一種鐵皮石斛干藥材分子鑒定方法及其應用與流程

本發明涉及術語中藥材來源品種鑒定技術領域，具體涉及利用核糖體DNA ITS2片段快速鑒別鐵皮石斛干藥材的方法及其應用。

背景技術：

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中國植物志》英文版eflora中拉丁名為Dendrobium catenatum Lindley)為蘭科珍稀名貴藥用植物，有“中華九大仙草之首”之盛名。鐵皮石斛對生長環境條件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生長緩慢，又經長期采挖，自然資源瀕臨枯竭，被列為國家重點保護的藥材品種。2010年版《中國藥典》中關于鐵皮石斛的描述為“本品為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖。11月至翌年3月采收，除去雜質，剪去部分須根，邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀，烘干；或截切成段，干燥或低溫烘焙，前者習稱鐵皮楓斗(耳環石斛)；后者習稱鐵皮石斛。”目前，我國藥用石斛約有50余種，然而市場上把石斛屬其他植物或蘭科某些植物也作為鐵皮楓斗混入商品流通和臨床應用，對鐵皮石斛的臨床療效和用藥安全產生了很多不良影響。中藥材DNA條形碼分子鑒定技術依賴樣品自身的基因分子信息，能夠實現物種的準確鑒定。目前該技術在鐵皮石斛干藥材的鑒定中有以下問題：(1)鐵皮楓斗加工過程中，多有80℃～100℃的加熱過程，且時間較長，會造成樣品DNA的嚴重降解，影響DNA的提取效率；(2)鐵皮石斛多糖含量高，嚴重影響DNA的提取純化；(3)通用引物ITS2F/3R在鐵皮石斛干藥材ITS2序列擴增中，擴增成功率低。針對以上問題，急需尋找一種穩定、可靠的方法用于快速鑒定名貴中藥鐵皮石斛干藥材。

技術實現要素：

本發明第一個目的是提供鐵皮石斛干藥材rDNA ITS2序列的獲取方法。

本發明第二個目的是提供利用rDNA ITS2序列鑒別鐵皮石斛干藥材的方法。

本發明提供的鐵皮石斛干藥材DNA快速提取技術，針對多糖含量高、加工過程造成DNA嚴重降解的特點，采取以下改進：取鐵皮石斛干燥藥材20-30mg，切碎后使用MM400球磨儀粉碎，加入核分離液500-1000μL，充分混勻，7000r/min離心5min，棄上清，加入核分離液500-1000μL，重復此步驟3-5遍至上清不粘稠。其余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒標準操作方法進行。核分離液的配比為：Tris-HCl(pH8.0)終濃度100mmol·L^-1，EDTA(pH8.0)終濃度20mmol·L^-1，NaCl終濃度0.7mol·L^-1，2％PVP-40(W/V)，以上各物質配成溶液后滅菌，使用之前加入β-巰基乙醇0.4％(V/V)。

本發明提供的鐵皮石斛藥材核糖體DNA ITS2片段制備方法主要包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的DNA。

(2)PCR擴增ITS2序列，按25μL擴增體系進行：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正反向特異引物DO-F和DO-R各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

(3)用于擴增ITS2序列的引物為：

正向DO-F：5’-GGCGTCAAGCATTTTATCTCTCC-3’；

反向DO-R：5’-AATCCTCGTAAGTTTCTTTTCCTCC-3’。

按以下程序進行PCR擴增：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40個循環；72℃10min。

本發明提供的利用rDNA ITS2序列鑒別鐵皮石斛干藥材，是應用MEGA6.0軟件，基于K2P模型構建待測樣品的NJ樹，通過NJ樹可以直觀鑒別出鐵皮石斛。

本發明提供了鐵皮石斛干藥材DNA快速提取技術，改良了PCR擴增體系，針對鐵皮石斛干藥材設計了ITS2序列PCR擴增引物，建立了PCR反應條件，為鐵皮石斛干藥材的鑒別提供了分子鑒定依據，可從多種藥材中快速、準確地檢測出鐵皮石斛。

本發明適用于鐵皮石斛基原植物、市售藥材、種子種苗等方面的鑒定，可有效解決鐵皮石斛的鑒定、育種，以及種質資源的開發利用等問題，適用性廣，操作簡單，易于掌握，準確性高。

附圖說明

圖1所示為鐵皮楓斗特異引物DO-F/DO-R與通用引物ITS2F/3R擴增對比電泳圖。

其中M為分子量標準(條帶由上到下依次誒：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1-5為通用引物ITS2F/3R擴增結果；6-10為引物DO-F/R擴增結果；11為陽性對照(鐵皮石斛葉片樣品提取DNA進行擴增)，12為陰性對照。

圖2為基于ITS2序列構建鐵皮楓斗與其混偽品的NJ樹。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1鐵皮石斛藥材的鑒定

1.實驗材料

本案例共收集石斛屬40種173份樣品，混偽品密花石豆蘭和流蘇金石斛3份樣品。其中鐵皮楓斗基原植物樣品14份，藥材樣品65份，具體信息見表1。

表1鐵皮楓斗及其混偽品樣品信息表

2.實驗儀器

臺式高速離心機、PTC-100基因擴增儀、電泳儀、紫外凝膠成像分析系統、MM400球磨儀(德國Retsch)。

3.DNA提取

取鐵皮楓斗干燥藥材20-30mg，切碎后使用MM400球磨儀粉碎，加入核分離液500-1000μL，充分混勻，7000r/min離心5min，棄上清，加入核分離液500-1000μL，重復此步驟3-5遍至上清不粘稠。其余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒標準操作方法進行。核分離液的配比為：Tris-HCl(pH8.0)終濃度100mmol·L^-1，EDTA(pH8.0)終濃度20mmol·L^-1，NaCl終濃度0.7mol·L^-1，2％PVP-40(W/V)，以上各物質配成溶液后滅菌，使用之前加入β-巰基乙醇0.4％(V/V)。

4.PCR擴增

正向引物DO-F：5’-GGCGTCAAGCATTTTATCTCTCC-3’；反向引物DO-R：5’-AATCCTCGTAAGTTTCTTTTCCTCC-3’，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol·L^-1。

25μL反應PCR擴增體系：2×Taq PCR Mix 12.5μL，特異引物DO-F和DO-R各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

PCR反應參數：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40個循環；72℃10min。

5.DNA測序

PCR產物直接送美吉公司進行雙向測序，測序引物同PCR擴增引物(DO-F和DO-R)。

6.序列拼接

本實施例采用軟件CodonCode Aligner 5.1(CodonCode Co.，USA)進行序列拼接及校對。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區，然后進行測序質量評估及預處理，即去除測序結果兩端的低質量部分，并對剩余部分進行質量評估。具體步驟是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進行滑動，如果窗口內有多于2個堿基的Q值小于20，則刪除一個堿基，窗口繼續滑動，如果窗口內堿基Q值小于20的數目小于或等于2個，窗口停止滑動，即去除了低質量的區域。進行序列拼接后，獲得鐵皮楓斗rDNA ITS2序列。

7.序列比對

用MEGA6.0軟件，基于K2P模型對獲得的鐵皮楓斗及其同屬物種的ITS2序列構建NJ樹，用于鑒定鐵皮石斛藥材。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

實施例2鐵皮石斛基原植物的鑒定

基本同實施例1，所不同的是以鐵皮石斛基原植物為樣品，按上述方法提取DNA，擴增ITS2序列，結果也能成功獲得目標序列，完成鑒定。

實施例3鐵皮石斛種子種苗的鑒定

基本同實施例1，所不同的是鐵皮石斛種子和種苗為樣品，按上述方法提取DNA，擴增ITS2序列，結果也能成功獲得目標序列，完成鑒定。