菌劑分布均勻。按時補加無菌水，盡量保持土壤濕度在田間持水量的60％左右，以添加同等質量濃度三唑醇不加菌劑土壤樣品為對照。30℃下避光降解45d，在21d時剩下的處理二次加入相同量的菌劑及土壤加富營養液；當天采樣，測定三唑醇原始沉積量，以后定期采樣，測定三唑醇殘留量。

(6)土壤樣品三唑醇殘留量的測定：測定方法同實施例3；經測定0d土壤樣品中三唑醇含量為24.69mg/kg，30d、45d對照土壤樣品中三唑醇含量分別為為22.56mg/kg、22.02mg/kg，接菌劑土壤樣品中三唑醇殘留量分別為10.74mg/kg、8.31mg/kg，經計算，對照土壤中30d、45d三唑醇降解率分別為8.63％、10.81％；E-9菌劑處理土壤中三唑醇降解率為56.31％、66.21％，詳見圖6。

實施例6：菌株E-9對培養液中三唑醇降解效果的測定

(1)菌種活化培養基：同實施例3；

(2)菌種發酵培養基：同實施例3；

(3)種子液的制備：同實施例3；

(4)降解菌劑的制備：同實施例3；

(5)降解菌劑對三唑醇降解：取步驟(2)發酵培養基，接入步驟(4)降解菌劑，接種量為10％(v/v)，向發酵培養基中添加三唑醇使終濃度為50mg/L，于30℃、180r/mint件下搖床培養培養7d；另設含有50mg/L三唑醇不接菌劑發酵培養基為對照；

(4)發酵培養基中三唑醇殘留量的測定：從步驟(5)搖瓶中分別取發酵培養液按以下方法進行測定：發酵培養液用移液管吸取10mL于分液漏斗中，加入飽和氯化鈉水溶液10mL，用二氯甲烷萃取三次(30mL×3)，收集二氯甲烷相，合并二氯甲烷相過無水硫酸鈉，在旋轉蒸發儀上(40℃水浴)減壓濃縮近干，吹干，甲醇(色譜醇)10mL定容10ml，再稀釋10倍后進行高效液相色譜分析。檢測條件同實施例3。測定樣品中三唑醇的殘留量，并計算降解率，經測定對照中三唑醇含量為48.12mg/L，接種E-9降解菌劑樣品中三唑醇殘留量為18.34mg/L，經計算，確定菌劑對發酵培養基中三唑醇降解率為61.89％。

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