微流控凝膠氣液界面煙氣暴露裝置的制作方法

本發明涉及一種煙氣暴露，尤其涉及一種微流控凝膠氣液界面煙氣暴露裝置。

背景技術：

一直以來，卷煙煙氣對人體的健康風險廣受關注。有研究報道顯示，吸煙者相對于非吸煙者，患肺癌、慢性阻塞性肺病和急性心肌梗塞的可能性會不同程度地增加。研究表明在卷煙煙氣導致的多種吸煙相關疾病中，氧化應激是關鍵的病理生理學機制。卷煙煙氣是一種復雜的混合物，其中氧化性物質會誘導細胞內活性氧(ROS)增加，卷煙煙氣誘導機體產生的ROS會對細胞內蛋白質、脂質和DNA等造成損傷。但是現有的評估平臺對其形成機理、成分危害性等研究都比較局限。因此，開發對細胞的體外毒性研究平臺，評估煙氣對健康的具體危害性，很有必要。

卷煙煙氣是一種由幾千種化學物質組成的復雜的氣溶膠，由粒相物和氣相物兩部分所構成。目前卷煙煙氣毒理學研究大多集中于煙氣粒相物的毒性研究方面，染毒方式多以溶液暴露為主，與卷煙煙氣實際的呼吸道氣液界面暴露條件有著巨大的差異，不能全面真實地反映煙氣混合物體系的生物學效應。而現在對全煙氣直接暴露的研究，多采用商品化裝置如日本的Cultex和德國的Vitrocell，這兩種設備基本相同，暴露方式均是氣液界面暴露。但是此類暴露裝置體積龐大、價格昂貴，普通實驗室難以負擔，限制了此類裝置的推廣和普及。此外，卷煙由于其天然產物的特性，不同產地和不同批次間均有比較明顯的差異，因此對于其毒性的評估需要大量的工作，現有的設備完全難以滿足毒性評估的基本需求。因此，急需建立一種實驗室使用的簡單便利的氣液界面細胞暴露平臺用于氣體毒性評。

技術實現要素：

發明目的：本發明的目的是提供一種用于實驗室研究、便攜式而廉價的煙氣暴露裝置。

技術方案：本發明所述的微流控凝膠氣液界面煙氣暴露裝置，包括提供煙氣進出通道的上層芯片、提供細胞培養液流動通道的下層芯片以及位于上下層芯片之間用于裝載凝膠和位于凝膠上細胞的中間層芯片；其中，下層芯片內的細胞培養液為中間層芯片內的細胞提供生存環境，中間層芯片內的凝膠成為氣液界面并使其細胞與煙氣直接接觸。

其中，所述上層芯片包括并列設置的氣體進出通道以及位于通道兩側的氣體入口和氣體出口，其中，氣體入口至少有兩個，氣體出口數量沒有限制，例如兩個入口通入兩種不同的氣體，相互稀釋以形成氣體濃度梯度，如此可在一張芯片上，同時實現不同條件下對細胞進行刺激實驗，通過一次實驗就得出多個情況下細胞受刺激的結果。

類似的，所述下層芯片包括并列設置的液體流動通道以及位于通道兩側的培養液入口和廢液出口，其中，培養液入口至少有兩個，廢液出口沒有限制，以形成液體濃度梯度。

所述中間層芯片包括由細胞培養孔構成的陣列結構，該細胞培養孔與上下層芯片中的通道相通，同時細胞培養孔內裝載凝膠和細胞，凝膠與下層芯片中的細胞培養液直接接觸。

本發明中，中間層芯片本體是不能透過氣體或者液體的，因此在上面開設細胞培養孔，孔內填充凝膠，凝膠上表面培養細胞，此時凝膠起到了間隔和溝通氣液的作用；這樣下層的溶液能夠透過凝膠滲透將營養物質輸送給細胞，同時將細胞的代謝產物通過凝膠滲透到液體中帶走，維持細胞環境的穩定。此外，采用陣列結構可以實現陣列化大批量檢測。

本發明中，上層芯片和下層芯片中的通道方向垂直或平行。上層芯片中，每一列是一種氣體的濃度條件，下層芯片中，每一列是一種液體的濃度條件，以4*4陣列為例，一共4列，每列有4個細胞是在同一條件下受刺激實驗。同樣，若是設計成6*6陣列，可以根據需要同時改變相應的液體通道。此時如果液體入口是兩種不同濃度的液體，氣體入口是兩種不同濃度的氣體，氣液通道相垂直，可在芯片上實現16個不同條件下的刺激；氣液通道也可以相平行，此時可在芯片上實現4個不同條件下的刺激。

所述上層芯片、中間層芯片及下層芯片由聚二甲基硅氧烷層與塑料層復合而成。其中，塑料層由聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯或聚對苯二甲酸乙二醇酯制成。

所述凝膠為能夠滿足細胞生物相容性的凝膠。其中，凝膠為瓊脂糖、膠原水凝膠、聚L-賴氨酸或殼聚糖。

本發明中，可以再下層芯片的細胞培養液中添加刺激藥物形成細胞溶液暴露裝置，實現對細胞的刺激實驗。在模擬體內細胞生長環境的條件下，對細胞進行刺激，以觀察細胞的生存代謝情況。使用溶液暴露裝置，可實現對藥物的篩選，以評估藥物的藥效，這對于藥物研發有重要意義；同時也可以模擬體內細胞受煙氣等污染物刺激，損傷情況。例如，將煙氣提取物溶于細胞培養液中，暴露刺激細胞，可檢測細胞中ROS、各種轉錄因子的變化情況。

有益效果：與現有技術相比，本發明的顯著優點為：該煙氣暴露裝置包括上、中、下三層芯片結構；其中，上層芯片可通入卷煙煙氣，以便刺激細胞；中間層芯片用于細胞裝載和培養，下層芯片通細胞培養液，以持續不斷提供養分，并實時輸出細胞代謝物。本發明中細胞位于凝膠上方，不與細胞培養液直接接觸，避免了培養液對細胞表面造成直接沖擊；同時培養液又可通過凝膠供給細胞且保持細胞生存環境穩定；在此基礎上細胞可與煙氣氣體直接接觸，從而獲得煙氣對細胞刺激的相關生物學信息。

附圖說明

圖1是本發明煙氣暴露裝置上層芯片的結構示意圖；

圖2是本發明煙氣暴露裝置中間層芯片的結構示意圖；

圖3是本發明煙氣暴露裝置下層芯片的結構示意圖；

圖4是本發明煙氣暴露裝置整體結構圖；

圖5是本發明煙氣暴露裝置某一橫列的局部剖面圖；

圖6是本發明煙氣暴露裝置的實驗對照組細胞活性圖；

圖7是本發明煙氣暴露裝置的煙氣暴露組細胞活性圖。

圖中：1-上層芯片的氣體管道；2-氣體入口；3-氣體出口；4-中間層芯片的細胞培養孔；5-下層芯片的液體通道；6-培養液入口；7-廢液出口；8-細胞；9-凝膠；10-活細胞；11-凋亡細胞；12-壞死細胞。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步說明。

一、芯片平臺的制作過程

1.上層芯片：將未固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS前聚體：固化劑＝10:1)，鋪到上層芯片模板上，真空抽氣10min以除去氣泡，加熱臺70℃加熱固化45min，揭下，在指定位置打孔，即得到上層芯片，見圖1。

2.中間層芯片：使用激光雕刻機，對0.5mm厚的有機塑料板雕刻4*4陣列的孔狀結構，孔徑1mm，即可用于細胞裝載，見圖2。

3.下層芯片：將未固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS前聚體：固化劑＝10:1)，鋪到下層芯片模板上，真空抽氣10min以除去氣泡，加熱臺70℃加熱固化45min，揭下，在指定位置打孔，即得到下層芯片，見圖3。

4.中間層細胞培養孔與上、下層芯片通道垂直對應，芯片緊密貼合，構成完整的微流控凝膠氣液界面細胞培養和煙氣暴露平臺，見圖4-5。

二、芯片細胞裝載和培養

1.使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制2％的低熔點瓊脂糖凝膠溶液，置于70℃水浴中溶解，震蕩形成均勻水溶液。

2.處理細胞，得10⁶cell/L的細胞溶液。

3.將經過10min紫外光滅菌處理下層和中間層取出、貼合，使用移液槍依次移取2％凝膠0.7μL注入微孔，將芯片放入4℃冰箱5min，凝膠固化。

4.使用移液槍再次依次移取0.7μL細胞溶液注入微孔。

5.使用注射泵和5mL注射器，以5μL/min速度連續灌注細胞培養液24小時。

6.觀察細胞活性情況。

三、芯片細胞煙氣暴露

1.按以上所述，將細胞裝載到芯片上。

2.同樣使用注射泵和5mL注射器，以5μL/min速度連續灌注細胞培養液。

3.將煙氣收集于煙氣袋中，連接于氣體入口；氣體出口連接氣體流量計和真空發生器；即可實現一定煙氣流速的細胞煙氣暴露，實驗以8mL/min流速暴露20min。

4.使用熒光探針染料AO-EB孵育細胞，熒光觀察，如圖7所示。

5.圖6為實驗對照組，即未經過煙氣刺激，正常培養的細胞活性情況。

6.由此計算獲得煙氣對細胞活性影響情況，依據公式：細胞死亡率＝(凋亡細胞+壞死細胞)/細胞總數。

7.圖6為實驗對照組，細胞死亡率≤5％；圖7為煙氣暴露組，細胞死亡率≥50％；由此可看出通過煙氣對細胞造成了損傷，該裝置可有效地用于實驗研究。

本發明將氣液界面引入微流控芯片，可以實現對人體肺部細胞暴露在氣體環境中實際狀態的良好模擬，并對重要的氧化應激毒性指標進行在線檢測，同時兼具微型化、自動化和廉價的特點。因此，本發明基于微流控芯片技術，研發氣液界面細胞暴露以及相應的煙氣氧化應激毒性指標的快速檢測平臺，對于卷煙煙氣危害性評價及其毒性作用機制的研究有著重要的意義。