一種食品及飼料中鴨源成分檢測用試紙條試劑盒及其應用的制作方法

本發明涉及食品檢測技術領域，具體是一種食品及飼料中鴨源成分檢測用試紙條試劑盒及其應用。

背景技術：

歐盟和美國分別在1994年和1997年制定禁止在反芻動物的飼料中添加反芻動物源性蛋白的法規，2000年歐盟將這項禁令擴大到禁止向用于食用的動物飼喂加工過的哺乳動物、鳥類和魚類蛋白成分。我國農業部于2004年頒布的《動物源性飼料產品安全衛生管理辦法》中規定禁止在反芻動物飼料中使用動物源性飼料產品（乳及乳制品除外），但在動物飼料中人為摻入反芻動物（主要是牛、羊）肉和骨制品的現象時有發生。

鴨源性成分（Duck-derivedmaterials）鴨種屬DNA片段。市場銷售的牛羊肉及肉制品中，很多都摻雜鴨肉，冒充牛羊肉進行銷售，為彌補羊肉味不足，有的甚至摻入羊肉粉、羊肉精膏等添加劑來粉飾其摻假行為，市場上出現了名副其實的“掛羊頭賣鴨肉”等嚴重摻假造假行為，拿鴨肉添加羊肉香精，制成羊肉去欺騙消費者，這既違反相關規定，更是一種商業欺詐。

傳統的食品及飼料中動物性成分鑒定主要通過顯微鏡檢、基于蛋白質檢測的免疫學方法以及基于核酸檢測的各類PCR方法，近年還發展了近紅外檢測法（NIRS）。飼料成分中摻入的各種動物源成分在高溫處理和加工過程中易于受到破壞，不同種屬動物的蛋白質序列之間差異不大，難以區別，發明專利“SDS-PAGE法鑒別肉及肉制品中動物源性成份”（公開號：CN102213720A）提供了一種以蛋白質的SDS-PAGE電泳方式鑒定豬、牛、羊、雞、魚的動物蛋白的方法，但不同來源和處理方式的蛋白電泳譜帶不同，帶來結果判別的障礙，對于飼料中的動物成分更難以實施。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種高靈敏度、高特異性的食品及飼料中鴨源成分檢測用試紙條試劑盒及其應用。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種食品及飼料中鴨源成分檢測用試紙條試劑盒，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的引物組和核酸檢測試紙條；所述的引物組的核苷酸序列為上游引物5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’，如SEQ ID No.1所示，下游引物5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’，如SEQ ID No.2所示；所述的核酸檢測試紙條的襯底上依次設有樣品墊、吸水墊和結合物墊；所述的樣品墊由側向層析基質、嵌于側向層析基質內的檢測帶和質控帶組成，所述的側向層析基質為硝酸纖維素膜或尼龍膜，所述的檢測帶上固定有第二種核酸標記物的抗體，所述的質控帶上固定有可結合特定種屬來源抗體的抗體；所述的結合物墊上固定有第一種核酸標記物的抗體或配體的膠體金顆粒或乳膠顆粒。

作為本發明進一步的方案：選擇生物素分子、異硫氰酸熒光素或地高辛中兩種不同的方法對該引物組的5′端分別進行標記，以便于檢測。

作為本發明進一步的方案：PCR反應體系包括：10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH₂O 1.9μL。

作為本發明進一步的方案：PCR反應條件為：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

所述的試紙條試劑盒在食品及飼料中鴨源成分檢測方法中的應用：取樣品進行PCR反應，PCR反應體系包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH₂O 1.9μL，共20μL；PCR反應條件為：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存；取5μL PCR擴增產物加入到95μL展開液中進行檢測點于樣品墊，5min后觀察結果：當僅在質控帶出現一條紅色條帶，在檢測帶內無紅色條帶出現，證明所測試的樣品不含鴨源成分；當出現兩條紅色條帶，一條位于檢測帶內，另一條位于質控帶內，證明所測試的樣品含有鴨源成分；當質控帶和檢測帶內均無紅色條帶出現，表明該核酸試紙條失效。

作為本發明進一步的方案：所述的展開液的組分及含量如下：8mM的Tris、1.2wt.%的BSA、1.4wt.%的吐溫20以及0.1～0.2mol/L的NaOH。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

由于本發明是以標記的特異性引物擴增適當長度的基因片段，能夠保證檢測的高度特異性，從而保證了檢測結果的準確性。本發明具有以下優點：操作簡單，只需要把核酸擴增后的樣品直接滴到試紙條試劑盒的核酸試紙條上即可，不需要專業人員操作，便于推廣；快速：檢測5分鐘后判讀結果；靈敏，與瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測靈敏度提高近100～200倍；特異性高，由于在檢測過程中加使用的為特異性標記引物，使結果更加準確；價格便宜，費用大大低于傳統的凝膠電泳和ELISA檢測。

附圖說明

圖1是特異性試驗的檢測結果；

圖2是靈敏度試驗的檢測結果；

圖中：1-鼠；2-牛；3-兔；4-馬；5-羊；6-狗；7-豬；8-貓；9-雞；10-鴨；11-鵝；12-NTC空白對照（水）。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

本發明實施例中，一種食品及飼料中鴨源成分檢測用試紙條試劑盒，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示的引物組和核酸檢測試紙條；引物組的核苷酸序列為上游引物5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’，如SEQ ID No.1所示，下游引物5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’，如SEQ ID No.2所示；該引物組的5′端分別進行標記以便于檢測，具體可以選擇生物素分子、異硫氰酸熒光素或地高辛中兩種不同的方法標記。核酸檢測試紙條的襯底上依次設有樣品墊、吸水墊和結合物墊；樣品墊由側向層析基質、嵌于側向層析基質內的檢測帶和質控帶組成，側向層析基質為硝酸纖維素膜或尼龍膜，檢測帶上固定有第二種核酸標記物的抗體，質控帶上固定有可結合特定種屬來源抗體的抗體；結合物墊上固定有第一種核酸標記物的抗體或配體的膠體金顆粒或乳膠顆粒。

PCR反應體系，包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH₂O 1.9μL。

PCR反應條件為：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

將該試劑盒用于食品及飼料中鴨源成分的檢測，具體步驟為：

（1）采用兩條獨特的擴增引物，其中上游引物具有如下序列：5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’，如SEQ ID No.1所示，用抗原或半抗原生物素分子、異硫氰酸熒光素或地高辛中的一種標記標記5’端；下游引物的序列為5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’， 如SEQ ID No.2所示，以不同于上游引物的一種標記標記5’端；在適宜的擴增條件下，擴增得到特異性核酸片段擴增產物；當無被檢核酸模板存在時，無特異性核酸片段擴增產物；

（2）將一種標準的通用抗體，如抗地高辛抗體與膠體金顆粒交聯，在顆粒表面形成包被的抗體；

（3）將另一種標記分子的抗體或配體，如抗異硫氰酸熒光素抗體或生物素分子的配體-鏈親和素分子以線條狀固定于膜上形成檢測線；

（4）當存在待檢的特異性擴增產物時，因上游引物、下游引物的作用，擴增產物中同時帶有上述三種標記物中的兩種，形成標記分子1-擴增產物-標記分子2的復合物；

（5）將步驟（4）形成的標記分子1-擴增產物-標記分子2與膠體金顆粒表面包被的標志物1的抗體結合，形成了抗標志物1抗體-標志物1-擴增產物-標志物2有色顆粒復合物；

（6）將步驟（5）得到的有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至涂布有標志物2的抗體或配體的線條上，復合物因與標志物2的抗體（配體）結合而沉積，滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，判定為陽性；

（7）當特異性擴增產物不存在時，不發生上述步驟（4）-（6），不能形成標志物1-擴增產物-標志物2復合物，也就不能形沉積于檢測線上標志物2的抗體（配體）之上，不形成可見的條帶，判為陰性。

實際的檢測結果有三種：1）陰性，僅在質控帶出現一條紅色條帶，在檢測帶內無紅色條帶出現，證明所測試的樣品不含鴨源成分；2）陽性，出現兩條紅色條帶，一條位于檢測帶內，另一條位于質控帶內，證明所測試的樣品含有鴨源成分；3）無效，質控帶和檢測帶內均無紅色條帶出現，表明該核酸試紙條失效。

實施例1

1 材料與方法

鴨基因組DNA

1.2 引物設計

1.3 PCR擴增體系

PCR反應體系，包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH₂O 1.9μL，共20μL。

PCR反應條件：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

同時分別取5μL用于核酸試紙條檢測，取5μL擴增產物，加入到95μL展開液（8mM的Tris、1.2wt.%的BSA、1.4wt.%的吐溫20以及0.1～0.2mol/L的NaOH）中進行檢測點于樣品墊，5min后觀察結果。

1.4 PCR特異性實驗

利用建立起來的PCR反應體系對1-鼠；2-牛；3-兔；4-馬；5-羊；6-狗；7-豬；8-貓；9-雞；10-鴨；11-鵝；12-NTC空白對照（水）驗證其特異性。

2結果

2.1 PCR反應體系及條件

請參閱圖1，采用TAKARA公司的HS Taq DNA polymerase，總反應體系為20μL。用Bio-Rad PCR儀進行檢測，反應參數為：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。取5μL產物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，電泳后判斷有無特異性條帶。核酸擴增后試紙條與凝膠電泳的檢測結果顯示于圖1中。

2.2 特異性試驗

本發明建立的PCR方法對鴨基因組DNA具有較好的特異性，對其他哺乳動物及家禽類物種等無交叉反應。

實施例2

核酸試紙條檢測方法的靈敏性，將PCR模板以1/10，1/10²，1/10³，1/10⁴，1/10⁵，1/10⁶，1/10⁷，1/10⁸，1/10⁹，1/10¹⁰的比例稀釋后，按已建立的PCR體系進行擴增。

1 材料與方法鴨基因組DNA

1.2 引物設計

1.3 PCR擴增體系

PCR反應體系，包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH₂O 1.9μL，共20μL。

PCR反應條件：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

分別取5μL用于瓊脂糖凝膠電泳。凝膠電泳條件為：1×TBE緩沖液，電壓100V，電泳時間30min。同時分別取5μL用于核酸試紙條檢測，取5μL樣品點于樣品墊，加入到95μL展開液（8mM的Tris、1.2wt.%的BSA、1.4wt.%的吐溫20以及0.1～0.2mol/L的NaOH）中進行檢測，5min后觀察結果。

2 結果

2.1 PCR 反應體系及條件

請參閱圖2，采用TaKaRa公司的HS Taq DNA polymerase，總反應體系為20μL。用Bio-Rad T-100PCR儀進行檢測，反應參數為：95℃預變性5min，1個循環；94℃變性30sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，擴增30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。取5μL產物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，電泳后判斷有無特異性條帶。核酸擴增后試紙條與凝膠電泳的敏感度比較結果顯示于圖2中，由圖2的結果可以看出：與傳統的凝膠電泳相比，其敏感度增加至少200倍。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。