一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽及其用途的制作方法

本發明涉及一種海洋活性多肽，特別涉及一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽及其用途。

背景技術：

肺癌是全球范圍內發病率最高的惡性腫瘤，近年來發病率、死亡率逐年上升，已成為腫瘤相關死亡的首要病因。肺癌約80％是非小細胞肺癌，在晚期肺癌中的比例達到總數的40％～50％。目前對于非小細胞肺癌的治療早期是手術切除，晚期主要是化療，但化療的毒副作用及產生的耐藥性，影響治療的有效性，因此尋找精準治療是熱門話題。海洋是一個巨大的藥物寶庫，從海洋中尋找活性物質已成為熱點，并從中分離獲得多種活性物質，如肽類、多糖、生物堿、萜類、大環內脂等，有望開發成新型的抗腫瘤藥物，如從海兔獲得的dolastatin 10已進入臨床試驗。沙蠶(Nereis)屬于環節動物門(Annelida)多毛綱(Polychaeta)沙蠶科(Nereididae)，又稱為海蟲、海蜈蚣、海螞蟥等，其生物資源豐富，廣泛分布在我國沿海地區，近年來人工養殖用于鉤魚的誘餌。沙蠶是一種傳統的海洋中藥，有清熱解毒，消腫止痛，斂瘡生肌，主治癰瘡腫毒等功效。學者們從沙蠶體內獲得了具有良好藥理活性的物質。吉林大學從日本刺沙蠶體內分離出一種沙蠶絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶抑制血小板聚集，改變血液流變學特性，可作為降纖和溶栓藥物，預防和治療心、腦梗塞，腦動脈、肺動脈血栓形成等疾病。然沙蠶酶解多肽的研究較少，而對非小細胞肺癌A549細胞的抑制活性目前尚未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽，對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。

本發明還提供了上述雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽作為制備抗肺癌藥物或抗肺癌保健品的用途。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽，其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。所述雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽有效抑制肺癌A549和H1299細胞的增殖。本發明首次通過酶解的方法從沙蠶體內提取獲得具有抗肺癌作用的多肽，對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。

雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽作為制備抗肺癌藥物的應用。

雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽對肺癌細胞A549和H1299具有明顯的增殖抑制作用。

雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽作為制備抗肺癌保健品的應用。

本發明雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，步驟如下：

(1)樣品預處理：將雙齒圍沙蠶解凍后，清洗干凈，勻漿，得到勻漿液；

(2)酶解：按照每克勻漿液加1mL純凈水的配比，將勻漿液與純凈水混勻，調節pH至11，加入堿性蛋白酶，酶解后得酶解液；

(3)超濾：酶解液滅活，離心，取上清液，經超濾獲得分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分；

(4)陰離子交換層析：收集步驟(3)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分，冷凍干燥，經DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，梯度洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物；

(5)Sephadex G25凝膠層析：將步驟(4)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物采用Sephadex G-25凝膠層析分離純化，蒸餾水洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的Sephadex G25凝膠層析產物；

(6)高效液相色譜分離純化：對步驟(5)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的Sephadex G25凝膠層析產物經濾膜過濾后用采用反相高效液相色譜法分離純化，收集主峰，冷凍干燥后獲得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽。

步驟(2)按照每克勻漿液加300U的加酶量加入堿性蛋白酶，50℃酶解6小時得酶解液；步驟(4)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析的分離條件為：pH 7.2、0.2mM的Tris-HCl緩沖溶液平衡柱子后，將樣品配成250mg/mL，每次上樣量為2mL，每次上樣前過0.22μm的膜。步驟(5)蒸餾水洗脫的洗脫流速為1.1mL/min。步驟(6)反相高效液相色譜法分離純化的色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱；檢測波長：280nm；流速：0.5mL/min；流動相A為含0.05％三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.05％三氟乙酸的超純水，采用梯度洗脫方式：20％～100％A洗脫5～20min；平衡時：流動相A與流動相B的流動相體積比為20：80；柱溫：25℃；自動進樣，進樣量：10μL。

本發明的有益效果是：對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。

附圖說明

圖1五種蛋白酶酶解物對A549細胞的抑制率。

圖2不同分子量的沙蠶多肽對A549細胞增殖的影響。

圖3陰離子DEAE Sepharose Fast Flow洗脫峰。

圖4葡聚糖凝膠柱洗脫峰。

圖5反相高效液相色譜柱洗脫峰。

圖6 PAP對A549細胞活性的影響。

圖7 PAP對H1299細胞活性的影響。

圖8倒置顯微鏡下的A549細胞(×200)。

圖9倒置顯微鏡下的H1299細胞(×200)。

圖10 A549細胞形態,AO/EB染色(×200)。

圖11 H1299細胞形態,AO/EB染色(×200)。

圖12 PAP對A549細胞形態變化的影響，24h Hoechst 33258染色(×200)。

圖13 PAP對H1299細胞形態變化的影響，24h Hoechst 33258染色(×200)。

圖14 A549細胞Annexin V-FITC/PI雙染24h。

圖15 H1299細胞Annexin V-FITC/PI雙染24h。

圖16 A549細胞線粒體膜電位的變化24h。

圖17 H1299細胞線粒體膜電位的變化24h。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。

本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。

實施例：

1材料與方法

1.1原料

1.1.1樣品與試劑

沙蠶購于舟山市水產養殖場，經浙江海洋大學趙盛龍教授鑒定為雙齒圍沙蠶(Perinereies aibuhitensis)，鮮活購買后待用。Folin試劑，上海如吉生物科技發展有限公司；酪氨酸，上海如吉生物科技發展有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，北京亞太恒信生物科技有限公司；酪蛋白，北京亞太恒信生物科技有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；1640粉末培養基，Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，美國sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，美國sigma公司；美國sigma公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，南京凱基生物發展有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒，北京貝博生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

1.1.2細胞

人肺癌A549和H1299細胞株均購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代培養。

1.2主要儀器與設備

DS-1組織搗碎機，上海標準模型廠；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；GF16RXII日立高速低溫離心機，日本HITACHI公司；ALPHA1-4/LDplus型冷凍干燥機，德國CHRIST公司；BSA124S型電子天平，德國SatoriusAG公司；ZHJH-C1209C型超凈工作臺，上海智證分析儀器制造公司；Forma3111型CO₂培養箱，美國Thermo公司；酶標儀，美國Bio-Rad公司產品；BX2-FLB3熒光顯微鏡和CCD-NC6051顯微攝像，日本OLYMPUS公司；WRO-70型超純水儀和easy Cyte6HT-2L流式細胞儀，美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1沙蠶酶解液的制備工藝過程

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種蛋白酶對原料進行酶解。利用正交試驗設計酶解實驗，以氨基氮含量和抗肺癌A549細胞增殖活性為指標的影響，考慮到A(溫度)、B(pH)、C(料液比)、D(酶解時間)和E(加酶量)這五個因素對指標的影響，每個因素設定四個水平進行L₁₆(4⁵)的正交實驗。根據實驗結果比較五種酶在不同水解條件下的水解度和抗腫瘤活性，從而確定原料的最佳酶種及最佳的酶解條件。酶解工藝如下：首先將保存在-80℃的沙蠶解凍后進行勻漿，用0.1mol/L的HCL和0.5mol/L的NaOH溶液將勻漿液調到蛋白酶最適pH值，再加入適量蛋白酶，在水浴鍋中進行酶解。酶解完成后，在100℃中滅活10min，使蛋白酶失去活性。將酶解液12000r/min離心15min，取上清液測定氨基氮(ANN)含量，將其余酶解液冷凍干燥后測定酶解物的抗腫瘤活性。

1.3.1.1最佳蛋白酶種類的選擇

通過上述正交試驗結果可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種蛋白酶酶解沙蠶的最佳酶解條件，在上述最佳酶解條件下，分別對沙蠶進行酶解，12000r/min條件下離心得上清液，冷凍干燥后測定各種蛋白酶酶解物的IR值選擇最佳蛋白酶。

1.3.1.2沙蠶多肽的制備

將沙蠶全體洗干凈后進行勻漿，按照最佳蛋白酶的最佳酶解條件對沙蠶進行酶解。酶解結束后在100℃下在水浴中滅活10min。冷卻后在12000r/min在冷凍高速離心機中離心15min后收集上清液，-20℃冰箱中保存備用。

1.3.1.3酶解多肽的初步分離

酶解獲得的上清液用超濾系統進行超濾分離，獲得了分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，并命名為PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5。將以上組分收集冷凍干燥后，經抗肺癌細胞A549細胞進行細胞增殖抑制活性篩選后，大量收集抗肺癌活性較高的組分，濃縮冷凍干燥，-20℃冰箱中保存備用。

1.3.1.4沙蠶多肽經過陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow層析分離

將1.3.1.3步中得到的抑制肺癌細胞A549增殖活性最強的組分用陰離子柱DEAESepharose Fast Flow進一步分離。分離條件：0.2mM的Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液平衡柱子后，將樣品配成250mg/mL，每次上樣量為2mL，每次上樣前過0.22μm的膜。分別用Tris-HCl(pH 7.2)與NaCl溶液(0～1mol/L)進行梯度洗脫，每個濃度洗脫一個柱體積，洗脫速度為5mL/min，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰，并冷凍干燥，-20℃冰箱中保存備用。將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進行A549細胞增殖抑制率測定，確定目標肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，冷凍干燥，作為進一步分離純化所用樣品。

1.3.1.5沙蠶多肽經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25層析分離

將上步中收集到的增殖活性最強的組分進行進一步分離純化。將冷凍干燥的樣品配置成200mg/mL溶液，上樣量2mL。離心取上清液，經0.22μm濾膜過濾后，將溶液過Sephadex G-25柱進行層析分離，以蒸餾水為洗脫液將柱平衡和洗脫；調節洗脫流速為1.1mL/min，每管收集3.5min，在280nm處檢測吸光度，收集各峰分的洗脫液，將其進行濃縮冷凍干燥。將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進行A549細胞增殖抑制率測定，確定目標肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮冷凍干燥，-20℃冰箱中冷凍備用。

1.3.1.6高效液相分離純化

將上步抑制A549細胞增殖最強的收集的峰分進一步的分離純化，反相高效液相純化色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑5μm 4.6×150mm)；檢測波長：280nm；流速：0.5mL/min；流動相A為乙腈(含0.05％三氟乙酸)，流動相B為超純水(含0.05％三氟乙酸)，采用梯度洗脫方式(20％～100％A洗脫5～20min)，平衡時：流動相A與流動相B的流動相體積比為20：80；柱溫：25℃；自動進樣，進樣量：10μL。

1.3.1.7目標肽的N端測序

使用氨基酸測序儀采用N端氨基酸測序法對純化的多肽的氨基酸序列進行測定，最終以PAP命名該活性多肽。

1.3.2細胞培養

將肺癌細胞A549和H1299在含有雙抗溶液(青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)以及10％胎牛血清的1640培養液中培養。置于37℃、含有5％CO₂的培養箱中孵育，待長滿80％以上時用含0.25％的胰蛋白酶進行消化傳代，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.3抗肺癌細胞活性檢測

1.3.3.1MTT法測定細胞抑制活性

配制實驗所需要的PBS緩沖液(PH值為7.2)、MTT、適量濃度的沙蠶酶解液。將人肺癌細胞每孔1×10⁵個/mL細胞數接種于96孔培養板中，每孔培養液200μL。常規條件下培養24小時后，分別設置正常對照組、空白對照組和用藥組，每組設定3～4個復孔，置常規培養條件下培養一段時間，加入含有10％MTT的200μL的PBS緩沖溶液，在常規培養條件下孵育4小時。實驗畢，棄去96孔板中的液體，每孔加入150μL的DMSO，充分震蕩10min。置于酶標儀中，490nm處測定吸光值，計算細胞增殖抑制率(IR)，計算公式如下：

式中：A₁為正常對照組的吸光度；A₂為用藥組的吸光度；A₀為空白對照組的吸光度。1.3.3.2倒置顯微鏡下觀察細胞形態

將濃度約為1×10⁵/mL的肺癌細胞A549細胞和H1299細胞接種于六孔板的載玻片上，在常規的培養條件下培養24小時，使細胞長到80％左右。棄去培養液，按250mg/L、500mg/L、1000mg/L的藥物濃度加入到六孔板中，并設立空白對照組，繼續培養24小時，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。1.3.3.3AO/EB熒光染色觀察細胞形態

細胞接種與實驗分組同上。24h后，取蓋玻片，用95％乙醇固定30min。取AO和EB各1mg分別溶解于10mL pH 7.2的PBS緩沖液中，搖勻混合，現配現用，避光保存。觀察前于載玻片上滴加50μL PBS和6μL AO/EB混合液，有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.4Hoechst 33258染色

通過Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞的凋亡過程中細胞的形態變化，實驗操作步驟如下所述，選取對數生長期的肺癌細胞株A549和H1299細胞制成約為1×10⁵/mL個單細胞懸液，均勻接種于六孔細胞培養板中，每孔約2mL，放置于37℃、5％CO₂細胞培養條件下24h，分別給予不同濃度的250mg/L、500mg/L和1000mg/L作用細胞，另外設置實驗空白對照組，繼續進行培養。24h后終止對各組細胞的培養，每孔中給予4％多聚甲醛固定20min，然后再用PBS沖洗，用Hoechst 33258熒光染液(終濃度為0.5～10mg/L)常溫染色15min，再次用PBS沖洗，最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察PAP作用后的A549和H1299細胞的形態學變化并拍照。1.3.3.5流式細胞儀分析細胞凋亡率

A549細胞和H1299細胞約為1×10⁵/mL接種于25mL的培養瓶中，常規培養24h后分別加入含250mg/L、500mg/L和1000mg/L的PAP的培養液繼續培養，設立空白對照組。繼續培養24h后，參照凋亡試劑盒中的操作方法進行。胰蛋白酶消化，預冷的PBS懸浮細胞，1000r/min離心5min。去上清，加入1×Annexin V結合液400μL吹打混勻。加入5μL Annexin V-FITC染液，混勻后避光孵育15min后，再加入10μL的PI染液，室溫下暗室靜置5min后過200目篩子，再用流式細胞儀進行檢測。

1.3.3.6細胞線粒體膜電位的檢測

A549細胞和H1299細胞約為1×10⁵/mL接種在25mL的培養瓶中，常規培養24h后加入分別含250mg/L、500mg/L和1000mg/L的PAP的培養液繼續培養，設立空白對照組。繼續培養24h后，細胞膜電位檢測參照試劑盒中的操作方法進行。培養結束，胰酶消化細胞轉移到離心管中，再用3mL PBS洗滌細胞兩次，1000r/min離心5min，收集細胞；取500μL 1×Incubation Buffer，加1μL的JC-1；吸取500μL的JC-1工作液將細胞懸浮，放置于37℃、5％CO₂條件下的細胞培養箱中孵育20min；1500r/min離心5min并收集細胞，用1×Incubation Buffer懸浮細胞，重復兩次；最后將用1×IncubationBuffer懸浮均勻的細胞過200目篩子，置于流式細胞儀進行檢測。

1.3.4數據處理

采用SPSS19.0統計軟件，對數據進行分析，結果以x±s表示。

2結果與分析

2.1最佳蛋白酶種類的選擇

Trypsin(胰蛋白酶)、Papain(木瓜蛋白酶)、Alcalase(堿性蛋白酶)、Dispase(中性蛋白酶)和Pepsin(胃蛋白酶)五種蛋白酶在最佳酶解條件下，分別對沙蠶進行酶解，12000r/min條件下離心15min得上清液，冷凍干燥后測定各種蛋白酶酶解物的IR值，結果如圖1所示，由圖1可知，Trypsin(胰蛋白酶)、Papain(木瓜蛋白酶)、Alcalase(堿性蛋白酶)、Dispase(中性蛋白酶)和Pepsin(胃蛋白酶)五種蛋白酶酶解物對H1299細胞增殖的抑制率分別為56.67％、46.29％、62.07％、47.78％、60.51％，其活性大小順序為：Alcalase＞Pepsin＞Trypsin＞Dispase＞Papain。由此可見，在最佳酶解條件下，堿性蛋白酶酶解物的抗肺癌的活性最強。

胰蛋白酶的最佳酶解條件為溫度為45℃、pH值為9、料液比為1:3、酶解時間為4h、加酶量為300U/g。木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為：溫度為55℃、pH值為7、料液比為1:2、酶解時間為4h、加酶量為300U/g。中性蛋白酶的最佳酶解條件為：溫度為45℃、pH值為8、料液比為1:1、酶解時間為6h、加酶量為900U/g。胃蛋白酶的最佳酶解條件為：溫度為35℃、pH值為1、料液比為1:1、酶解時間為8h、加酶量為300U/g。

2.1.1堿性蛋白酶正交實驗結果

以溫度、pH值、料液比、時間和加酶量為因素，以ANN和IR值為測量指標進行正交實驗，考查了堿性蛋白酶酶解物在不同酶解條件下的水解程度和抗腫瘤活性，其結果如表1。

表1堿性蛋白酶正交實驗設計及結果L₁₆(4⁵)

利用極差法對表1進行分析，比較極差R的大小可以看出，影響ANN值的的各因素的主次關系為：A＞B＞C＞E＞D。對于ANN值影響最大的因素是A(溫度)；此時的最佳酶解條件為A₂B₂C₂D₃E₃，即為：溫度為40℃、pH值為9、料液比為1:2、酶解時間為6h、加酶量為900U/g。

影響IR值的的各因素的主次關系為：C＞E＞A＞B＞D。對于IR值影響最大的因素是C(料液比)；此時的最佳酶解條件為A₄B₄C₁D₃E₁，即為：溫度為50℃、pH值為11、料液比為1:1、酶解時間為6h、加酶量為300U/g。2.2沙蠶多肽的分離純化

2.2.1沙蠶多肽的超濾截留

將堿性蛋白酶酶解獲得的沙蠶多肽經超濾得到五個組分PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5。采用MTT法得到對A549細胞的IR值，結果如圖2所示，PAP-2對A549細胞的增殖抑制率最高。故選定PAP-2進行進一步分離純化。

2.2.2DEAE Sepharose Fast Flow分離結果

將上述步驟得到的PAP-2經DEAE Sepharose Fast Flow分離得到PAP-2-1、PAP-2-2、PAP-2-3、PAP-2-4四個洗脫峰如下圖3所示，以2000mg/L的濃度作用于A549細胞24h后的IR為14.1±2.7％、24.3±3％、41.9±1.5％、46.7±5.0％；4000mg/L對A549細胞的IR值則為28.0±3.0％、49.6±2.2％、79.3±4.1％、77.3±1.8％。故選定PAP-2-3進行進一步分離純化。

2.2.3Sephadex G-25分離結果

將上述步驟得到的PAP-2-3經Sephadex G-25分離得到PAP-2-3-1、PAP-2-3-2兩個洗脫峰如圖4所示，采用MTT法檢測對A549細胞的抑制活性。結果顯示當兩個峰的濃度為1000mg/L時，兩個峰的IR值分別是48.2±3.3％，74.4±2.4％；2000mg/L時，IR值分別為75.9±2.1％，95.1±1.8％。峰ⅡPAP-2-3-2的活性最高，故用高效液相色譜儀將峰PAP-2-3-2進一步的分離純化。

2.2.4活性肽的純化及其N端氨基酸檢測結果

PAP-2-3-2經反相高效液相色譜洗脫純化，當洗脫時間分別為：4.296min、4.584min、4.968min、5.602min、6.075min時，出現如圖5所示的峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ、峰Ⅳ、峰V四個洗脫峰，收集峰V(PAP)，冷凍干燥備用。經檢測，該目標肽的氮端氨基酸序列是Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe(SEQ ID No.1)。

2.3抗肺癌細胞活性研究

2.3.1PAP對A549細胞活性的影響

不同濃度PAP作用后對A549和H1299細胞活性的影響如圖6，圖7所示，當PAP濃度為250mg/L作用細胞24h時，A549和H1299細胞活性的抑制率分別為17.02％和13.08％，當PAP濃度增加至1000mg/L時，抑制率分別達到83.44％和85.3％，半數抑制濃度率(IC₅₀)分別為662mg/L、665mg/L；隨著作用時間的延長，作用48h時，IC₅₀分別為571mg/L、561mg/L；作用72h時，IC₅₀分別為487mg/L、486mg/L。隨著PAP濃度的增加和作用時間的延長，抑制指數明顯上升，與對照組相比有統計學意義(P<0.05)。

2.3.2倒置顯微鏡下觀察結果

結果如圖8、9所示，正常組的A549和H1299細胞生長良好，細胞間排列緊密，形態飽滿。PAP作用24h后，如250mg/L組A549和H1299細胞出現細胞間隙增大，輪廓模糊，形態不規則；高濃度1000mg/L組細胞變圓變亮，形態和正常細胞有明顯的區別，同時可見在培養液中懸浮著較多的死細胞。

2.3.3AO/EB熒光觀察結果觀察細胞形態

PAP作用于A549和H1299細胞24h后，細胞經AO/EB染色，出現了明顯的早期凋亡的形態學特征。實驗結果如圖10、11所示，正常對照組無明顯凋亡細胞出現，細胞大小均勻，細胞核形態規則，胞核及胞漿均呈現綠色熒光；250mg/L組細胞出現早期凋亡的現象，胞質及胞核發生了變化，胞質出現空泡，并呈現強黃綠色熒光。隨著用藥濃度的增加，1000mg/L組早期凋亡的細胞和晚期凋亡的細胞明顯增多，細胞核呈固縮狀，呈現橘紅色熒光。

2.3.4Hoechst 33258染色檢測結果

Hoechst 33258染色可以用來觀察沙蠶多肽對肺癌細胞A549和細胞凋亡的形態學變化。如圖12、13所示，當不同濃度的沙蠶多肽作用于A549和H1299細胞24h后，可以看到空白對照組呈現均勻的藍色熒光，沙蠶多肽作用后，可以看見細胞的染色質聚集及邊集化明顯，而且藍色的熒光變亮，細胞核斷裂皺縮呈現出塊狀或點狀的藍色熒光，視野中細胞數明顯減少，細胞形態學的變化隨著藥物濃度的增加也顯得越明顯。

2.3.5流式細胞術檢測結果

本實驗采用Annexin V-FITC/PI雙染的方法檢測細胞早期凋亡率。以FITC和PI熒光作雙參數點圖，細胞分成4個區：左下象限(LL)代表正常細胞；左上象限(UL)代表機械損傷細胞；右下象限(LR)為早期凋亡細胞；右上象限(UR)為凋亡晚期或壞死細胞。如圖14所示，對照組A549細胞基本分布在LL區域，早期凋亡率為7.52％，但以不同濃度的PAP作用后，早期凋亡細胞明顯增多，當PAP濃度達到1000mg/L時，早期凋亡率達到33.44％。從圖15中可見，加以不同濃度的PAP作用于H1299細胞24h后，LR早區域的早期凋亡細胞數量增多，隨用藥濃度的增加，H1299細胞的早期凋亡率也隨之增加。當PH濃度達到1000mg/L時，細胞早期凋亡率達到44.42％。

2.3.6細胞中線粒體膜電位的變化結果

細胞內線粒體對JC-1染料的攝取依賴于線粒體的膜電位，正常情況下A549細胞線粒體的膜電位比較高，呈現出紅色熒光。當細胞受到損傷后，線粒體的膜電位就會下降，出現由紅色熒光向綠色熒光的轉變。當PAP作用A549細胞24h后，如圖16所示，右上象限表示為正常線粒體膜電位所占細胞的百分率，右下象限則為線粒體膜電位降低的細胞百分率。如實驗結果顯示，250mg/L組可使4.91％的細胞呈綠色熒光(即膜電位降低)，500mg/L、1000mg/L組分別可使12.91％、26.69％的細胞呈現綠色熒光。當PAP作用H1299細胞24h后，如圖17所示，250mg/L組可使8.58％的細胞呈綠色熒光(即膜電位降低)，500mg/L、1000mg/L組分別可使11.51％、22.69％的細胞呈現綠色熒光。

3討論

本發明使用了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種酶，以細胞增殖抑制率IR為指標，確定沙蠶多肽的最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。為確定堿性蛋白酶的適宜酶解條件范圍，試驗以酶解物ANN含量為指標，對每個因素分別進行試驗，根據單因素試驗結果設計正交試驗。通過L₁₆(4⁵)正交實驗優化酶解工藝，得到沙蠶多肽的關鍵技術是溫度為50℃、pH值為11、料液比為1:1、酶解時間為6h、氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。

本發明采用MTT法對PAP對A549和H1299細胞的增殖抑制活性進行了檢測，實驗結果表明，沙蠶多肽對于A549和H1299細胞的抑制活性具有時間和劑量依賴關系，即隨著PAP濃度的增加和時間的延長，細胞的抑制率明顯上升。當濃度為1000mg/L的PAP作用于A549細胞72h后，IR值達到95.08％，IC₅₀為487mg/L；作用于H1299細胞72h后，IR值達到91.36％，IC₅₀為486mg/L。

細胞在形態學上的特征性改變是證明其發生凋亡的有力證據。通過倒置顯微鏡、熒光染色實驗的變化可以很直觀地看到細胞早期凋亡的形態學上變化。在本發明中，通過細胞形態學實驗，觀察到PAP作用后，A549和H1299細胞表現出明顯的細胞形態學變化，如細胞間隙變大、形態不規則、體積變小、部分細胞出現空泡及凋亡小體等，隨濃度增加效果更加顯著。

細胞凋亡是一種由基因調控的高度保守的細胞主動死亡過程，在多細胞有機體的生長發育、維持組織同源性等過程中起重要作用。線粒體膜電位下降是凋亡的早期表現，一旦線粒體膜電位損耗,細胞就會進入不可逆的凋亡過程。通過流式細胞儀對細胞的早期凋亡率和細胞內線粒體膜電位進行檢查發現，250mg/L的PAP作用于肺癌細胞A54924h后，早期凋亡率7.52％，線粒體膜電位出現小幅下降，而1000mg/L的PAP作用后凋亡率達到33.44％，下降率達到26.69％。250mg/L的PAP作用于肺癌細胞H1299 24h后，早期凋亡率4.18％，線粒體膜電位出現小幅下降，而1000mg/L的PAP作用后凋亡率達到39.95％，下降率達到22.91％。細胞的早期凋亡率和，線粒體膜電位下降所占百分率都隨藥物作用濃度增加明顯增加，由此推測肺癌細胞A549和H1299的凋亡與線粒體凋亡信號通路有關。

總之，經堿性蛋白酶提取的沙蠶多肽PAP在體外可以有效抑制A549和H1299細胞的增殖，并具有劑量和時間依賴性，作用24h后A549和H1299細胞即表現出明顯的細胞凋亡特征。

以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大學

<120> 一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽及其用途

<130> 2016.11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 雙齒圍沙蠶

<400> 1

Ile Glu Pro Gly Thr Val Gly Met Met Phe

1 5 10