本發明涉及一種透明質酸酶的固定化方法，屬于酶工程領域。
背景技術：
透明質酸(hyaluronic acid，簡稱HA)，俗稱玻璃尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復雙糖單位，通過β(1-3)和β(1-4)糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得，廣泛用于醫藥、化妝品、食品等領域。研究表明，分子量對透明質酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質酸甚至表現出截然相反的活性。
透明質酸以其獨特的分子結構和理化性質在機體內顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節，調節血管壁的通透性，調節蛋白質，水電解質擴散及運轉，促進創傷愈合等。尤為重要的是，透明質酸具有特殊的保水作用，是目前發現的自然界中保濕性最好的物質，被稱為理想的天然保濕因子，由于HA具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用于化妝品、食品和醫藥等行業領域。
透明質酸酶(hyaluronidase,HAase)主要專一性水解透明質酸，廣泛存在于真核和原核生物中，在動物機體內參與許多重要的生物學過程，例如細胞分裂、細胞間的連接、生殖細胞的活動、DNA的轉染、胚胎發育、受傷組織的修復，以及正常細胞和腫瘤細胞增生，是一種重要的生理活性物質。
水蛭來源的透明質酸酶對底物的專一性強，屬于透明質酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通過水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產物。與其它來源的透明質酸酶相比，它對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉糖苷活性，活性不受肝素影響。
采用水蛭透明質酸酶催化降解HA，產生分子量范圍均一的小分子透明質酸，具有反應條件溫和、專一性高、且產品純度高的特定。但如何降低透明質酸酶的消耗量、提高酶的使用壽命，成為進一步提高生產效率的途徑。
技術實現要素：
本發明提供了一種固定化透明質酸酶的方法，能夠顯著提高透明質酸酶的使用次數。
所述方法，包括以下步驟：
(1)向酶活為10000～15000U/mL的透明質酸酶的酶液中，添加β-環糊精，β-環糊精的添加量為透明質酸酶的酶液的質量的0.5％，攪拌均勻后，在室溫下靜置0.5～1h；
(2)向步驟(1)所得溶液中添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1～2h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為(3～4)：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為3～4％殼聚糖溶液；
(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8～10％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(4)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
在本發明的一種實施方式中，步驟(1)采用酶活為15000U/mL的透明質酸酶的酶液，β-環糊精的添加量為透明質酸酶的酶液的質量的0.5％，攪拌均勻后，在室溫下靜置0.5h。
在本發明的一種實施方式中，步驟(2)向步驟(1)所得溶液中添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為4：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液。
在本發明的一種實施方式中，步驟(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液。
本方法聯合使用β-環糊精、殼聚糖、TPP，對透明質酸酶進行包埋固定化，大幅度地提高了透明質酸酶的熱穩定性，相比較于游離粗酶液在55℃下28min的半衰期，固定化酶在55℃下的半衰期提高到191min；并且固定化酶在重復使用11次后仍然保留了30％的初始酶活。本發明所得固定化透明質酸酶在工業化酶法生產透明質酸中有良好應用前景。
具體實施方式
酶活測定方法：反應體系為20mL，用pH 5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制2mg/ml的HA，反應體系加入8mL的HA溶液、2mL的酶液，緩沖液補足至20mL；在38℃反應20min，立即沸水終止反應，采用DNS法測定產生的還原糖當量，1U為一小時內水解產生1μg還原糖所需酶量。
固定化酶活力的測定只需要將2mL的酶液用一定質量的固定化酶代替，其他步驟相同。固定化酶活收率計算公式如下：
實施例1
(1)向酶活為15000U/mL的透明質酸酶的酶液中，添加β-環糊精，β-環糊精的添加量為透明質酸酶的酶液的質量的0.5％，攪拌均勻后，在室溫下靜置0.5h；
(2)向步驟(1)所得溶液中添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為4：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液；
(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(4)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
實施例2
(1)向酶活為14000U/mL的透明質酸酶的酶液中，添加β-環糊精，β-環糊精的添加量為透明質酸酶的酶液的質量的0.5％，攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；
(2)向步驟(1)所得溶液中添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1.5h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為3.5：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液；
(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的10％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(4)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
對照例1
(1)向酶活為15000U/mL的透明質酸酶的酶液中，添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為4：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液；
(2)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(1)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(3)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
對照例2
(1)向酶活為15000U/mL的透明質酸酶的酶液中，添加β-環糊精，β-環糊精的添加量為透明質酸酶的酶液的質量的1％，攪拌均勻后，在室溫下靜置0.5h；
(2)向步驟(1)所得溶液中添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為4：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液；
(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(4)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
對照例3
(1)向酶活為15000U/mL的透明質酸酶的酶液中，添加β-環糊精，β-環糊精的添加量為透明質酸酶的酶液的質量的0.5％，攪拌均勻后，不經靜置，直接用于步驟(2)；
(2)向步驟(1)所得溶液中添加殼聚糖溶液，攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；殼聚糖溶液與透明質酸酶的酶液的質量比例為4：1，所述殼聚糖溶液是將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為0.05％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液；
(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(4)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
對照例4
在實施例1的基礎上，將步驟(2)所述殼聚糖溶液調整為將粘度700cps、脫乙酰度95％以上的殼聚糖用體積濃度為1％的乙酸水溶液溶解，配成質量濃度為4％殼聚糖溶液；攪拌均勻后，在室溫下靜置1h；
(3)將TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步驟(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散體系；在4℃條件下靜置1h；所述TPP的用量為殼聚糖質量的8％；所述TPP水溶液為質量濃度為5mg/mL的TPP水溶液；
(4)離心收集固定化酶的顆粒，經真空低溫干燥即可獲得固定化透明質酸酶。
表1
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。