一種同時制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學對照品的方法與流程

本發明涉及藥物制備技術領域，具體是一種同時制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學對照品的方法。

背景技術：

野漆樹苷（Rhoifolin），是類黃酮化合物，來源于沽油科山香圓的干燥葉和蕓香科植物果實，藥理作用：抗氧化，抗腫瘤，抗高血壓，黃嘌呤氧化酶抑制劑，由于是黃嘌呤氧化酶抑制劑，可以有效抑制體內尿酸的生成，因而是開發治療痛風新藥的特效成分。

柚皮苷（Naringin）是一種雙氫黃酮類化合物，有苦味，天然存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎補、枳實、枳殼、化橘紅等中藥的主要有效成分之一。柚皮苷具有多方面的生物活性，例如：抗氧化作用、抗癌作用、抗炎作用、抑菌作用和降血脂等作用。

目前，對相關天然產物的提取分離，藥物生理活性的研究，藥量藥效質量控制，需要檢測野漆樹苷和柚皮苷的含量，因而需要使用對照品，由于柚皮柚普遍存在，對照品容易獲得，價格一般（65元/20mg），野漆樹苷植物來源少，其對照品價格昂貴，1300元/20mg，是柚皮苷價格的20倍。目前，野漆樹苷的來源主要為中藥山香圓葉或蕓香科毛橘紅果實，它們的含量均比較低，只占干物質的0.1～0.6％，提取分離困難，在化橘紅果實中，野漆樹苷不足柚皮苷的5%，而且野漆樹苷與柚皮苷結構與性質高度相似，因而在提取分離中難以分開，要得到純度高的野漆樹難度更大，化橘紅葉中的野漆樹苷含量較高，是果實中的十幾倍，葉齡越小，野漆樹苷和柚皮苷的比例越大，野漆樹苷含量甚至比柚皮苷的高，兩者的總和占干物質量可達13%以上。

溶劑法從化橘葉中提取野漆樹苷，通過液液萃取分離去除葉綠素和柚皮苷，再通過結晶和重結晶可得到純度高的野漆樹苷，但是要把大量的柚皮苷去除，工藝復雜，有機溶劑用量大，得率低，成本高。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種同時制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學對照品的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

本發明從中藥化橘紅葉中同時制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學對照品，包括化橘紅葉經柱層析乙醇溶液提取、正丁醇-石油醚混合液萃取、水洗去除水溶性雜質、反相高效液相制備色譜精制四個步驟，從而得到野漆樹苷和柚皮苷兩種化學對照品。兩種對照品的結構如下：

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種同時制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學對照品的方法，步驟如下：

（1）化橘紅葉粉末制備：摘取化橘紅嫩葉，50～60℃烘箱烘干至恒重，粉碎過40～60目篩，得粉末備用；

（2）柱層析法提取：葉粉末用乙醇溶液濕樣上柱，用相同濃度乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得化橘紅葉的乙醇提取物浸膏；

（3）有機溶劑萃取除去葉色素：浸膏轉移到分液漏斗，分3次用水洗滌燒瓶，合并到分液漏斗，用等體積正丁醇-石油醚混合液萃取去上層液，重復3次，得下層溶液混合物及沉淀；

（4）水洗去除水溶性雜質：上述所得下層部分轉置4℃冰箱靜置12～20h，用冷水洗滌離心，去除水溶性多糖和蛋白質雜質，得粗產品；

（5）反相高效液相制備色譜精制：粗產品混合物以甲醇-水溶液溶解，0.22μm微孔濾膜過濾，以反相高效液相制備色譜儀分離，甲醇-水溶液為洗脫系統，325nm檢測，分別收集制備色譜中的兩個色譜峰物質，減壓回收溶劑，48～52℃恒溫真空干燥22～26h，即得野漆樹苷和柚皮苷兩個化學對照品。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（1）中的嫩葉是抽出10～20天的嫩葉。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（2）中層析柱直徑為2～8cm，上樣的高徑比為9～11，洗脫液體積濃度為70～95%，收集洗脫液體積3～8倍量，減壓溫度45～80℃。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（3）中正丁醇-石油醚混合液其體積比為0.5～1.5：9.5～8.5，萃取3～4次。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（4）中水洗去除水溶性雜質時，用水量是樣品體積2～4倍，離心轉速4000～10000r/min，重復3次。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（5）中野漆樹苷和柚皮苷的混合物以60％的甲醇溶解，樣品濃度為20～30mg/mL，反相高效液相制備色譜柱為ODS-C18。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（5）中，反相高效制備液相進樣體積為1～4mL，流速為10～15mL/min，流動相為甲醇-水溶液，梯度洗脫，時間程序：30%甲醇（0～5min），30～50%甲醇（5～25min）。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟（5）中，收集保留時間分別為13.5min和20.0min的餾分。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

1、本發明首次從化橘紅葉中制備野漆樹苷和柚皮苷兩個化學對照品，效率高，成本低，有效利用化橘紅葉資源，開辟了兩種化學對照品制備的新途徑，特別是野漆樹苷對照品的來源。

2、本發明工藝簡單，化橘紅葉經乙醇提取、正丁醇-石油醚萃取、反相高效液相制備色譜精制三個步驟，即可同時獲得純度大于98％的野漆樹苷和柚皮苷兩個化學對照品。

3、本發明成本低，綠色環保。原料資源化橘紅葉來源豐富、價廉，它含有兩種黃酮總和占干物質的6～13.8%，所用試劑全部可回收利用。

附圖說明

圖1為高效液相制備柚皮苷與野漆樹苷色譜圖（325nm），從圖中可看出，在325nm波長被檢測到的主要為柚皮苷和野漆樹苷，并且柚皮苷的保留時間先于野漆樹苷約6min，因此有足夠的時間差可以讓它們徹底分開。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

（1）乙醇提取：將化橘紅葉粉碎，過40目篩，稱取1kg粉末，用95%濕法均勻裝入玻璃層析柱中，用95%乙醇作洗脫液，洗脫液速度10mL/min，收集洗脫液2L。

（2）正丁醇-石油醚混合液萃取：收集的洗脫液經旋轉蒸發減壓濃縮回收溶劑，得化橘紅葉的乙醇提取物浸膏約125mL，轉移到分液漏斗，分三次用少量水洗殘余，合并到分液漏斗，共200mL，用200mL正丁醇-石油醚（V/V，1：9）混合液萃取3次，去除上層葉色素液，得到下層含目標成分沉淀和溶液。

（3）冷卻析出：把上述得到的下層部分轉移到離心管中，用鹽酸調節pH4，置4℃冰箱中過夜，取出冷凍離心機離心15min，轉速8000r/min，去上清液，沉淀再用3倍冷水洗滌2次，得到淡綠色沉淀，即野漆樹苷和柚皮苷混合物粗產品，干重7.2g。

（4）反相高效液相制備色譜精制：野漆樹苷和柚皮苷的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成濃度為30mg/mL的樣品溶液，微孔濾膜過濾，色譜柱為ODS-C18（10mm×250mm，15μm），進樣體積為4mL，流速為30mL/min，流動相為甲醇-水溶液，梯度洗脫，時間程序：30%甲醇（0~5min），40%甲醇（5~25min），收集保留時間分別為13.5min和20.0min的餾分，減壓回收溶劑，干燥，即得柚皮苷和野漆樹苷兩種對照品。

采用反相高效液相分析色譜分析了其純度，純度均達到98％以上，如圖1所示。單針進樣可獲取野漆樹苷56mg、柚皮苷45mg，收率約為89％，野漆樹苷淡綠色粉末，柚皮苷為白色粉末。

實施例2

（1）乙醇提取：將化橘紅葉粉碎，過40目篩，稱取1kg粉末，用95%濕潤均勻裝入玻璃層析柱中，用95%乙醇作洗脫液，洗脫速度10mL/min，收集洗脫液3L。

（2）正丁醇-石油醚混合液萃取：收集的洗脫液經旋轉蒸發減壓濃縮回收溶劑，得化橘紅葉的乙醇提取物浸膏約150mL，轉移到分液漏斗，分三次用少量水洗殘余，合并到分液漏斗，共200mL，用200mL正丁醇-石油醚（V/V，1：9）混合液萃取4次，去除上層葉色素液，得到下層含目標成分沉淀和溶液。

（3）冷卻析出：把上述得到的下層部分轉移到離心管中，用鹽酸調節pH4，置4℃冰箱中過夜，取出冷凍離心機離心15min，轉速5000r/min，去上清液，沉淀再用2倍冷水洗滌3次，得到淡綠色沉淀，即野漆樹苷和柚皮苷混合物粗產品，干重8.1g。

（4）反相高效液相制備色譜精制：野漆樹苷和柚皮苷的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成濃度為50mg/mL的樣品溶液，微孔濾膜過濾，色譜柱為ODS-C18（20mm×250mm，15μm），進樣體積為5mL，流速為50mL/min，流動相為甲醇-水溶液，梯度洗脫，時間程序：30%甲醇（0~5min），40%甲醇（5~25min），收集保留時間分別為13.5min和20.0min的餾分，減壓回收溶劑，干燥，即得柚皮苷和野漆樹苷兩種對照品。

采用反相高效液相分析色譜分析了其純度，純度均達到98％以上。單針進樣可獲取野漆樹苷106mg、柚皮苷129mg，收率約為86％，野漆樹苷淡綠色粉末，柚皮苷為白色粉末。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。