本發明屬于植物病害檢測技術領域，具體涉及一種柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重檢測試劑盒及其應用。
技術背景
柑橘是世界上最重要的商品水果之一，我國是柑橘的主產國，柑橘產業在我國農村社會與經濟中具有重要的地位和作用。近年來，柑橘黃龍病和柑橘潰瘍病在我國柑橘產區的發病率不斷上升，二者復合侵染的情況越來越多，每年給我國柑橘產業造成逾百億元的經濟損失。目前尚缺乏柑橘黃龍病和潰瘍病的高效殺菌劑和抗病品種，一旦發現有感染這兩種病害，需要及時清除病樹，防止病害蔓延；此外，還要加強非疫區的管理，防止這兩種病害的侵入，因此，針對柑橘黃龍病和潰瘍病建立早期快速定量檢測方法就顯得尤為重要。
針對柑橘黃龍病與柑橘潰瘍病的檢測，目前已有核酸雜交和血清學檢測的方法，但都非常耗時和繁瑣。普通PCR、實時熒光定量PCR也可用于此二種病害的檢測，但普通PCR檢測靈敏度不足。而實時熒光定量PCR方法在定量分析時，需要依賴標準物質和標準曲線，僅能實現相對定量分析；另外，實時熒光定量PCR對反應擴增效率要求很高，且易受柑橘樣品DNA純度和PCR抑制因子等因素的影響，導致對目標序列定量的不準確估計和對低含菌量病樣的檢測靈敏度不足。此外，基于實時熒光定量PCR的復合多靶標體系的優化非常困難，定量分析通量較低。因此，實時熒光定量PCR已不能完全滿足黃龍病和潰瘍病高靈敏度定量檢測的需求。
本發明開發了一套柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法，與現有方法相比，新開發的檢測方法具有如下幾個方面的優點。1.可進行簡便可靠的絕對定量：本發明所使用的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法采用了數字檢測芯片系統，其數字PCR的檢測芯片微孔數遠大于樣品中病原菌的靶標拷貝數，該方法通過樣品極限稀釋、泊松分布和終點法PCR，來實現核酸的絕對定量，因此本方法的靶標定量檢測不依賴于擴增曲線的閾值，不受PCR擴增效率的影響，也不需建立標準曲線，不需進行復雜的轉化運算，因此更加簡便的實現絕對定量分析，并具有更好的檢測準確度和重現性。2.抗雜質干擾能力強，檢測靈敏度高：已有的柑橘黃龍病菌和潰瘍病菌實時熒光定量PCR檢測方法由于受到柑橘樣品中的雜質及柑橘基因組的干擾，對低含菌量柑橘病樣的檢測極為困難，而本方法的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法，可將每個樣品分成20,000多個均勻的納升級微滴，其中每個微滴都作為一個獨立的PCR反應器，這種方法可在很大程度上把柑橘樣品中的雜質及柑橘基因組與病原菌靶標隔離開，極大的減少了其他物質的干擾；由于該方法使每一出現陽性熒光的微孔對應一個病原菌靶標拷貝，因此即使檢測體系中僅有一個靶標拷貝也可以很好的檢出。3.高特異性：本發明根據柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的特有序列設計了特異性引物和特異探針，其特異性高，且非常穩定，保證了反應的順利進行，進一步確保柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌檢出的特異性。4.功能更多：本發明同時使用柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的特異性引物和不同熒光標記的特異探針，結果讀取時使用兩個不同的熒光檢測通道，可在一次實驗可同時檢出2種病原菌，減少了實驗時間和步驟。5.檢測速度快：本發明提供的方法和試劑盒方便快捷，整個檢測時間僅需要數小時，節省大量人力成本和時間成本。
根據檢索相關的研究及專利文獻,未見有柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測的相關文獻報道。
技術實現要素：
一種柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重檢測試劑盒，其組成包括：病樣DNA提取試劑盒、數字PCR反應試劑、柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌特異性引物及特異性探針、陽性對照樣品模板以及陰性對照樣品模板。
其中，所述病樣DNA提取試劑盒的組成成分為：2% CTAB 溶液、巰基乙醇、酚/氯仿溶液以及無水乙醇溶液。
所述數字PCR反應試劑的組成成分為：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 濃度為10μmol/L的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R各1支，200μL 濃度為10μmol/L的探針HLB1-P以及KYB1-P各1支，1mL濃度為50ng/μL的柑橘黃龍病菌陽性對照樣品模板、柑橘潰瘍病菌陽性對照樣品模板以及陰性對照樣品模板各1支。
上述引物與探針的序列為：
柑橘黃龍病菌的特異引物及探針為：
上游引物HLB1-F：5' GGCTCAACCTTGGAACTGC 3'
下游引物HLB1-R：5' TTGCTCCCCACGCTTTC 3'
探針HLB1-P：FAM 5’TTGTCTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGG 3’BHQ
所述探針5’端熒光報告基因為FAM，3’端淬滅基團為BHQ。
柑橘潰瘍病菌的特異引物及探針為：
KYB1-F：5' GGACCGTCGCTGTCAAGTA 3'
KYB1 -R：5' CAACTGTAACGGTGGACCTC 3'
KYB1 -P：HEX 5' CACTGTTTGCCGACGCCAACG 3' BHQ
所述探針5’端熒光報告基因為HEX，3’端淬滅基團為BHQ。
上述柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重檢測試劑盒用于柑橘黃龍病菌與潰瘍病菌檢測，其具體檢測方法包括如下步驟：
（1）提取柑橘病樣DNA：
a)采集柑橘病樣200mg，加液氮研磨成粉末狀；
b)研磨粉末加入500μl的CTAB提取緩沖液及5μL巰基乙醇，震蕩混勻，65℃水浴20分鐘，12000 r/min,離心10 分鐘；
c)吸取上清液，加入等體積的酚/氯仿溶液,混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min；
d)吸取上清，加入等體積無水乙醇，12000 r/min,離心10 min；
e)棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
f)室溫下干燥沉淀，溶于40μl去離子水，即提取得到樣品DNA。
（2）配置數字PCR反應體系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針HLB1-P、KYB1-P各0.4μL，10μM的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.8μL，柑橘病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O補足至16μL。
（3）PCR擴增：96℃預變性10min；98℃，變性30s，60℃延伸2min，共進行40個循環；最后10℃停止反應。
（4）檢測擴增產物的熒光信號，確定柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的靶標的拷貝數：擴增產物熒光信號的檢測方式為讀取FAM與VIC通道的熒光信號，通過QuantStudio? 3D Digital PCR機載軟件進行定量分析，計算靶標拷貝數。
本發明的有益效果在于：
（1）可進行簡便可靠的絕對定量：本發明所使用的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法采用了數字檢測芯片系統，其數字PCR的檢測芯片微孔數遠大于樣品中病原菌的靶標拷貝數，該方法通過樣品極限稀釋、泊松分布和終點法PCR，來實現核酸的絕對定量，因此本方法的靶標定量檢測不依賴于擴增曲線的閾值，不受PCR擴增效率的影響，也不需建立標準曲線，不需進行復雜的轉化運算，因此更加簡便的實現絕對定量分析，并具有更好的檢測準確度和重現性。
（2）抗雜質干擾能力強，檢測靈敏度高：已有的柑橘黃龍病菌和潰瘍病菌實時熒光定量PCR檢測方法由于受到柑橘樣品中的雜質及柑橘基因組的干擾，對低含菌量柑橘病樣的檢測極為困難，而本方法的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法，可將每個樣品分成20,000多個均勻的納升級微滴，其中每個微滴都作為一個獨立的PCR反應器，這種方法可在很大程度上把柑橘樣品中的雜質及柑橘基因組與病原菌靶標隔離開，極大的減少了其他物質的干擾，由于該方法使每一出現陽性熒光的微孔對應一個病原菌靶標拷貝，因此即使檢測體系中僅有一個靶標拷貝也可以很好的檢出。
（3）高特異性：本發明根據柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的特有序列設計了特異性引物和特異探針，其特異性高，且非常穩定，保證了反應的順利進行，進一步確保柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌檢出的特異性。
（4）功能更多：本發明同時使用柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的特異性引物和不同熒光標記的特異探針，結果讀取時使用兩個不同的熒光檢測通道，可在一次實驗可同時檢出2種病原菌，減少了實驗時間和步驟。
（5）檢測速度快：本發明提供的方法和試劑盒方便快捷，整個檢測時間僅需要數小時，節省大量人力成本和時間成本。
綜上，本發明試劑盒和方法可以滿足柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的早期、準確、定量分析的要求，可為柑橘黃龍病菌與柑橘潰瘍病菌的早期、精確和定量檢測、流行病學調查提供科學依據，具有良好的發展應用前景。
具體實施方式
為更好的理解本發明的內容，下面結合具體的實施例做進一步說明，下列具體實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的限止。
實施例1：引物初步篩選及檢測。
利用primer primer5軟件檢測引物間的互補性及引物退火溫度，選擇退火溫度適宜、擴增的目的片段易于區分的引物對。本發明針對柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌各設計2對引物和探針。
本實施例給出了篩選最佳引物的過程，用于篩選的備選引物如下，見表1。
表1 柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的備選引物序列
用于備選的引物及探針組合包括：HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，HLB2-F+HLB2-R+HLB2-P，KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P，KYB2-F+KYB2-R+KYB2-P，使用探針法熒光定量PCR分別進行特異性分析，20μL的反應體系，Premix Ex Taq緩沖液10μL、模板3μL，引物終濃度500 nM，探針終濃度250 nM，補ddH2O至20 μL。PCR反應程序：95℃預變性20s，然后95℃ 5s，58℃ 40s，40個循環，最后10℃停止反應。其Ct值如表2所示，因此根據實驗結果選擇檢測效果更好的HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，和 KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物與探針組合。
表2 不同引物對熒光定量PCR中的Ct值
實施例2：引物特異性分析
為驗證本發明柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法對柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌檢測的特異性，分別運用HLB1-F + HLB1-R+ HLB1-P，和 KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物與探針組合對黃龍病和潰瘍病病樣進行檢測。運用數字定量PCR體系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針和引物HLB1-P、KYB1-P、HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.4μL，柑橘病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O 補足至16μL。數字PCR擴增反應程序為：96℃預變性10min；58℃延伸2min，98℃變性30s；共進行40個循環，最后10℃停止反應。在FAM通道下檢測本研究室保存的柑橘潰瘍病病樣、柑橘炭疽病病樣、柑橘腳腐病病樣、柑橘衰退病病樣、柑橘裂皮病病樣、柑橘黃龍病病樣、柑橘潰瘍病陽性對照樣品、柑橘黃龍病陽性對照樣品、健康柑橘陰性對照樣品的熒光信號，結果顯示：柑橘黃龍病病樣與柑橘黃龍病陽性對照樣品為陽性，其余樣品顯示陰性。在VIC通道下檢測本研究室保存的柑橘潰瘍病病樣、柑橘炭疽病病樣、柑橘腳腐病病樣、柑橘衰退病病樣、柑橘裂皮病病樣、柑橘黃龍病病樣、柑橘潰瘍病陽性對照樣品、柑橘黃龍病陽性對照樣品、健康柑橘陰性對照樣品的熒光信號，結果顯示：柑橘潰瘍病病樣和潰瘍病陽性對照樣品為陽性，其余樣品顯示陰性，實驗結果見表3。該實驗表明HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，和KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物與探針組合有較好的檢測特異性。
表3 數字PCR定量檢測方法的檢測特異性驗證
實施例3：不同退火溫度對柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR的影響.
運用HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，和KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P的引物與探針組合。運用數字定量PCR體系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針和引物HLB1-P、KYB1-P、HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.4μL，柑橘黃龍病與柑橘潰瘍病復合侵染病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O補足至16μL。PCR擴增反應程序為：96℃預變性10min，98℃變性30s，然后分別在溫度梯度（56，58，60，62）下退火延伸2min，共進行40個循環；最后10℃停止反應。
結果：不同退火溫度下，FAM信號通道和VIC檢測通道中的檢測值差異不大，根據實驗結果選擇60℃的退火延伸溫度。
實施例4：不同引物和探針濃度對柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR反應的影響.
運用不同濃度組合的HLB1-F+HLB1-R+HLB1-P，與 KYB1-F+KYB1-R+KYB1-P進行數字PCR檢測。運用數字定量PCR體系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，引物探針HLB1-F/HLB1-R/KYB1-F/KYB1-R/HLB1-P/KYB1-P濃度均為10μmol/L，加入不同體積的引物和探針，柑橘黃龍病與柑橘潰瘍病復合侵染病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O 補足至16μL。PCR擴增反應程序為：96℃預變性10min；98℃，變性30s；60℃退火延伸2min，共進行40個循環，最后10℃停止反應。所使用的引物、探針量以及試驗結果如表4所示。
表4 雙重PCR體系中不同濃度的引物與探針組合。
根據實驗結果，選擇最佳的第3個組合。
實施例5：柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法的建立
1、雙重數字PCR定量檢測試劑盒的組裝
柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測試劑盒，該試劑盒包含：柑橘病樣DNA提取試劑、數字PCR反應試劑、黃龍病菌與潰瘍病菌陽性對照樣品模板和陰性對照樣品模板。
所述DNA提取液包括：2% CTAB 溶液 [2% CTAB (w/v), 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% (v/v) PVP]；巰基乙醇；酚/氯仿溶液；無水乙醇溶液。
所述PCR反應試劑包括：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 濃度為10μmol/L的引物HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R各1支，200μL 濃度為10μmol/L的探針HLB1-P以及KYB1-P各1支，1mL濃度為50ng/μL的柑橘黃龍病菌陽性對照樣品模板、柑橘潰瘍病菌陽性對照樣品模板以及陰性對照樣品模板各1支。
所述引物與探針的序列為：
柑橘黃龍病菌的特異引物及探針為：
上游引物HLB1-F：5'-GGCTCAACCTTGGAACTGC-3'
下游引物HLB1-R：5'-TTGCTCCCCACGCTTTC-3'
探針HLB1-P：FAM 5’-TTGTCTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGG-3’ BHQ
該探針5’ 端熒光報告基因為FAM，3’ 端淬滅基團為BHQ；
柑橘潰瘍病菌的特異引物及探針為：
上游引物KYB1-F：5'-GGACCGTCGCTGTCAAGTA-3'
下游引物KYB1 -R：5'-CAACTGTAACGGTGGACCTC-3'
探針KYB1 -P：HEX 5'-CACTGTTTGCCGACGCCAACG-3' BHQ
該探針5’端熒光報告基因為HEX，3’端淬滅基團為BHQ。
2、一種柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法，其具體檢測方法包括如下步驟：
（1）提取柑橘病樣DNA：
g)采集柑橘病樣200mg，加液氮研磨成粉末狀；
h)研磨粉末加入500μl的CTAB提取緩沖液及5μL巰基乙醇，震蕩混勻，65℃水浴20min，12000 r/min,離心10 min；
i)吸取上清液，加入等體積的酚/氯仿溶液,混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min；
j)吸取上清，加入等體積無水乙醇，12000 r/min,離心10 min；
k)棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
l)室溫下干燥沉淀，溶于40μl去離子水，即提取得到樣品DNA。
（2）配置數字PCR反應體系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針HLB1-P、KYB1-P各0.4μL，10μM的探針HLB1-F、HLB1-R、KYB1-F、KYB1-R、各0.8μL，，柑橘病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O補足至16μL。
（3）PCR擴增：96℃預變性10min；98℃，變性30s，60℃延伸2min，共進行40個循環；最后10℃停止反應。
（4）檢測擴增產物的熒光信號，確定柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌的靶標的拷貝數：擴增產物熒光信號的檢測方式為讀取FAM與VIC通道的熒光信號，通過QuantStudio? 3D Digital PCR機載軟件進行定量分析，計算靶標拷貝數。
實施例6柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法與現有熒光定量PCR檢測方法的檢測靈敏度對比分析
為比較本檢測方法與現有的熒光定量PCR檢測方法的檢測靈敏度，提取黃龍病菌和潰瘍病菌復合侵染樣品的DNA模板，然后10 倍梯度稀釋為10-1至10-5等系列稀釋液，作為PCR的模板。以本試劑盒中二個病原菌的陰性對照模板和陽性對照模板為參照，使用柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法進行檢測，實驗檢測方法及體系參照本發明前述說明。同時作為對照，分別使用現有的黃龍病菌與柑橘潰瘍病菌熒光定量PCR檢測方法進行檢測，柑橘黃龍病菌實時熒光定量PCR實驗參照文獻：Wenbin Li et al.,2006；柑橘潰瘍病菌實時熒光定量PCR實驗參照文獻：J. Cubero and J. H. Graham, 2005。實驗結束后，記錄檢測結果。
結果發現：兩種檢測方法均對黃龍病與潰瘍病罹病樣檢出陽性結果。本發明所用的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法在樣品稀釋梯度為10-1至10-4的4 個DNA 模板中可檢出陽性結果(表4)，其中在10-4稀釋的DNA 模板中可以檢測到約0.811個柑橘黃龍病靶標和1.623個柑橘潰瘍病菌靶標；而現有的黃龍病菌熒光定量PCR檢測方法和潰瘍病菌熒光定量PCR檢測方法只能在10-1至10-3等3個稀釋度DNA 模板中檢出陽性結果。表明本發明所采用的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法不但可以同時檢測柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌，而且其檢測靈敏度比現有的黃龍病菌及潰瘍病菌熒光定量PCR檢測方法的檢測靈敏度高10倍。
表5 兩種病原菌檢測方法的檢測靈敏度對比研究。
實施例7. 柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法對田間實際樣品的檢測
進一步于廣東的高要、懷集等地砂糖橘園中從1-12月各采集1個柑橘病樣，每地各采集12個樣品，提取DNA使用雙重數字PCR檢測方法進行檢測。結果：本發明所用的柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重數字PCR定量檢測方法在36個樣品中，檢測出16個黃龍病菌陽性樣品，同時檢測出7個潰瘍病菌陽性樣品。10、11、12月份采集的樣品更易檢出黃龍病菌，而4、5、6、7、8、9月份采集的樣品更易檢出潰瘍病菌。
表6 田間柑橘病樣的實際檢測
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 廣東省農業科學院植物保護研究所
<120> 柑橘黃龍病菌和柑橘潰瘍病菌雙重檢測試劑盒及其應用
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> HLB1-F
<400> 1
ggctcaacct tggaactgc 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> HLB1-R
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ttgctcccca cgctttc 17
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ttgtctagag tttaggagag gtgagtgg 28
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