核盤菌凝集素SSL?6蛋白及其編碼基因與應用的制作方法

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種核盤菌凝集素SSL-6蛋白及其編碼基因與在抗油菜菌核病方面的應用。

背景技術：

油菜是重要的經濟作物。來自油菜的菜籽油是人類最主要的食用油來源之一，是我國糧油安全保障的重要一環，為我國重要的戰略物質之一。目前，我國的食用油將近60％依賴進口。制約我國油菜產量與品質提高的重要限制因素之一是核盤菌對田間油菜的危害。菌核病是由腐生型真菌核盤菌寄生引起的一種世界范圍性嚴重病害，是我國油菜最主要病害，嚴重影響油菜的品質和產量。一般年份菌核病發病率為10％-30％，嚴重的時候可以達到80％以上(費維新,李強生,吳新杰.中國油料作物學報,2002,3:47-49)。

目前，如何防治油菜抗菌核病主要有如下途徑：農藥與生物防治、選育抗(耐)菌核病材料、基因工程方法。通過這些途徑，取得了一些成績，篩選到一些抗(耐)病性比較好的材料，但是生產中菌核病危害嚴重的問題依然存在(劉正立,劉春林.甘藍型油菜抗菌核病研究進展.中國農學通報,2015,31(15):114-123)。

基因工程途徑解決菌核病危害的問題，應該是一條可行的途徑，可是現有的思路與轉基因實踐并未獲得顯著提高抗菌核病的油菜材料。為此，與以往基因工程的策略不同，本發明人改變思路，采用“以毒攻毒”的思想，克隆核盤菌中推測為凝集素SSL-6的基因，并構建該基因的過表達質粒；然后將核盤菌凝集素SSL-6蛋白基因轉入甘藍型油菜中，以期獲得具有抗菌核病的油菜種質資源。本發明通過基因工程的方法，首次發現核盤菌凝集素SSL-6蛋白及其編碼基因，該基因可顯著提高油菜對核盤菌的抗性。

技術實現要素：

本發明的目的是，針對上述現有技術的不足，提供一種來源于油菜病原菌核盤菌的核盤菌凝集素SSL-6蛋白及其編碼基因，同時提供該基因在油菜抗核盤菌中的應用。

為達上述目的，本發明所采用的技術方案是：一種核盤菌凝集素SSL-6蛋白，來源于油菜致病菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)，是下述氨基酸殘基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No:1；

2)將序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列經過一至五個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對提高油菜抗菌核病作用的蛋白質。

編碼本發明核盤菌凝集素SSL-6蛋白的基因(SSL-6)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列；

2)編碼序列表中的SEQ ID No:1蛋白質序列的DNA；

3)與序列表中的SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；

4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

上述高嚴謹條件為：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No:2由936個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-933位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列的蛋白質。

本發明還包括含有本發明基因的重組表達載體、轉基因細胞系和工程菌以及擴增該基因中任一片段的引物對。

本發明還提供上述的核盤菌凝集素SSL-6蛋白基因在調控油菜抗菌核病中的應用。

本發明還提供將編碼上述核盤菌凝集素SSL-6蛋白的基因轉入油菜中，經培育得到轉基因油菜，該轉基因油菜的抗菌核病能力得到提高，從而得到抗核盤菌侵染的高抗菌核病的油菜種質資源。

本發明的為核盤菌凝集素SSL-6蛋白基因的過表達轉基因油菜對菌核病抗性顯著提高。本發明為油菜提高油菜抗菌核病提供了一個優質基因。本發明的蛋白質及其編碼基因具有較高的實際應用價值，應用前景廣闊。

附圖說明

圖1是核盤菌菌核在PDA培養基上培養5天的生長情況圖。

其中：5d表示生長到第5天時的菌絲分別情況，S3表示緊靠培養皿壁的發育中的新菌核。

圖2是從發育中的核盤菌菌核中分離出的總RNA電泳圖。

其中：M為指示DNA片段大小的DNA分子標記，1、2為核盤菌菌核樣品；該兩個樣品來源的RNA都有明顯5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA三條帶，說明RNA質量可靠，能用于下一步反轉錄合成cDNA。

圖3是核盤菌凝集素SSL-6蛋白基因全長CDS的PCR擴增產物電泳圖。

其中，M為DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA標記，1為擴增產物。

圖4是構建的SSL-6基因過表達質粒的菌落PCR驗證電泳圖。

其中：M為指示DNA片段大小的DNA分子標記，1為空白對照，2-8為單菌落。

圖5是構建的SSL-6基因過表達質粒的酶切驗證電泳圖。

其中：M為指示DNA片段大小的DNA分子標記，1為未經酶切的表達質粒，2為經NcoI和XbaI雙酶切的表達質粒。

圖6是轉pFGC5941-SSL-6CDS質粒的油菜抗性苗的轉基因PCR檢測電泳圖。

其中：M為DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA標記，1-5、7、8和11為過表達轉基因植株；6、9、10為非轉基因植株；12為空白對照，13為陽性對照。

圖7是轉基因植株中目標基因表達的RT-PCR檢測圖。

其中：1-8為轉基因植株，9為空白對照；BnaACTIN2為油菜看家基因的表達情況，作為表達量的相對參照；SSL-6為轉基因植株中SSL-6基因的相對表達量。

圖8是核盤菌接種油菜的抗性試驗圖。

其中：A為轉基因植株，B為受體植株；從菌斑大小可以看出轉SSL-6基因的植株抗菌核病能力顯著提高。

具體實施方式

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。所用引物和測序工作由上海生工生物科技有限公司完成。

實施例1.核盤菌總RNA分離與凝集素SSL-6蛋白基因全長CDS的克隆

一、核盤菌總RNA分離與第一互補鏈cDNA的合成

在超凈工作臺上，將核盤菌菌株SS-3(由湖南農業大學作物代謝調控實驗室提供)的菌核用75％的乙醇消毒5min，用滅菌蒸餾水沖洗3次，滅菌后的菌核接種到帶PDA固體培養基的培養皿中央；接種后培養皿放置在培養箱中，25℃暗培養5天。暗培養第5天，沿著培養皿壁會有新的菌核形成(圖1)。從接種后培養第5天的培養皿中，取發育中的菌核約100mg放入1.5mL離心管中，蓋緊管蓋，迅速轉移至液氮中速凍；往離心管中加入700μL REB(RNA extraction buffer(REB)組成：1M Tris-HCl(pH＝8)40mL，0.5M EDTA(pH＝8)10mL，LiCl 3.4g，SDS 2g，H₂O定容至200mL)，并用電動研磨棒快速研磨；研磨充分后，加入700μL水飽和酚，劇烈振蕩，12000×g，4℃離心10min；取上清液至1.5mL離心管中，并加入600μL氯仿，充分振蕩，12000×g，4℃離心10min；取上清液至另一個1.5mL離心管中，加入200μL的冷乙醇和40μL 3M的NaAc，-20℃靜置20min以上；12000×g，4℃離心10min后棄上清液，加入700μL的75％乙醇(DEPC處理水配制)，洗滌沉淀；11000×g，4℃離心5min后棄上清液，將帶有總RNA沉淀的離心管放入生物安全柜中吹干，至沉淀為半透明狀，然后加入40μL無RNA酶水(RNase-free水)溶解RNA 5min左右；整個操作要帶口罩及一次性手套。

取RNA溶液5μL與1×loading buffer(6×loading buffer：30mM EDTA,36％(v/v)甘油,0.05％(w/v)溴酚藍)混合，用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，見圖2。結果顯示：第二泳道的28S rRNA的亮度大約是18S rRNA的2倍，而且5S的條帶較弱，未見DNA殘留，表明提取的核盤菌RNA質量較好，純度較高，可用于下一步反轉錄合成cDNA。提取的總RNA溶液經DNAase酶消化后，利用Thermo Scientific公司商業化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA(具體步驟按照試劑盒說明書操作)，反轉錄成的cDNA用于下一步SSL-6基因全長CDS的克隆的PCR模板。

二、核盤菌SSL-6基因全長CDS克隆

從NCBI網站上查找核盤菌凝集素目標基因的參考序列為XM_001584918，根據參考的CDS全長序列，使用Primer Premier 5軟件設計SSL-6基因全長CDS的PCR引物對，引物序列分別為正向引物SSL-6CDSF：5’－TCTAGAATGTCTCTTCTTACCACGGAGCTTG－3’(SEQ ID No:3，下劃線表示為XbaI酶切位點)和反向引物SSL-6CDSR：5’－CCATGGTCATGCGGGGATGACAGTAGTACC－3’(SEQ ID No:4，下劃線表示為NcoI酶切位點)。以前述反轉錄成的cDNA為模板，高保真PCR擴增SSL-6基因的全長CDS序列。50μl PCR反應體系包含：模板2μl，高保真酶Phusion High-fidelity DNA Polymerase(Invitrogen)1μl，10×緩沖液5μl，2.5uM dNTP 8μl，20μM的正向和反向引物各1μl，水32μl。反應條件為：94℃預變性2分鐘；94℃變性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，共30個循環。反應結束后，將PCR產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3，擴增得到一條936bp大小的DNA片段，與預期的目標片段大小相符。將擴增片段回收并純化后，將其克隆到載體pEASY-Blunt Cloning(購自全式金公司)中，得到含有目的片段的重組質粒pEASY-SSL-6CDS，經轉化、篩選后測序，結果見SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，其由936個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-936位堿基(最后三個堿基為終止密碼子TGA)，編碼具有SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列的蛋白質,為311個氨基酸殘基，編碼的蛋白命名為SSL-6。

實施例2.SSL-6基因過表達質粒的構建

選擇測序正確的pEASY-SSL-6CDS重組質粒，與pFGC5941質粒分別同時用Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI(Fermetans)兩種質粒進行雙酶切，酶切溫度37℃，酶切時間為30-40min，反應體系40μL(1μg質粒DNA，2μL 10×FastDigest Green Buffer，0.5μL FastDigest NcoI，0.5μL FastDigest XbaI，加水至40μL)，具體按照Fermetans公司試劑盒說明進行；酶切產物經過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒純化回收，將回收的兩個目標DNA片段通過T4連接酶連接，連接產物通過熱激法轉化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5α，轉化細胞在液體LB培養基中，37℃、200rpm的條件下復蘇1h；將經過恢復培養的細胞均勻涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養皿上，37℃培養16h。挑取LB固體培養基上的單菌落，以引物35SF：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'(SEQ ID No.5)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)進行菌落PCR鑒定，見圖4，顯示PCR擴增產物電泳帶在1000bp與900bp之間，結果與預期的片段大小一致。選擇PCR檢測正確的單菌落擴大培養，提取質粒，以Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI進行雙酶切驗證，見圖5，雙酶切片段弱大于1000bp，與預期的片段大小一致。PCR鑒定和雙酶切鑒定兩種結果都說明過表達質粒pFGC5941-SSL-6CDS構建成功。

實施例3.甘藍型油菜轉化及分子鑒定與轉基因油菜抗菌核病檢測

一、甘藍型油菜轉化

一)外植體的準備

選取甘藍型油菜易感病品種“98C40”完整飽滿的種子約100顆，置于150mL三角瓶中。向裝有種子的三角瓶中加入20-30mL 75％乙醇，振蕩消毒30s，棄去酒精；再加入20mL 0.1％HgCl₂和1滴TWEEN-20的消毒液，劇烈搖晃至起泡，靜置20min，棄去消毒液，用無菌水反復沖洗3-5遍以洗凈泡沫；加入50mL經高溫滅菌的無菌水浸泡種子，浸泡時間為1h；倒掉無菌水，把種子均勻鋪在1/2MS固體培養基上，22℃暗培養4-5d。待油菜幼苗長到4-5cm后將其轉移到光照條件下生長6-8h，使幼苗子葉轉綠。子葉柄作為轉化的外植體。

二)農桿菌的準備

幼苗生長到1-2cm時，開始準備菌液。將分別帶有pFGC5941-SSL-6CDS質粒的農桿菌LBA4404菌株在含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB固體培養基上劃線，28℃恒溫培養3d。挑取單菌落于10mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB液體培養基中，28℃、200rpm擴大培養16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB液體培養基中，擴大培養至菌液OD₆₀₀達到0.4-0.8。

三)子葉柄的農桿菌轉化與抗性苗篩選

將油菜幼苗子葉柄從生長點以上的分支處切下，轉移到BM液中。將擴大后的農桿菌菌液從三角瓶轉移至50mL離心管，6000rpm/min離心10min，去上清后于離心管中加入25mL BM液，振蕩使農桿菌重懸；再加入10μLβ-巰基乙醇和20μL乙酰丁香酮，搖勻后作為工作液倒入已滅菌的平皿中。將切好的子葉柄轉到該工作液中浸泡10min。浸泡后，將子葉柄轉移到已滅菌的吸水紙上。用鑷子翻動子葉柄使子葉柄表面殘留工作液被吸水紙吸干。最后將子葉柄均勻鋪放在共培培養基(1升MS+1mg 6-芐氨基嘌呤+30g蔗糖+1.6g植物凝膠)上，22℃，暗共培養36h。共培完成后，將外植體轉移到篩選培養基(1升MS+2mg 6-芐氨基嘌呤+20mg草銨膦+500mg頭孢霉素+30g蔗糖+1.6g植物凝膠)中。22℃，長日照培養；每10-14d更換一次篩選培養基。

當外植體分化出若干簇抗性不定芽后，將不定芽切開分離后放入生根培養基(1升1/2MS+20mg草銨膦+10g蔗糖+1.6g植物凝膠)上繼續培養。分化苗長出足夠的根系后，將其從生根培養基中取出，并用無菌水將根上殘留的培養基清洗干凈。然后將分化苗移入蛭石中，煉苗10天。煉苗之后轉入土壤中，共獲得草銨膦抗性苗11株。抗性苗用于下一步PCR轉基因檢測鑒定。

四)抗性苗轉基因鑒定與SSL-6基因表達檢測

用CTAB方法從轉pFGC5941-SSL-6CDS質粒的抗性苗葉組織中提取總DNA，以總DNA作為模板，35SF(SEQ ID No.5)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)為引物，進行PCR檢測(擴增片段為1925bp)，檢測結果顯示與質粒為陽性對照擴增片段大小一致的有8株，說明總共獲得了8株SSL-6基因過表達轉基因植株(見圖6)。用Trizol(Invitrogen)法提取8株轉基因植株葉片中的總RNA，利用Thermo Scientific公司商業化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA(具體步驟按照試劑盒說明書操作)。以cDNA為模板，SSL-6CDSF(SEQ ID No.3)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)為引物，用半定量RT-PCR方法擴增目標片段，以BnaACTIN2基因作為內參。結果顯示8株轉基因植株中，有7株植株有SSL-6表達，但是表達程度不同，又高有底(見圖7)。選SSL-6基因表達量最高的轉基因植株做抗菌核病鑒定。

二、轉基因油菜抗菌核病檢測

所用核盤菌的菌株為能侵染油菜的菌株SS-3(由湖南農業大學作物代謝調控實驗室提供)。取其飽滿、無裂無霉變的SS-3的菌核顆粒，用75％乙醇浸泡5min，無菌水沖洗3～4次，滅菌后接種到帶PDA培養基的培養皿中央，放置在培養箱中，25℃暗培養2-3天。接種用植株為生長到有4片真葉的轉基因植株與易感病98C40受體植株。在PDA培養基上生長大約3天，核盤菌菌絲已經觸及平皿邊緣，用直徑為1厘米的打孔器沿著圓形培養皿邊緣采集菌塊；將菌塊上帶有菌絲的面覆蓋到油菜葉片上，使菌絲與葉片表面直接接觸；將接種了核盤菌菌絲的植株轉入28℃，濕度大于90％的光照培養箱中。放置5-7天后，觀察接種核盤菌菌絲的葉片上形成的菌斑大小。結果見圖8，顯示，轉基因植株接種葉片上的菌斑明顯小于易感菌核病品種98C40受體植株葉片上的病斑，說明SSL-6基因能顯著提高油菜抗菌核病的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南農業大學

<120> 核盤菌凝集素SSL-6蛋白及其編碼基因與應用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum)

<400> 1

Met Ser Leu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Cys Thr Ser Ala Pro Asp Gln

1 5 10 15

Val Leu His Leu Phe Phe Gln Asp Gly Gln Asn Ile Leu Glu Ala Arg

20 25 30

Ser Pro Asp Gly Gly Asn Val Trp Thr Thr Gln Asp Thr Ile Ile Ala

35 40 45

Lys Asp Gly Asp Tyr Asn Gly Ser Ser Met Thr Cys Tyr Tyr Val Asp

50 55 60 65

Lys Asp Ala Asn Phe Asp Asn Gln Pro Ser Ile His Leu Leu Tyr Met

70 75 80

Asn Lys Asp Lys Gln Leu Thr Glu Lys Val Lys Arg Met Lys Gly Asp

85 90 95

Asn Pro Ile Trp Glu Asp Ala Lys Val Pro Asp Glu Val Arg Lys Gly

100 105 110

Pro Glu Gln Tyr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Ser Phe Asn Gln Gly Thr

115 120 125

Gly Trp Asn Pro Asn Gly Ser Gln Trp Ala Tyr Phe Ser Ala Ser Lys

130 135 140 145

Asp Gly Lys Met Gly Ile Val Glu Ile Arg Arg Thr Pro Lys Asp Pro

150 155 160

Trp His Thr Glu Thr Ile Leu Glu Glu Lys Trp Gly Asp Glu Leu Pro

165 170 175

Gly Thr Ala Leu Ala Cys Val Ile Gly Asn Gly Lys Ile Arg Val Phe

180 185 190

Leu Gln His His Asp Tyr Ser Ile Ile Leu Tyr Glu Asn Gln Asn Asn

195 200 205

Thr Trp His Asp Arg Gly Thr Phe Ile Pro Lys Asp Lys Val Gln Ala

210 215 220 225

Thr Thr Pro Leu Ala Cys Thr Met Thr Lys Asp Gly Ser Val His Leu

230 235 240

Phe Tyr Val Ser Lys Ser Asn Lys Ile Ile His Cys Thr Asp Gly Lys

245 250 255

Lys Glu Glu Glu Leu Ile Asn Phe Phe Pro Gly Ser Lys Leu Gly Ala

260 265 270

Thr Ser Val Glu Asn Lys Ile Thr Leu Phe Phe Arg Asn Leu Asn Pro

275 280 285

Val Asn Glu Val Gly Thr Leu Glu Asn Glu Asn Gly Ser Trp Lys His

290 295 300 305

Gly Thr Thr Val Ile Pro Ala

310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum)

<400> 2

atgtctcttc ttaccacgga gcttgcttgc acttctgccc ccgatcaagt cttgcatctt 60

ttcttccaag acggccaaaa cattctcgaa gcgcgatctc cagatggcgg caatgtttgg 120

actactcaag atactatcat tgctaaagat ggagattaca atggctcttc tatgacatgc 180

tactatgtag acaaagacgc aaatttcgat aaccagccct caattcatct cctctacatg 240

aacaaggata agcaattgac ggagaaagtc aagcgcatga agggagacaa tccaatttgg 300

gaggacgcta aggtcccaga cgaagtcagg aaaggaccag agcaatattc gaagttgacc 360

agcggctcat tcaaccaagg cactggttgg aacccgaatg gttcacaatg ggcatacttt 420

tcagcctcca aggatggcaa gatgggcatc gtcgaaattc gacgcactcc aaaagatcca 480

tggcatacag agactattct cgaagaaaag tggggtgatg aactccctgg aaccgctcta 540

gcctgtgtaa ttgggaatgg aaagatcagg gtgttcctcc agcaccatga ctacagcatc 600

atactctacg aaaatcaaaa caacacatgg catgaccgag gcaccttcat tccgaaagac 660

aaggttcaag ccacaacacc gcttgcttgc accatgacca aggacggaag cgtccatctc 720

ttctacgtct caaagtctaa caagattatt cattgcaccg atggcaagaa agaggaagaa 780

ttgatcaatt tcttcccagg ctcgaagttg ggcgctactt cagttgagaa caagatcacc 840

ttgttcttca gaaacttgaa ccctgtcaat gaagttggca cgcttgagaa tgagaatggc 900

tcctggaagc atggtactac tgtcatcccc gcatga 936

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tctagaatgt ctcttcttac cacggagctt g 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccatggtcat gcggggatga cagtagtacc 30

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctatccttcg caagaccctt c 21