一種快速鑒定牛肉的方法與流程

本發明屬于食品檢測和動物分子生物學技術領域，涉及一種快速鑒定牛肉的方法，適用于鑒定未知樣品是否是牛肉或是否含有牛肉成份。

背景技術：

隨著我國居民生活水平的提高，僅國內生產的肉類遠不能滿足市場需求，需要從國外進口一部分肉類。這些因素為國內外不法商販乘虛而入創造了條件。為保障消費者合法權益，確立有效的肉源性成份鑒定方法十分必要。

PCR (polymerase chain reaction)，即DNA聚合酶鏈式反應，是20世紀80年代發明的集高度特異性、靈敏性、高效性為一體的分子生物學技術，廣泛應用于涉及生物的諸多領域，包括物種鑒定、法學鑒定、藥品/食品/飼料等諸多樣品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分為傳統PCR和實時熒光定量PCR (qPCR)。傳統PCR又分為使用Taq DNA聚合酶和pfu等高保真DNA聚合酶的兩種PCR。

在實際工作中Taq DNA聚合酶的傳統PCR和實時定量PCR均在使用，前者通常耗時長，后者雖檢測時間短，卻存在試劑、耗材及檢測設備昂貴的問題。

技術實現要素：

為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種快速鑒定牛肉的方法。

本發明采用以下技術方案解決上述技術問題：一種快速鑒定牛肉的方法，包括以下步驟：

步驟1：設計特異性識別牛細胞色素b基因片段的1對引物；

步驟2：將牛肉總DNA的濃度調至20 ng/μL作為樣品PCR檢測的模板；

步驟3：使用步驟1的引物和步驟2的模板，借助PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR擴增牛細胞色素b基因特定片段；

步驟4：通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟3的PCR擴增產物；

步驟5：根據步驟4的電泳檢測結果，判斷樣品是否是或者是否含有牛肉或牛的其他組織成份。

所述牛細胞色素b基因片段的1對引物，上游引物堿基序列：5′-aatacactacacatccgacac-3′，下游引物堿基序列：5′-gacccgtaatataagcctcg -3′，濃度均為2 pmol/μL。

所述PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR擴增牛細胞色素b基因特定片段的PCR反應體系為10μL ，其中PrimeSTAR MAX Premix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。

所述PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR擴增牛細胞色素b基因特定片段的PCR程序為：98℃變性/10 s，63℃退火/5 s，72℃延伸反應/5 s，30次循環。

所述根據步驟4的電泳檢測結果，判斷樣品是否是或含有牛肉或牛的其他組織成份，若出現162 bp PCR產物，表明檢測樣品是或含有牛肉或牛的其他組織成份；反之不是或不含有牛肉或牛的其他組織成份。

本發明的有益效果：使用自行設計的識別牛細胞色素b基因片段的一組引物，結合TaKaRa公司的PrimeSTAR MAX DNA聚合酶（一種高保真DNA聚合酶），既解決了實時定量PCR成本高的問題，亦解決了傳統Taq PCR耗時長的不足。本發明僅通過40分鐘PCR和20分鐘瓊脂糖凝膠電泳共計1小時的時間即可完成樣品是否是牛肉的鑒定，該發明可直接用于牛肉成份鑒定的試劑盒生產。

附圖說明

圖1為本發明實施例中以牛肉、豬肉、豬肝和羊肉為模板，使用特異性識別牛細胞色素b基因片段的引物，實施PCR獲得產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測的圖譜。

具體實施例

現結合實施例，進一步說明使用本發明的引物結合PrimeSTAR MAX DNA聚合酶鑒定牛肉的良好效果。本發明使用杭州朗基MG96+型PCR儀，但并不限制使用其他公司的儀器。

制備完全相同的4組，分別以牛肉、豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板，其他條件相同，共計4管10μL PCR反應體系：PrimeSTAR MAX Premix：5μL；濃度均為2 pmol/μL的上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。PCR程序如下：98℃變性/10 s，63℃退火/5 s，72℃延伸反應/5 s，30次循環。PCR完成后，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行實驗結果檢測。

結果表明，僅在以牛肉總DNA為模板的PCR樣品中檢測到一條位于100-250 bp位置的PCR產物，與預期結果162 bp相吻合，而以豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板進行PCR擴增的樣品中，沒有檢測到特異性條帶，表明本發明設計的引物優良特異性。