大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6及其應用的制作方法

文檔序號：11126064閱讀：1146來源：國知局

本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及一種大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因——GmPK6及其應用。

背景技術：

土壤鹽漬化是一個全球性的生態問題，對農業生產帶來了極大的負面影響，在干旱和半干旱地區土壤鹽漬化已成為限制植物生長發育以及造成農作物減產的重要原因。現今，已有約7.6％的土壤發生了鹽漬化，而中國鹽堿地的面積為0.27億hm2，約占我國耕地面積的10％。高鹽環境會對作物造成多方面的分子損傷，如植物體水分缺失、高滲透壓力、內穩態的破壞以及植物細胞內離子的失衡和毒害等。

大豆(Glycine max(L.)Merill)是一種傳統的可食用豆科作物，也是公認的重要雙子葉植物，種子為人類提供了豐富的蛋白、高質量的植物油、礦物質和維生素等資源。另外，大豆異黃酮、皂角苷、磷脂酰膽堿等也作為重要的功能化合物存在于大豆種子中。根據高鹽脅迫下植物正常生長的比率對植物進行鹽脅迫耐受性分級，分級結果顯示栽培大豆是一種中度耐鹽的農作物。

蛋白激酶(protein kinases)，又稱為蛋白質磷酸化酶(protein phosphakinase)，負責催化體內蛋白質的磷酸化反應，與催化蛋白質脫磷酸化反應的蛋白質脫磷酸化酵素(protein phosphatases)的功能相反。蛋白激酶通過對底物蛋白質進行磷酸化而調控其活性，磷酸基團的供體是ATP或GTP的γ-磷酸，磷酸基團的受體是底物蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，不同激酶的受體不同，但大多發生在絲氨酸殘基上，從而改變蛋白質、酶的構象和活性。在細胞信號傳導和細胞周期調控途徑中，蛋白激酶形成復雜有序的網絡并且發揮著化學修飾的作用，并且涉及諸多過程的調控，例如：細胞生長，胞間互作和信號級聯反應等。植物蛋白激酶與植物的抗逆性存在緊密聯系，也會受到多種因素的調控，例如：發育階段，脫水信號和脫落酸(ABA)。

根據已有的研究表明，蛋白激酶在植物逆境耐受如干旱脅迫、高鹽脅迫等環境脅迫時會發揮較為重要的功能。但截止到目前為止，整個過程具體的分子保護機制還沒有進行大量的實驗證明，大多理論只限于推測之中，尤其是大豆中LAMMER家族蛋白激酶及其應用還未見報道。

技術實現要素：

針對目前的技術狀況，本發明的目的是提供一種大豆(Glycine max(L.)Merr)圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因——GmPK6及其應用。

本發明所述的大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因，其特征在于：所述基因命名為大豆LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6，該基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明還提供了一種含有上述大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的植物表達載體，其特征在于：所述植物表達載體命名為表達載體pK2GW7::GmPK6，該表達載體克隆區域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。或者是，一種含有上述大豆圣豆9號中LAMMER型蛋白激酶基因的植物表達載體，其特征在于：所述植物表達載體命名為表達載體pB2GW7::GmPK6，該表達載體克隆區域核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本發明所述的大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在提高植株抗旱、耐鹽性中的應用。

其中：所述植株優選是大豆或擬南芥。進一步的，所述擬南芥是Col-0野生型，大豆品種是濰6823。

本發明中，申請人從圣豆9號中分離得到LAMMER型蛋白激酶基因—GmPK6，將該基因轉到模式植物擬南芥中證明其功能，結果得到了抗旱、耐鹽性提高的轉基因擬南芥植株。

具體的，大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在擬南芥植株中表達GmPK6應用的例證。

申請人首先在圣豆9號植株中克隆到了LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6；利過Gateway系統將GmPK6基因通過BP反應連接到pDONR221載體上(見圖1)，然后通過轉化的方法在大腸桿菌DH5α中得到大量克隆，接著進行LR反應把此基因GmPK6連接到表達載體pK2GW7(見圖2)或pB2GW7上，并在大腸桿菌DH5α中表達；接著篩選轉基因大腸桿菌，并提取轉化質粒，最后將轉化質粒轉入農桿菌菌株GV3101中。將轉化農桿菌菌株轉入模式植物擬南芥，結果得到了抗旱、耐鹽性提高的轉基因擬南芥植株，驗證表達了基因GmPK6的功能。

本發明的有益效果是：利用現有的植物基因工程技術，本發明首次克隆得到了大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因并在擬南芥中進行表達，使轉基因擬南芥獲得了非轉基因擬南芥所不具備的干旱及高鹽脅迫耐受性的能力。充分證明了本發明所述的大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在提高植株在干旱及鹽脅迫中具有重要的作用，預示本發明所述的基因可廣泛用于培育抗旱、耐鹽的植物品種。

附圖說明

圖1為入門載體pDONR221圖譜。

圖2為植物表達載體pK2GW7圖譜。

圖3為圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的CDS全長克隆電泳圖

其中：M為Marker，泳道1、2為基因的CDS全長克隆。

圖4為35S::GmPK6轉基因的擬南芥純系篩選。

其中：左圖為轉GmPK6基因擬南芥T1代種子篩選，中間為轉GmPK6基因擬南芥T2代種子篩選，右圖為轉GmPK6基因擬南芥T3代純系種子篩選。

圖5為圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在轉基因擬南芥中RT-PCR表達分析。

圖6為35S::GmPK6轉基因擬南芥植株耐鹽表型分析

其中：A圖為轉基因植株在0,50,100,150 200mmol/L NaCl條件下的種子萌發率分析，B圖為轉基因植株在0,50,100,150 200mmol/L NaCl條件下的根長變化分析，C圖為不同濃度NaCl處理條件下的種子萌發率統計數據，D圖為不同濃度NaCl處理條件下的根長統計數據。

圖7為35S::GmPK6轉基因擬南芥植株抗旱表型分析

其中：A圖為轉基因植株在100,150，200，250mmol/L mannitol條件下的種子萌發率分析，B圖為轉基因植株在100,150，200，250mmol/L mannitol條件下的根長變化分析，C圖為不同濃度mannitol處理條件下的種子萌發率統計數據，D圖為不同濃度mannitol處理條件下的根長統計數據。

圖8為圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6轉濰6823的PCR檢測圖

其中：上圖為35S-F/R引物進行PCR擴增的結果，下圖為35S-F+GmPK6-R引物進行PCR擴增的結果。

泳道M為Marker，泳道陽性對照為陽性質粒對照；泳道陰性對照為陰性植株對照；上圖中：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9均為轉GmPK6轉基因陽性植株。下圖中：泳道1、4、6、8為轉GmPK6轉基因陽性植株。

圖9為35S::GmPK6轉基因擬南芥植株非生物脅迫處理1,3,6,12,24h下表達量變化，其中ABA處理濃度為100umol/L，NaCl處理濃度為200mmol/L，mannitol處理濃度為300mmol/L。

圖10為35S::GmPK6轉基因大豆株T1代再生植株。

圖11為圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6轉濰6823的Southern blot分析圖，其中：泳道M為Marker，泳道“+”為陽性質粒對照；泳道“-”為陰性植株對照；泳道“L1、L2、L3”均為GmPK6轉基因陽性植株。

圖12為35S::GmPK6轉基因大豆植株的耐鹽性分析

其中：WT為陰性植株對照，L1、L2、L3為轉基因陽性植株。

上圖為0mM NaCl處理下的表型，下圖為150mM NaCl處理下的表型。

具體實施方式

實施例1、GmPK6的克隆

1.1大豆圣豆9號總RNA的提取

(1)將圣豆9號植物材料放入研缽中，利用液氮將其研磨成粉末(直接應用于下面的實驗或者凍于-80℃超低溫冰箱保存備用)；

(2)等液氮揮發后，立即將100-200mg植物粉末轉入到1.5ml離心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.9ml上清液轉移到新的1.5ml離心管中，再加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.4ml上清液轉移到新的1.5ml離心管中，再加入0.4ml異丙醇，上下翻轉15次混勻溶液，室溫放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，離心10min，棄上清，用1ml 75％的乙醇洗滌沉淀兩次，4℃，8,000rpm，離心5min；

(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺中上干燥RNA約2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA10min；

(7)用紫外分光光度計測RNA樣品的OD值和濃度，A₂₆₀/A₂₈₀達到1.7-2.0為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質量。

1.2RNA的反轉錄

(1)向離心管中依次加入下列物質(40μl反應體系)：

(2)輕輕混勻后，65℃變性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向離心管中依次加入下列物質

(4)輕輕混勻后，42℃恒溫水浴1h，65℃變性10min，-20℃保存備用。

1.3GmPK6基因克隆

GmPK6OX-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGTACCACAATGGTTATTTCATGA-3’

GmPK6OX-R：5’-AGAAAGCTGGGTTGATGCAGAGAACTACGAAAACTT-3’

(1)高保真酶Primer Star進行Gateway系統的第一步擴增的反應體系如下(50μl體系)：

擴增條件如下：

反應結束后，反應液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(2)克隆基因片段的純化回收(天根試劑盒)

1)將切下帶有目的片段的凝膠放入1.5ml離心管并稱凝膠重量，加入3倍體積的溶膠液，60℃溶膠10min，溶膠期間不斷的翻轉；

2)凝膠完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室溫，12000rpm，離心30Sec，棄溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，離心1min，棄漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，離心1min，棄漂洗液；

6)空柱，12000rpm，離心2min；

7)回收柱開蓋晾干1-2min，放入新的干凈的1.5ml離心管，加入60℃預熱的40μl滅菌水或者EB緩沖液，放置2min；

8)12000rpm離心1min，所得溶液即為回收片段。

(3)高保真酶Primer Star進行Gateway系統的第二步擴增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACAAGT TTG TAC AAAAAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反應體系如下(50μl體系)：

擴增條件如下：

反應結束后，反應液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖3。

1.4克隆基因片段的BP反應

BP反應(Gateway系統)體系如下：

注：pDONR221購置于Invitrogen(上海)商貿有限公司。

25℃反應8小時-過夜。

1.5大腸桿菌感受態的制備(無菌操作)

(1)取DH5α菌種接種于20ml LB液體培養基中，37℃搖床培養過夜；

(2)按1:100接種于50ml LB液體培養基中，37℃，200rpm培養1小時，至OD₆₀₀值為0.4-0.6；

(3)將菌液放置在冰上30min；

(4)4℃，4200rpm，離心10min，棄上清，加入10ml預冷的0.1M的CaCl₂懸浮菌體；

(5)將菌液放置在冰上10min；

(6)4℃，4200rpm，離心10min，棄上清，加入2ml預冷的0.1M的CaCl₂懸浮菌體，分裝于1.5ml離心管中，現用或加入終體積30％甘油經液氮速凍后-80℃保存備用。

1.6大腸桿菌的質粒轉化(無菌操作)

(1)將1-5μl質粒DNA或者連接產物加入50μl的感受態細胞中，輕彈離心管混勻，冰浴30min；

(2)42℃，溫水浴熱激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培養基，37℃培養40-50min；

(4)室溫，4000rpm，離心3min，收集菌體；

(5)將菌涂布于含有相應抗生素的培養平板上，37℃倒置培養過夜。

1.7大腸桿菌PCR驗證

反應體系如下(20μl體系)：

擴增條件如下：

反應結束后，反應液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8DNA測序

挑取含有重組質粒的陽性單菌落用含有Kan(25mg/L)的液體LB搖過夜，然后送上海博亞生物技術有限公司測序，得到測序結果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

經過序列分析，上述cDNA序列與大豆Willms82的核苷酸同源100％，三次實驗證明得到的就是Willms82LAMMER型蛋白激酶基因，命名為GmPK6，所述基因GmPK6的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.9大腸桿菌質粒DNA的提取

(1)挑取單克隆接種于10ml含有相應抗生素的LB液體培養基中，37℃培養8h；

(2)室溫，12,000rpm，離心1min，收集菌體；

(3)棄上清，加入100μl低溫預冷的溶液I，振蕩懸浮菌體；

(4)加200μl新鮮配制的溶液II，快迅翻轉混勻，冰浴5min；

(5)溶液澄清后加入150μl低溫預冷的溶液III，輕輕混勻后冰浴5min；

(6)4℃，12000rpm，離心10min，吸取上清至新的1.5ml離心管中；

(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，振蕩混勻；

(8)室溫，12,000rpm，離心10min，轉移上層水相于另一新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，再抽提一次，振蕩混勻；

(9)室溫，12,000rpm，離心10min，轉移上層水相于另一新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻并于-20℃放置30min；

(10)室溫，12,000rpm，離心10min，棄上清保留沉淀。

(11)用75％乙醇洗滌沉淀兩次，真空干燥5min，溶于40μl滅菌水，放至-20℃保存備用。

1.10克隆基因片段的LR反應

LR反應(Gateway系統)體系如下：

注：pK2GW7、pB2GW7購置于Invitrogen(上海)商貿有限公司。

25℃反應8小時。

1.11大腸桿菌感受態的制備和質粒轉化(同1.5、1.6)

1.12大腸桿菌PCR驗證(同1.7)

1.13大腸桿菌質粒DNA的提取(同1.9)

驗證轉入pK2GW7載體的陽性pK2GW7::GmPK6質粒的克隆區域核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

驗證轉入pB2GW7載體的陽性pB2GW7::GmPK6質粒的克隆區域核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

1.14農桿菌感受態的制備(無菌操作)

(1)取農桿菌GV3101菌種接種于10ml YEP液體培養基中，28℃搖床培養過夜；

(2)按1：50接種于50ml YEP液體培養基中，28℃振蕩培養3-4小時，至OD₆₀₀值為0.4-0.6；

(3)4℃，4,200rpm，離心10min，收集菌體；

(4)棄上清，加入10ml預冷的0.15mol/L的NaCl懸浮菌體；

(5)重復步驟3；

(6)棄上清，加入2ml預冷的20mmol/L的CaCl₂懸浮菌體，分裝于1.5ml離心管中，現用或加入終體積7％DMSO經液氮速凍后-80℃保存備用。

1.15農桿菌的質粒轉化(無菌操作)

(1)將10μl質粒DNA加入50μl的感受態細胞中，輕彈離心管混勻，冰浴30min；

(2)液氮速凍1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培養基，28℃培養2-4h；

(4)室溫，4,000rpm，離心3min，收集菌體；

(5)將菌涂布于含有相應抗生素的YEP培養平板上，28℃倒置培養48h。

1.16轉化農桿菌的PCR驗證

反應體系如下(20μl體系)：

擴增條件如下：

反應結束后，反應液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

實施例2、在擬南芥中表達大豆LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的功能驗證

2.1花侵染法轉化擬南芥

(1)擬南芥(Col-0野生型)生長至抽苔1cm時，將頂端減掉以誘導側生花序的生成；

(2)在轉化前一天，取1ml活化過的含有表達載體質粒的農桿菌GV3101加到含相應抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培養基中，28℃震蕩培養至OD₆₀₀約為1.0-1.2；

(3)室溫，4,200rpm,離心10min，收集菌體，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重懸菌體，使OD₆₀₀約為0.8；

(4)用移液器將農桿菌滴到花序上進行浸染，待所有花序都被侵染后，將擬南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鮮袋覆蓋花序，至于20-22℃避光培養一天剪開頂部露出花序，再培養一天后揭去保鮮袋，培養至種子成熟。

2.2擬南芥種子的表面消毒

將適量待滅菌的擬南芥中子放入1.5ml離心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％體積比的TritonX-100)震蕩消毒1min，再用70％的乙醇震蕩消毒1min(兩次)，最后用吸頭將種子吸到無菌濾紙上吹干，然后用無菌的牙簽將其點入培養基中。

2.3轉基因植株的篩選

對收獲的T0代種子進行表面消毒，然后后均勻涂布于1/2MS平板上(含相應的抗生素Baste)。春化處理3d后移入人工氣候室生長。萌發約10天，子葉深綠色的植株為轉基因植株，而子葉發淺綠甚至黃化的植株為非轉基因植株。將轉基因植株轉入土中生長直至收獲得到T1代轉基因種子，T1代植株單株收種子，每株收取的種子繼續篩選，將后代分離比為3∶1(陽性∶陰性)的陽性植株移栽后生長至收獲T2代轉基因種子，單株收種后，每株收取的種子經篩選可以得到純系T2代轉基因種子為T3代，見圖4。

2.4植物RNA的提取

(1)將植物材料放入研缽中，利用液氮將其研磨成粉末(直接應用于下面的實驗或者凍于-80℃超低溫冰箱保存備用)；

(2)等液氮揮發后，立即將100-200mg植物粉末轉入到1.5ml離心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.9ml上清液轉移到新的1.5ml離心管中，再加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，離心10min，將0.4ml上清液轉移到新的1.5ml離心管中，再加入0.4ml異丙醇，上下翻轉15次混勻溶液，室溫放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，離心10min，棄上清，用1ml 75％的乙醇洗滌沉淀兩次，4℃，8,000rpm，離心5min；

(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺中上干燥RNA約2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度計測RNA樣品的OD值和濃度，A₂₆₀/A₂₈₀達到1.7-2.0為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質量。

2.5RNA的反轉錄

(1)向離心管中依次加入下列物質(40μl反應體系)：

(2)輕輕混勻后，65℃變性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向離心管中依次加入下列物質

(4)輕輕混勻后，42℃恒溫水浴1h，65℃變性10min，-20℃保存備用。

2.6轉基因植株的RealTime-PCR檢測

PCR法篩選轉基因陽性植株：將具有抗性的植株的cDNA用GmPK6基因RT-PCR引物進行PCR檢測。

GmPK6基因RT-PCR引物序列：

GmPK6RT-F：5’-CCCCAAGGCTCAGGTAG-3’

GmPK6RT-R：5’-TTGCCTCCTTTATCGTGTT-3’

普通Taq酶進行RealTime-PCR擴增的反應如下(15μl體系)：

擴增條件如下：

注：內標基因選用GmTUB。

結果見圖5。

2.7NaCl、mannitol、ABA處理下GmPK6在不同組織器官內的表達量分析

(1)將Col-0植株在200mmol/L NaCl處理0h,1h,3h,12h,24h后分別取其根提取RNA(方法同2.4)，將RNA分別反轉為cDNA(方法同2.5)，進行RealTime-PCR檢測(方法同2.6)。

(2)將Col-0植株在300mmol/L maninitol處理0h,1h,3h,12h,24h后分別取其根提取RNA(方法同2.4)，將RNA分別反轉為cDNA(方法同2.5)，進行RealTime-PCR檢測(方法同2.6)。

2.8甘露醇和NaCl處理擬南芥

(1)擬南芥種子的表面消毒(同2.2)。

(2)甘露醇和NaCl處理

將滅了菌的Col-0、GmPK6-1、GmPK6-2、GmPK6-3種子分別均勻涂布于1/2MS平板上(含相應的抗生素Baste)。春化處理3天后移入人工氣候室生長。萌發約4d，根長至1cm左右，將擬南芥小苗移至添加不同濃度的甘露醇(0、100、150、200、250mmol/L)或NaCl(0、50、100、150、200mmol/L)的1/2MS培養基平板上。待小苗長至11d，觀察小苗根長生長狀況。

結果見圖6、圖7。

實施例3、在大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的功能驗證

3.1大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉化法轉化大豆

(1)種子消毒及預培養處理

將大豆種子用70％乙醇消毒5min，去凈乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10min，無菌水沖洗5-6遍，在25℃-28℃下無菌水浸種12h。

將浸種后胚膨大萌動的大豆放入預培養培養基，28℃、光培養1d，其中所述預培養培養基配方為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

(2)種子胚膨大萌動后經切割，暴露或損傷萌動胚部位

當預培養的大豆胚整體膨大、胚根長至0.5±0.1mm，未突破種皮時，剝去種皮，切去胚根，保留胚芽、胚軸及1/2的子葉，同時用解剖針在胚芽尖處刺針，使針眼布滿胚芽尖。

(3)真空滲透輔助法將含有目的基因的農桿菌侵染萌動胚

將4℃保存的帶有植物表達載體的農桿菌在添加了50mg/L利福平的YEP固體培養基上劃線，28℃黑暗培養3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養基，黑暗下28℃、200r/min振蕩培養24小時后再次轉接，相同條件下培養16h。將菌液置于滅菌的離心管中，5,000rpm離心5分鐘收集菌體，用侵染液重懸菌體，調整至OD₆₀₀值為0.6，加入30mg/L乙酰丁香酮備用。其中所述侵染液配方為：0.1MS大量+0.1MS微量+B5維生素+0.5MES+1％葡萄糖+2％蔗糖，pH5.4。

將步驟(2)的大豆浸入農桿菌菌液中，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8min，黑暗下28℃、200r/min振蕩培養，侵染15-20min。

(4)共培養

將步驟(3)的大豆取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于共培養培養基上，25℃-28℃下暗培養4天。其中所述共培養培養基配方為：MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

(5)叢生芽再生、篩選及小苗生根、篩選

將共培養后的大豆用無菌水清洗4次，再用無菌濾紙吸干，轉接至叢生芽誘導培養基上，在25℃、且每日光照14h條件下，每兩周換至新的培養基，連續培養20±2d，分化出叢生芽。其中所述叢生芽誘導篩選培養基配方為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/LIAA(吲哚乙酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

選篩選后長至1-2cm的叢生芽，將小芽單獨剪下，轉移到生根篩選培養基上，在25℃、且每日光照14±1h條件下，連續培養14d。其中所述生根篩選培養基配方為：MS+0.4mg/LIBA(乙哚丁酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L頭孢噻肟鈉+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

(6)小苗壯苗及移栽

選根系生長良好的小苗轉移到壯苗培養基上，在25℃且每日光照14小時條件下，培養7-10d。當小苗經篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養基移入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。其中所述壯苗培養基配方為：MS+2.0mg/L KT(激動素)+0.4mg/L NAA(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8，見圖8。

3.2CTAB法提取轉基因植株基因組DNA

稱取0.5g的再生植株葉片，剪碎后用液氮研磨，迅速將粉末轉移至1.5ml離心管中，然后加入700μl預熱至65℃的2xCTAB提取緩沖液及0.1％的疏基乙醇，輕輕顛倒離心管混勻，然后置于65℃水浴保溫2h，不時顛倒混勻。混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚：氛仿：異戊醇(25：24∶1)，4℃下10,000g離心10min。將水相轉移至一干凈離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，4℃下10000g離心10min。將水相轉移至一干凈離心管中，加入兩倍體積無水乙醇，溫和混勻，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g離心10min，棄去液體，并用70％乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入100ul TE液溶解，37℃水浴30min。加入200μl無水乙醇，溫和混勻，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g離心10min，棄去液體，并用70％乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入40μl無菌水溶解DNA，4℃保存待用。

3.3PCR和Sothern blot檢測轉基因植株

3.3.1PCR法檢測陽性轉基因植株

抗性植株總DNA分別用35S啟動子引物、GmPK6基因引物和連有GmPK6基因片段和植株表達載體片段的序列引物進行PCR檢測。

35S片段啟動子引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

35S-R：5’-GACGATCTACCCGAGCAA-3’

GmPK6基因引物序列：

Gm PK6-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGTACCACAATGGTTATTTCATGA-3’

Gm PK6-R：5’-AGAAAGCTGGGTTGATGCAGAGAACTACGAAAACTT-3’

35S啟動子F+GmPK6基因R引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

GmPK6-R：5’-AGAAAGCTGGGTTGATGCAGAGAACTACGAAAACTT-3’

反應體系如下(20μl體系)：

擴增條件如下：

反應結束后，反應液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖8。

3.3.2Sothern blot雜交驗證

選取3株陽性植株(GmPK6-L1、GmPK6-L2、GmPK6-L3)進行Sothern blot雜交驗證。步驟如下：

(1)CTAB法提取陽性植株，野生型植株DNA

(2)EcoRI酶切陽性植株和野生型植株DNA，電泳

(3)轉膜

①堿變性：室溫下將凝膠浸入數倍體積的變性液中30min。變性液：0.5mol/L NaOH；1.5mol/L NaCl。

②中和：將凝膠轉移到中和液15min。中和液：1mol/L Tris-HCl(pH 7.4)；1.5mol/L NaCl；

③轉移：按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標記，水浸濕后，浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。進行轉移。(轉移過程一般需要8-24h，每隔數小時換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用20×SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物)轉移液(20×SSC)：NaCl 175.3g；檸檬酸三鈉82.2g，NaOH調pH至7.0，加ddH2O至1,000ml。

④轉移結束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液數分鐘，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80℃烘2h，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。

(4)按照Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II說明書標記GmPK61，并進行雜交及檢測。

檢測發現所選的GmPK6轉基因植株(GmPK6-L1、GmPK6-L2、GmPK6-L3)的基因組均整合了目的基因，見圖11。

3.4轉基因大豆植株的耐鹽性分析

T2代轉基因大豆種子與對照種子經浸種催芽后，分別移栽到種子萌發袋(1/2Hogland液體培養基)中，在室溫25℃條件下，使其生長2周后，長至兩葉一心期用含有NaCl 50rnmol/L的1/2Hogland液體培養基澆灌，為避免鹽沖擊效應，濃度以每天遞增25rnrnol/L的方式加鹽，直至處理預定濃度150rnmol/L，對轉基因植株與野生型植株表型進行觀察。見圖12。1/2Hogland液體培養基配方：

序列表

<110> 山東大學

<120>大豆圣豆9號LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6及其應用

<141> 2016-11-22

<160> 3

<210> 1

<211> 1419

<212> cDNA

<213> 大豆(Glycine max?(L.) Merr)

<221>大豆圣豆9號中LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6

<222>（1）…（1419）

<400>1

atggagatgg aacgcgtctt cgagtttcct cacactcaca tggatcggcg cccgagaaag 60

agagcgagat tgggctggga catccctgag gtccccaagg ctcaggtagg attgttttgt 120

ggacaagatg ttgggactat ttcaagcttt gctccttcaa ggggtccctc agaaaatacc 180

actagttctc tatttgttaa gccagttgct cgaaatggtt ctcccccttg gcgagatgat 240

gacaaagatg ggcattacat gtttgcgctt ggagaaaatt taacttctcg ctataagata 300

catagcaaaa tgggtgaagg aacttttggg caggtcttag aatgctggga tagagaaagg 360

aaggaaatgg ttgccgtaaa aattgtccgt ggtattaaga agtatcgaga agcagccatg 420

atagaaattg aggtgttgca acagcttggt aaacacgata aaggaggcaa tcgttgtgtg 480

caaatacgga actggtttga ctatcgtaat catatctgta ttgtgtttga gaaacttgga 540

ccaagcttat acgattttct tcggaaaaac aattatcgct catttcccat tgatcttgtc 600

cgtgagattg gcagacaact attggaatgt atagcattca tgcatgactt gcgcatgatt 660

catactgacc tgaagcctga aaacatacta ctagtttcac cagagtatgt caaagttcct 720

gactacaaga gttcatctag atcaccaagt tcctatttca agagagttcc caaatcaagt 780

gctataaagg ttattgattt tggcagcacc acttatgagc gagaagatca gaattacatt 840

gtatcaactc gtcattatag ggctcctgaa gttatccttg gtatatatac atactgtaaa 900

tgctgtggaa agaatgcctg tctaactgtg ttttgcatgt tgacacatga caatcatgag 960

aagggctata tgcaagctaa agttgatttt ggcaatgatg ttttaggact tggctggagc 1020

tatccatgtg atatctggag tgtgggatgt atcttggttg agttatgcac gggcggagct 1080

ttgtttcaga ctcacgaaaa tttggagcat cttgccatga tggaaagggt acttggtcca 1140

ttaccacagc ccatgttgaa gagagtcgac cgacatgctg agaagtatgt tagaaggggt 1200

agattggact ggcctgaggg tgcaacctca agggagagta tcaaagctgt aatgaagctt 1260

cctaggcttc agaaccttgt aatgcagcat gtagatcatt cagctggcga tctcatacat 1320

ctcttgcagg ggttacttag atatgacccc tctgaaagac ttacagccaa ggaagctctt 1380

agacattcct tctttatgag agatcaattt agaagataa 1419

<210> 2

<211> 10907

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 含有基因GmPK6的植物表達載體pK2GW7:: GmPK6

<222>（1）…（10907）

<400>2

ctcccatatg gtcgactaga gccaagctga tctcctttgc cccggagatc accatggacg 60

actttctcta tctctacgat ctaggaagaa agttcgacgg agaaggtgac gataccatgt 120

tcaccaccga taatgagaag attagcctct tcaatttcag aaagaatgct gacccacaga 180

tggttagaga ggcctacgcg gcaggtctca tcaagacgat ctacccgagt aataatctcc 240

aggagatcaa ataccttccc aagaaggtta aagatgcagt caaaagattc aggactaact 300

gcatcaagaa cacagagaaa gatatatttc tcaagatcag aagtactatt ccagtatgga 360

cgattcaagg cttgcttcat aaaccaaggc aagtaataga gattggagtc tctaagaaag 420

tagttcctac tgaatcaaag gccatggagt caaaaattca gatcgaggat ctaacagaac 480

tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 540

aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 600

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 660

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 720

gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg 780

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 840

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 900

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 960

tggagaggac tccggtattt ttacaacaat accacaacaa aacaaacaac aaacaacatt 1020

acaatttact attctagtcg acctgcaggc ggccgcacta gtgatatcgg ggacaagttt 1080

gtacaaaaaa gcaggctatg gagatggaac gcgtcttcga gtttcctcac actcacatgg 1140

atcggcgccc gagaaagaga gcgagattgg gctgggacat ccctgaggtc cccaaggctc 1200

aggtaggatt gttttgtgga caagatgttg ggactatttc aagctttgct ccttcaaggg 1260

gtccctcaga aaataccact agttctctat ttgttaagcc agttgctcga aatggttctc 1320

ccccttggcg agatgatgac aaagatgggc attacatgtt tgcgcttgga gaaaatttaa 1380

cttctcgcta taagatacat agcaaaatgg gtgaaggaac ttttgggcag gtcttagaat 1440

gctgggatag agaaaggaag gaaatggttg ccgtaaaaat tgtccgtggt attaagaagt 1500

atcgagaagc agccatgata gaaattgagg tgttgcaaca gcttggtaaa cacgataaag 1560

gaggcaatcg ttgtgtgcaa atacggaact ggtttgacta tcgtaatcat atctgtattg 1620

tgtttgagaa acttggacca agcttatacg attttcttcg gaaaaacaat tatcgctcat 1680

ttcccattga tcttgtccgt gagattggca gacaactatt ggaatgtata gcattcatgc 1740

atgacttgcg catgattcat actgacctga agcctgaaaa catactacta gtttcaccag 1800

agtatgtcaa agttcctgac tacaagagtt catctagatc accaagttcc tatttcaaga 1860

gagttcccaa atcaagtgct ataaaggtta ttgattttgg cagcaccact tatgagcgag 1920

aagatcagaa ttacattgta tcaactcgtc attatagggc tcctgaagtt atccttggta 1980

tatatacata ctgtaaatgc tgtggaaaga atgcctgtct aactgtgttt tgcatgttga 2040

cacatgacaa tcatgagaag ggctatatgc aagctaaagt tgattttggc aatgatgttt 2100

taggacttgg ctggagctat ccatgtgata tctggagtgt gggatgtatc ttggttgagt 2160

tatgcacggg cggagctttg tttcagactc acgaaaattt ggagcatctt gccatgatgg 2220

aaagggtact tggtccatta ccacagccca tgttgaagag agtcgaccga catgctgaga 2280

agtatgttag aaggggtaga ttggactggc ctgagggtgc aacctcaagg gagagtatca 2340

aagctgtaat gaagcttcct aggcttcaga accttgtaat gcagcatgta gatcattcag 2400

ctggcgatct catacatctc ttgcaggggt tacttagata tgacccctct gaaagactta 2460

cagccaagga agctcttaga cattccttct ttatgagaga tcaatttaga agataagggg 2520

accactttgt acaagaaagc tgggtgatat cccgcggcca tgctagagtc cgcaaaaatc 2580

accagtctct ctctacaaat ctatctctct ctatttttct ccagaataat gtgtgagtag 2640

ttcccagata agggaattag ggttcttata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga 2700

aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta 2760

aaaccaaaat ccagtgacct gcaggcatgc gacgtcgggc ccaagcttag cttgagcttg 2820

gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg 2880

cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 2940

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 3000

aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc 3060

agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc 3120

tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg 3180

actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg 3240

cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg 3300

gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg 3360

ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc 3420

tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg 3480

gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt 3540

tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga 3600

gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc 3660

cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg 3720

cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg 3780

aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg 3840

ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga acaagcatga aaccgcacca 3900

ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc 3960

cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc 4020

cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga 4080

gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc 4140

tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc 4200

gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc 4260

gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc 4320

cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg 4380

acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg 4440

ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg 4500

gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagct ggttaagcag 4560

cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa 4620

ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt 4680

gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt 4740

cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt 4800

aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc 4860

taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag 4920

acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc ggaggatcac accaagctga 4980

agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc 5040

agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat gaattttagc ggctaaagga 5100

ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga 5160

ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct gccggccctg caatggcact 5220

ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat 5280

cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg 5340

gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat 5400

ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa 5460

gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag 5520

tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga 5580

ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat 5640

ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat 5700

gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc 5760

ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga 5820

aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa 5880

cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa 5940

gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga 6000

gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac cccgattact ttttgatcga 6060

tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc 6120

cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt 6180

ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga 6240

ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga 6300

agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg caaattgccc tagcagggga 6360

aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac attgggaacc caaagccgta 6420

cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggtcaca 6480

catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa 6540

acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc 6600

cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc 6660

gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct 6720

accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac 6780

cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 6840

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 6900

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt 6960

atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 7020

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 7080

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 7140

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 7200

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 7260

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 7320

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 7380

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 7440

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7500

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7560

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7620

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 7680

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 7740

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 7800

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 7860

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgcatgatat 7920

atctcccaat ttgtgtaggg cttattatgc acgcttaaaa ataataaaag cagacttgac 7980

ctgatagttt ggctgtgagc aattatgtgc ttagtgcatc taatcgcttg agttaacgcc 8040

ggcgaagcgg cgtcggcttg aacgaatttc tagctagaca ttatttgccg actaccttgg 8100

tgatctcgcc tttcacgtag tggacaaatt cttccaactg atctgcgcgc gaggccaagc 8160

gatcttcttc ttgtccaaga taagcctgtc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg 8220

ccggcaggcg ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta 8280

ctgcgctgta ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt 8340

cgggcggcga gttccatagc gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag 8400

gaaccggatc aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg 8460

cttttgtcag caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa 8520

gaatgtcatt gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg 8580

gaatgatgtc gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc 8640

caggggaagc cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa 8700

gccttacggt caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca 8760

ctgcggagcc gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc 8820

caactacctc tgatagttga gtcgatactt cggcgatcac cgcttccccc atgatgttta 8880

actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt gctgctccat aacatcaaac 8940

atcgacccac ggcgtaacgc gcttgctgct tggatgcccg aggcatagac tgtaccccaa 9000

aaaaacatgt cataacaaga agccatgaaa accgccactg cgccgttacc accgctgcgt 9060

tcggtcaagg ttctggacca gttgcgtgac ggcagttacg ctacttgcat tacagcttac 9120

gaaccgaacg aggcttatgt ccactgggtt cgtgcccgaa ttgatcacag gcagcaacgc 9180

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 9240

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 9300

aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt 9360

tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt 9420

aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat 9480

taacgccgaa ttgaattatc agcttgcatg ccggtcgatc tagtaacata gatgacaccg 9540

cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt 9600

ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt 9660

taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg 9720

caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatct gcttgactct 9780

agctagagtc cgaaccccag agtcccgctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg 9840

cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt 9900

cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg 9960

ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat 10020

tcggcaagca ggcatcgccg tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atccgcgcct 10080

tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct 10140

gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt 10200

ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga 10260

tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc 10320

ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa 10380

cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttggagttca ttcagggcac 10440

cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg 10500

cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc 10560

aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcctcga tcgagttgag 10620

agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta tggaacgtca gtggagcatt 10680

tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc gacttttgaa cgcgcaataa 10740

tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa acccgcggct gagtggctcc 10800

ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg tcatcggcgg 10860

gggtcataac gtgactccct taattctcat gtatgataat tcgagct 10907

<210> 3

<211> 10654

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>含有基因GmPK6的植物表達載體pB2GW7:: GmPK6

<222>（1）…（10654）

<400>3