本發明涉及生物醫學領域中，埃博拉病毒感染血液中的特征miRNA與應用。
背景技術：
埃博拉病毒病是由纖絲病毒科(filoviridae)的埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)所引起的一種急性出血性傳染病。病死率很高，可達50％～90％。
埃博拉病毒基因組為單股負鏈RNA，約長19kb，能編碼核蛋白(NP)及包膜蛋白(VP35、VP40、VP30、VP24)、糖蛋白(GP)和RNA聚合酶等7個結構蛋白，其中GP基因對EBOV復制有獨特的編碼和轉錄功能。病毒在感染細胞的胞質中復制、裝配，以芽生方式釋放。埃博拉病毒主要包括扎伊爾型(EBOV-Z)，蘇丹型(EBOV-S)，科特迪瓦型(EBOV-C)及雷斯頓型(EBOV-R)等，不同亞型的特性不同，其中扎伊爾型毒力最強，蘇丹型次之，兩者對人類和非人靈長類的致死率很高。雷斯頓型和科特迪瓦型對人的毒力較低，表現為亞臨床感染，但對非人靈長類具有致命性。
EBOV是一種人獸共患病毒，其傳播途徑尚不明確，通常由與人類密切接觸到感染動物的血液、分泌物、器官或其他體液造成感染，而直接接觸感染者的體液等均可造成人際傳播。各種非人靈長類動物和人類普遍易感。因此，感染者家屬、醫務人員、檢驗人員、在埃博拉病毒流行現場的工作人員，感染動物接觸者等均是高危人群。
EBOV是一種泛嗜性的病毒，可侵犯各系統器官，尤以肝、脾損害為重。埃博拉病毒病的發生與機體的免疫應答水平有關。單核吞噬細胞系統尤其是吞噬細胞是首先被病毒攻擊的靶細胞，隨后成纖維細胞和內皮細胞均被感染，血管通透性增加，纖維蛋白沉著。感染后2天病毒首先在肺中檢出，4天后在肝、脾等組織中檢出，6天后全身組織均可檢出。
目前許多關于病毒致病性的研究都是在動物模型和體外實驗中進行的，而關于人體病毒感染的相關研究少。病毒感染機體的每個階段，從病毒進入細胞、局部復制、傳播(病毒血癥)、在靶器官內繁殖、患者康復(但仍帶毒)或死亡，均存在兩種因素的相互制約：病毒感染和宿主機體應答與防御。研究EBOV對人類的致病機理和免疫逃逸機制，進而根據這些關鍵步驟，確定新型靶標位點，研發治療藥物，對于埃博拉出血熱的綜合防控具有重要意義。同時，研究人體感染EBOV的反應特征，發現感染和預后特征性的分子標識，對于建立快速診斷方法、建立及時有效干預方案可以提供理論依據。
技術實現要素：
本發明所要結決的技術問題是如何診斷EBOV感染。
為解決上述技術問題，本發明首先提供了下述1)或2)的應用：
1)檢測R1含量的系統在制備診斷或輔助診斷EBOV感染產品中的應用；所述R1為hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-574-5p和/或hsa-miR-941；
2)檢測所述R1含量的系統在診斷或輔助診斷EBOV感染中的應用。
上述應用中，所述檢測R1含量的系統可為利用現有技術中的方法檢測所述R1含量所需的試劑和/或儀器，如利用高通量測序檢測所述R1含量所需的試劑和/或儀器，或利用定量PCR檢測所述R1含量所需的試劑和/或儀器，或利用northern雜交技術檢測所述R1含量所需的試劑和/或儀器，或利用基因芯片檢測所述R1含量所需的試劑和/或儀器。
上述應用中，所述高通量測序可利用Illumina測序平臺進行。
上述應用中，所述檢測R1含量的系統還可包括數據處理系統，所述數據處理系統用來分析現有技術中的方法直接得到的結果，確定所述R1的含量。所述數據處理系統可為軟件和/或模塊。
為解決上述技術問題，本發明還提供了下述N1)或N2)的應用：
N1)以所述R1作為EBOV感染標志物的診斷或輔助診斷EBOV感染方法中所用的系統在下述a1)或a2)中的應用：
a1)制備診斷或輔助診斷EBOV感染產品；
a2)診斷或輔助診斷EBOV感染；
N2)以所述R1作為EBOV感染標志物在上述a1)或a2)中的應用。
所述以所述R1作為EBOV感染標志物的診斷或輔助診斷EBOV感染方法中所用的系統可為上文所述檢測R1含量的系統。
為解決上述技術問題，本發明還提供了診斷或輔助診斷EBOV感染產品。
本發明所提供的診斷或輔助診斷EBOV感染產品，為所述檢測R1含量的系統。
為解決上述技術問題，本發明還提供了非診斷目的的EBOV病毒載量相關分子特征譜的構建方法。
本發明所提供的非診斷目的的EBOV病毒載量相關分子特征譜的構建方法包括：分別對EBOV感染組和非EBOV感染組血液中的RNA進行定量分析，根據分析結果獲得EBOV病毒載量相關分子特征譜；所述EBOV病毒載量相關分子特征譜為所述R1。
上述方法中，所述對EBOV感染組和非EBOV感染組血液中的RNA進行定量分析具體還可包括：純化EBOV感染組和非EBOV感染組血液中的RNA，利用Illumina測序平臺檢測RNA的含量。
所述純化EBOV感染組和非EBOV感染組血液中的RNA可利用15％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(PAGE)進行。純化得到的RNA可為15-30bp的RNA。
所述利用Illumina測序平臺檢測RNA的含量可包括：將純化后的RNA連接3’和5’端接頭后反轉錄為cDNA；然后進行PCR擴增，構建文庫；利用Illumina測序平臺對所述文庫進行高通量測序，檢測待測樣本中RNA的含量。
所述反轉錄可利用反轉錄酶進行，如Invitrogen的SuperScriptII反轉錄酶。
所述擴增的條件可為：98℃預變性30s，98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，14個循環，72℃延伸8min。
上述方法中，所述EBOV感染組可包括至少一個EBOV感染者。所述非EBOV感染組可包括至少一個非EBOV感染者。
本發明中，所述診斷或輔助診斷EBOV感染產品可為診斷或輔助診斷EBOV感染的醫藥和/或衛生器械，如試劑、試紙、材料或儀器。
本發明中，所述R1含量可為血液中所述R1的含量。
在實際應用中，可通過比較所述R1的11個miRNA在待測對象與非EBOV感染者血液中的表達水平來判斷待測對象是否為EBOV感染者。具體的判斷標準可為：如待測對象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941這11個miRNA中有至少一個的表達水平低于非EBOV感染者相應miRNA表達水平的1/3，所述待測對象為候選為EBOV感染者，如所述待測對象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941這11個miRNA的表達水平均不低于非EBOV感染者相應miRNA表達水平的1/3，所述待測對象非或候選非EBOV感染者。
本發明通過分析EBOV感染者與非EBOV感染者的差異表達miRNA，進一步通過相關性分析，發現了與EBOV病毒感染相關的miRNA(p<0.01)：11個miRNAs這11個miRNAs分別為：hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-941，并且這11個miRNA在EBOV感染者中相對于非EBOV感染者中表達量下降，表明這11個miRNA可以作為生物分子標識，用于EBOV感染者的臨床診斷。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、EBOV感染者血液中與病毒載量相關的分子標識
從EBOV感染者與非EBOV感染者全血中提取總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠吸附純化總RNA中的mRNA，在加熱條件下將mRNA片段化，并以此為模板反轉錄合成雙鏈cDNA。對雙鏈cDNA進行末端修復補齊，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。將帶3’dTMP端的雙鏈cDNA接頭連到測序接頭上，通過PCR擴增，利用AMPure XP磁珠富集純化接頭產物，通過PCR反應鑒定文庫。將構建好的文庫用Illumina測序平臺進行雙末端測序。使用Perl腳本過濾測序產生的原始數據中的接頭序列、兩端低質量序列(Q<＝20的堿基數占整條reads的50％以上的序列)、低復雜度序列。
使用Tophat軟件將有效數據比對到人參考基因組上，Cutfflinks軟件組裝比對結果，通過Cutffdiff軟件得出EBOV感染者(n＝22)與非EBOV感染者(n＝10)相比的差異表達基因，進一步通過相關性分析，發現與EBOV感染者血液中EBOV病毒載量相關的差異表達分子。結果顯示，89個基因的差異表達與EBOV病毒載量相關(r2>0.64,p<0.01)，其中，排在前10的分子為：DPAGT1(dolichyl-phosphate N-acetylglucosaminephosphotransferase 1),GPR125(G protein-coupled receptor 125),CYP4B1(cytochrome P450 family 4 subfamily B member 1),PTPRK(protein tyrosine phosphatase,receptor type K),NEK10(NIMA related kinase 10),NCAPD3(non-SMC condensin II complex subunit D3),ABCA13(ATP binding cassette subfamily A member 13),DNAH11(dynein,axonemal,heavy chain 11),KDELC1(KDEL motif containing 1),MTA3(metastasis associated 1 family member 3)，并且這10個分子在EBOV感染者中相對于非EBOV感染者中表達量增加。具體結果如表1所示，表明這10個分子可以作為生物分子標識，用于EBOV感染者的臨床診斷。
表1、EBOV感染相關的分子標識
注：表1中列出了10個分子在EBOV感染者中相對于非EBOV感染者中表達水平的差異倍數及10個分子與EBOV病毒載量相關性分析結果。
在實際應用中，可通過比較DPAGT1、GPR125、CYP4B1、PTPRK、NEK10、NCAPD3、ABCA13、DNAH11、KDELC1和MTA3在待測對象與非EBOV感染者血液中的表達水平來判斷待測對象是否為EBOV感染者。具體的，根據上述結果得到的判斷標準如下：如待測對象的DPAGT1、GPR125、CYP4B1、PTPRK、NEK10、NCAPD3、ABCA13、DNAH11、KDELC1和MTA3這10個基因中至少有一個的表達水平高于非EBOV感染者相應基因的3倍，該待測對象疑似EBOV感染者，如待測對象的DPAGT1、GPR125、CYP4B1、PTPRK、NEK10、NCAPD3、ABCA13、DNAH11、KDELC1和MTA3這10個基因的表達水平均不高于非EBOV感染者相應基因的3倍，該待測對象為非EBOV感染者。
實施例2、EBOV感染者血液中與病毒載量相關的小RNAs(sRNAs)
從EBOV感染者與非EBOV感染者全血中提取總RNA，利用15％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(PAGE)從總RNA中分離小片段(15-30nt)RNA，純化后對分離的小片段RNA連接3’和5’端接頭，再運用SuperScriptII反轉錄酶(Invitrogen產品)將連接有接頭的RNA進行反轉錄，合成cDNA。然后，進行PCR擴增，擴增程序：98℃預變性30s，98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，14個循環，72℃延伸8min，由此構建文庫。最后，擴展產物利用Illumina測序平臺進行高通量測序。使用Perl腳本過濾測序產生的原始數據中的接頭序列、兩端低質量序列(sQ<＝5的堿基數占整條reads的50％以上的序列、N的比例大于10％的序列、polyA/T/G/C序列)。
使用bowtie軟件將長度篩選后的sRNA有效數據比對到人參考基因組上，分析sRNAs在參考基因組上的分布和表達情況，將比對上的序列與miRBase序列進行比對，獲得miRNA信息，同時盡可能的去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA。結合樣本信息得出EBOV感染者(n＝12)與非EBOV感染者(n＝3)相比的差異表達miRNA，進一步通過相關性分析，發現與EBOV病毒感染相關的miRNA。結果顯示，11個miRNAs以及它們的靶基因與EBOV病毒載量(VL)相關(p<0.01，差異表達倍數>3)，這11個miRNAs分別為：hsa-miR-151a-5p,hsa-miR-744-5p,hsa-miR-423-5p,hsa-miR-331-3p,hsa-miR-1306-5p,hsa-miR-1285-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-550a-5p,hsa-miR-3940-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-941。miRNAs在高水平(VL>107拷貝/mL全血)和中水平(105拷貝/mL全血<VL<107拷貝/mL全血)的病毒載量的EBOV感染樣本中的表達水平值見于下表2，并且這11個miRNA在EBOV感染者中相對于非EBOV感染者中表達量下降。具體結果如表2所示，表明這11個miRNA可以作為生物分子標識，用于EBOV感染者的臨床診斷。
表2、EBOV感染相關的miRNA
注：表2中列出了11個miRNA的表達水平(中位數TPM值)及與EBOV病毒載量相關性分析結果。
在實際應用中，可通過比較這11個miRNA在待測對象與非EBOV感染者血液中的表達水平來判斷待測對象是否為EBOV感染者。具體的，根據上述結果得到的判斷標準如下：如待測對象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941這11個miRNA中有至少一個的表達水平低于非EBOV感染者相應miRNA表達水平的1/3，該待測對象疑似EBOV感染者，如待測對象的hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-3940-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-550a-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-744-5p和hsa-miR-941這11個miRNA的表達水平均不低于非EBOV感染者相應miRNA表達水平的1/3，該待測對象為非EBOV感染者。
實施例3、EBOV感染者血液中與臨床預后相關的分子標識
從EBOV感染者與非EBOV感染者全血中提取總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠吸附純化總RNA中的mRNA，在加熱條件下將mRNA片段化，并以此為模板反轉錄合成雙鏈cDNA。對雙鏈cDNA進行末端修復補齊，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。將帶3’dTMP端的雙鏈cDNA接頭連到測序接頭上，通過PCR擴增，利用AMPure XP磁珠富集純化接頭產物，通過PCR反應鑒定文庫。將構建好的文庫用Illumina測序平臺進行雙末端測序。使用Perl腳本過濾測序產生的原始數據中的接頭序列、兩端低質量序列(Q<＝20的堿基數占整條reads的50％以上的序列)、低復雜度序列。
使用Tophat軟件將有效數據比對到人參考基因組上，Cutfflinks軟件組裝比對結果，通過Cutffdiff軟件得出EBOV感染者(n＝22)與非EBOV感染者(n＝10)相比的差異表達基因，進一步通過相關性分析，發現與EBOV病毒感染者預后相關的分子標識。結果顯示，22個分子的差異表達與EBOV病毒感染預后相關(p<0.01，差異表達倍數>2)，其中，15個基因編碼蛋白質，其編碼的蛋白質的名稱為：MS4A2(membrane spanning 4-domains A2),SYCN(syncollin),LCE3E(late cornified envelope 3E),FJX1(four jointed box 1),ARMS2(age-related maculopathy susceptibility 2),RMI2(RecQ mediated genome instability 2),PHLDA2(pleckstrin homology like domain family A member 2),OPRM1(opioid receptor mu 1),TGFBR3L(transforming growth factor beta receptor 3 like),BEND5(BEN domain containing 5),TP53AIP1(tumor protein p53 regulated apoptosis inducing protein 1),SBK2(SH3 domain binding kinase family member 2),GJC2(gap junction protein gamma 2),LDHD(lactate dehydrogenase D),CHST1(carbohydrate sulfotransferase 1)；7個為lincRNA，這7個lincRNA具體為：RP11-552E20.4,RP4-758J18.10,RP11-142G7.2,RP5-1065P14.2,RP11-255A11.21,LINC00639,LINC00092。并且這22個分子在EBOV感染者中的死亡群體中相對于存活群體中表達量升高。具體結果如表3所示，表明這22個分子可以作為生物分子標識，用于EBOV感染者的預后。
表3、預后EBOV病毒感染的分子標識
注：表3中列出了23個分子的表達水平(中位數FKPM值)及其與EBOV感染者預后的分析結果。
在實際應用中，可通過分析這22個分子在待測對象血液中的表達量來對待測對象預后。具體的，根據上述結果得到的判斷標準如下：在以EBOV感染者為待測對象時，如待測對象的MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092這22個分子中有至少一個的表達水平高于EBOV感染者中的存活對象中相應分子表達水平的2倍，該待測對象疑似為高死亡風險EBOV感染者，如待測對象的MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092這22個分子的表達水平均不高于EBOV感染者中的存活對象中相應分子表達水平的2倍，該待測對象為非高死亡風險EBOV感染者，即MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092這22個分子中至少一個表達水平高的EBOV感染者的死亡風險高于MS4A2、SYCN、LCE3E、FJX1、ARMS2、RMI2、PHLDA2、OPRM1、TGFBR3L、BEND5、TP53AIP1、SBK2、GJC2、LDHD、CHST1、RP11-552E20.4、RP4-758J18.10、RP11-142G7.2、RP5-1065P14.2、RP11-255A11.21、LINC00639和LINC00092這22個分子的表達水平均低的EBOV感染者。
實施例4、EBOV感染者血液中與臨床預后相關的細胞因子
從EBOV感染者與非EBOV感染者全血中提取總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠吸附純化總RNA中的mRNA，在加熱條件下將mRNA片段化，并以此為模板反轉錄合成雙鏈cDNA。對雙鏈cDNA進行末端修復補齊，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。將帶3’dTMP端的雙鏈cDNA接頭連到測序接頭上，通過PCR擴增，利用AMPure XP磁珠富集純化接頭產物，通過PCR反應鑒定文庫。將構建好的文庫用Illumina測序平臺進行雙末端測序。使用Perl腳本過濾測序產生的原始數據中的接頭序列、兩端低質量序列(Q<＝20的堿基數占整條reads的50％以上的序列)、低復雜度序列。
使用Tophat軟件將有效數據比對到人參考基因組上，Cutfflinks軟件組裝比對結果，通過Cutffdiff軟件得出EBOV感染者(n＝22)與非EBOV感染者(n＝10)相比的差異表達基因，進一步通過相關性分析，發現與病毒感染預后相關的細胞因子。結果顯示，8個細胞因子的差異表達與病毒感染預后相關(p<0.01，差異表達倍數>1.5)，這8個細胞因子分別為：THPO(thrombopoietin),STC2(stanniocalcin 2),IL17D(interleukin 17D),SEMA3C(semaphorin 3C),SEMA3F(semaphorin 3F),EDN2(endothelin 2),GDF10(growth differentiation factor 10),FGF20(fibroblast growth factor 20)，并且這8個細胞因子在EBOV感染者中的死亡群體中相對于存活群體中表達量升高。具體結果如表4所示，表明這8個細胞因子可以作為生物分子標識，用于EBOV感染者的預后。
表4、預后EBOV病毒感染的細胞因子
注：表4中列出了8個細胞因子的表達水平(中位數FKPM值)及其與EBOV感染者預后的分析結果。
在實際應用中，可通過分析這8個細胞因子在待測對象血液中的表達量來對待測對象預后。具體的，根據上述結果得到的判斷標準如下：在以EBOV感染者為待測對象時，如待測對象的THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20這8個細胞因子中至少有一個的表達水平高于EBOV感染者中的存活對象相應細胞因子表達水平的150％，該待測對象疑似為高死亡風險EBOV感染者，如待測對象的THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20這8個細胞因子的表達水平均不高于EBOV感染者中的存活對象相應細胞因子表達水平的150％，該待測對象為非高死亡風險EBOV感染者，即THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20中至少一個表達水平高的EBOV感染者的死亡風險高于THPO、STC2、IL17D、SEMA3C、SEMA3F、EDN2、GDF10和FGF20的表達水平均低的EBOV感染者。
本發明還另外選取了非EBOV感染者、存活EBOV感染者以及死亡EBOV感染者的血液樣本，利用定量RT-PCR技術檢測了這8個細胞因子中的THPO基因和STC2基因在這些研究對象血液中的表達水平。其中，THPO基因的引物序列為5'-TCACTGCCTCAGCCAGAACTAC-3'(序列1)和5'-GGTTCAGCAGACCAGGAATCTT-3'(序列2)，測試非EBOV感染者15例、存活EBOV感染者31例、死亡EBOV感染者18例的血液樣本；STC2基因的引物序列為5'-CACAGGTTCGGCTGCATAAG-3'(序列3)和5'-AGTTCACGAGGTCCACGTAGG-3'(序列4)，測試非EBOV感染者15例、存活EBOV感染者26例、死亡EBOV感染者14例的血液樣本。
結果發現，THPO和STC2在存活EBOV感染者血液中的表達水平均明顯低于死亡EBOV感染者血液中相應細胞因子表達水平(表5)，表明，THPO和STC2是可以作為標志物對EBOV感染者進行預后的。
表5、研究對象血液中STC2和THPO的RT-PCR實驗結果
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