一株環形泰勒蟲裂殖體細胞及裂殖體的培養方法與流程

本發明涉及一種動物寄生蟲細胞及這種動物寄生蟲細胞的培養方法，確切地說本發明涉及一種環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，以及這種細胞的培養方法。

技術背景

環形泰勒蟲屬于泰勒蟲科泰勒蟲屬的一種血液原蟲，是牛熱帶泰勒蟲病的病原。該病在我國北方地區廣泛流行，多呈急性經過，能導致牛的致死性白細胞增殖紊亂，具有較高的發病率和死亡率，給養牛業造成了巨大的經濟損失。

研究表明，牛環形泰勒蟲裂殖體膠凍細胞疫苗對控制該病的流行發揮了重要作用。現有技術中生產疫苗采用的細胞培養方法為靜置或轉瓶培養，這種培養方法所得到的細胞結團嚴重，呈島嶼狀、邊緣不整齊、透光性差、密度及活力低，而且需要大量的犢牛血清，增加了疫苗的生產成本，進而影響了該病免疫預防的大面積推廣應用。

技術實現要素：

本發明提供了一種可克服現有技術不足，能實現環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞高質量、高密度的增殖環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，同時提供一種環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養方法。

本發明的一株環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞株已經于2016年11月2日保藏于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No.C2016187，名稱為：“環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞”。

本發明的一種環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養方法是：

(1)顯微鏡下肉眼觀察，挑選生長狀態良好的環形泰勒蟲裂殖體細胞的種細胞，將種細胞單層鋪滿于無菌的培養器皿內。

(2)在無菌條件下，將步驟⑴中的細胞沿培養器皿的細胞生長面輕輕吹打并混勻，靜置培養96小時后，吸取細胞懸液并補加細胞營養液RPMI-1640至另一個培養器皿內批式傳代培養，其中吸取的細胞懸液與細胞營養液的體積比為1:1.6～1:3.5，培養至細胞倍增率、細胞密度和活率等指標趨于穩定，細胞形態正常時，表明細胞已經適應在懸浮培養條件下生長，細胞馴化成功。

優選地，本發明所述的環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養方法是：懸浮傳代培養至11代，得到細胞馴化成功的懸浮細胞，所用的培養基為購自Hyclone公司的RPMI-1640，培養時在恒溫、旋轉振蕩條件下進行，其培養溫度為37.5℃，每代的培養時間為72～96h。

優選地，本發明所述的環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的培養方法，其懸浮培養的參數為：培養溫度37.5℃、培養器皿的轉速為80～120rpm、每代的培養時間為72～96h，細胞量與培養基間的的體積比為1:2—1:3。

采用本發明制備的環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，形態良好、增殖速度快，與傳統的靜置培養或轉瓶培養方法相比，其在降低生產成本的同時，很大程度地提高了生產效率，而且還可大幅度地提高后期培養細胞的收獲密度和活率。本發明提供的環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養方法，不僅提升了細胞質量和產量，而且降低了培養成本、操作方便、勞動強度低和便于生產，為該病的免疫預防提供了有力的技術支持。

附圖說明

圖1為環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養馴化過程中F14、F20、F25細胞形態照片。

圖2為環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞培養參數優化過程中F30、F35、F41細胞形態照片。

圖3為環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞適應懸浮培養至F41后的細胞培養生長曲線。

圖4為根據細胞分析儀CASY TT對細胞的生長情況，如存活細胞、死亡細胞及細胞碎片的數量進行統計、分析，最終繪制出的細胞大小分布圖。本圖所示的細胞密度為3.59×10⁶cells/mL，活率為92.83％。

具體實施方式

以下結合具體實施過程對本發明進行詳細說明。

一、基本方法

1.材料和方法

1.1所用的細胞為中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈的第14代環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞。

營養液為購自Hyclone公司的RPMI-1640。

新生牛血清購自合格供應商。

1.2儀器和設備恒溫培養振蕩器(上海蘇坤實業有限公司)；細胞分析儀(德國INNOVATIS公司)；移液器(Eppendorf)；倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1靜置培養種細胞及篩選

顯微鏡下肉眼觀察，挑選生長狀態良好，形態一致的第14代環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞，單層鋪滿于無菌方瓶，得到作為懸浮培養的種細胞。

1.3.2環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞的懸浮培養馴化

將中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈的F14代細胞靜置培養96小時后，細胞鋪滿T25方瓶。挑選出生長狀態良好、形態一致，無污染的F14代T25方瓶細胞為懸浮培養的種細胞，將細胞輕輕吹打并混勻，吸取適量細胞懸液，補加適量細胞營養液RPMI-1640至滅菌處理的250mL錐形細胞培養瓶恒溫振蕩培養，其中1份體積的細胞懸液加入1.6～3.5倍體積的培養基，相關試驗表明最佳的比例為1：2～1：3。細胞批式傳代培養后，取樣觀察并檢測細胞密度及活率。當細胞倍增率、細胞密度和活率等指標趨于穩定，細胞形態正常(圓形、邊緣整齊、飽滿透亮、大小均勻、不結團)時，表明細胞已經適應在懸浮培養條件下生長，即細胞馴化成功。

2.結果

細胞由靜置培養轉為懸浮培養后，F14-F15細胞結團較多，團塊大小不一，多呈10個細胞粘連的小團塊，單個細胞形態不均勻、不透亮，細胞懸液中可見裂解的細胞碎片；F15-F17細胞結團較少，多呈3個細胞松散粘連的小團塊，單個細胞呈圓形、透亮；F17-F20細胞多呈單個，2-4個串狀，團塊明顯減少，細胞懸液變得透亮；F20-F25細胞邊緣整齊，飽滿透亮，大小均勻，細胞懸液變得透亮。細胞從F14-F25懸浮培養馴化過程中，細胞團塊明顯減少，單個細胞形態逐漸趨于圓形，飽滿透亮，細胞懸液變得透亮，表明該細胞已經適應在懸浮培養條件下生長，參見表1。

表1細胞懸浮培養馴化過程中密度與活率檢測結果

所述馴化過程中F14、F20、F25細胞形態參見附圖1。附圖1中，左圖為T25方瓶靜置培養環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞F14。鏡下觀察：細胞呈島嶼狀分布、分散不均勻、大小不一、透光性差及死細胞多；中圖為懸浮培養馴化細胞F20。鏡下觀察：細胞圓潤、透亮、分散均勻，細胞間營養液清亮。與靜置培養相比，結團嚴重的現象有所改善，但密度不高，表明細胞增殖仍較慢；右圖懸浮培養馴化細胞F25。鏡下觀察：細胞結團明顯減少，細胞飽滿透亮，邊緣整齊。

二、最佳培養條件

為了摸索細胞生長過程中的關鍵參數(如培養溫度、培養轉速及培養時間)對細胞密度及活力的影響，本發明利用正交試驗進行數據的統計分析，最終確定了環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養的最佳培養條件。試驗中所用材料、培養基及所用儀器設備同上。

試驗方法

1.試驗設計

選用L9(3⁴)正交表進行試驗設計，試驗因素及水平分別為培養溫度(36.5℃、37.0℃、37.5℃)、培養轉速(40rpm、80rpm、120rpm)、培養時間(72h、96h、120h)，最后一列為空白列。

2.細胞培養方法

將馴化的細胞轉移至250mL錐形細胞培養瓶，并補加適量細胞營養液至初始培養密度為0.5×10⁶cells/ml后，恒溫振蕩培養箱懸浮培養，隨后每隔24h取懸浮培養細胞，觀察其形態及生長情況，以活細胞最大密度及活率為指標，從而確定環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養的最佳溫度、轉速及培養時間。

3.結果及分析

3.1結果

表2試驗結果(一)

表3試驗結果(二)

3.2分析

由試驗結果(一)、(二)可知，環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞懸浮培養試驗中發現，培養溫度、培養轉速及培養時間在其懸浮培養過程中起著關鍵的作用。正交試驗結果表明，培養溫度、培養轉速及培養時間分別為37.5℃、120rpm、96h時，細胞密度較高，但活率呈下降趨勢；當培養參數變為37.5℃、80rpm、72h時細胞密度雖不是最高水平，但活率呈上升趨勢，從而確定出三個關鍵參數的最優組合為溫度37.5℃、轉速80-120rpm、培養時間72-96h。

對經上述試驗所得到的F27代產物，送交位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，進行保藏，其保藏號為：CCTCC NO:C2016187，其名稱為：“環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞”。

三、馴化細胞的傳代培養

試驗中所用材料、培養基及所用儀器設備同上。

1方法

吸取適量馴化至F25的細胞懸液，補加適量細胞營養液至初始密度為0.5×10⁶cells/mL,250mL錐形細胞培養瓶懸浮培養。培養參數為溫度37.5℃、轉速80-120rpm、培養時間72-96h。每傳代一次，取樣觀察及檢測細胞生長情況(細胞形態、密度、活率)后，取適量細胞種子并補加適量細胞營養液進行細胞批式傳代培養。當細胞密度及活率均逐漸提高且趨于穩定，細胞形態正常(圓形、邊緣整齊，飽滿透亮，大小均勻)時，表明馴化的細胞在優化的培養條件下可依次連續傳代培養。

2結果

由圖2及表4可知，馴化的細胞在優化的條件下培養，F25-F30細胞團塊明顯減少，細胞邊緣整齊，飽滿透亮；F30-F35細胞呈1-2個花生狀，細胞間營養液清亮；F35-F41細胞呈單個圓形，大小均勻，排列緊密。細胞從F25-F41培養過程中，細胞密度從2.13×10⁶cells/mL增加到4.2×10⁶cells/mL；細胞活率從88.7％上升到93.4％，表明細胞在優化的培養條件下密度及活率逐漸增加、可穩定傳代，而且經本發明優化馴化的細胞其密度及活率還有明顯的上升。

表4培養參數優化過程中細胞密度與活率檢測結果

通過細胞培養生長曲線(圖3)，可見懸浮培養至F41后，細胞培養生長曲線。文獻記載，環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞培養至96h后，活率明顯下降。本實驗在細胞培養的0、24、48、72、96、120、144h分別取樣，利用細胞分析儀CASY TT檢測細胞密度及活率。根據檢測結果繪制的細胞培養生長曲線表明，細胞培養至96h后，密度從3.43×10⁶cells/mL降至2.4×10⁶cells/mL；活率從93.18％降至88.5％，實驗結果與文獻記載一致。

圖4為根據細胞分析儀CASY TT對細胞的生長情況，如存活細胞、死亡細胞及細胞碎片的數量進行統計、分析，最終繪制出細胞大小分布圖。其工作原理為：死細胞具有一個可滲透的細胞膜，它允許等滲緩沖溶液CASYton進入。因此，死細胞內的細胞質同胞外的等滲緩沖液具有相同的電導率，可以被電極所忽略，所測得的僅僅是緊密結構的細胞核的體積。而活細胞擁有完整的細胞膜，CASY技術分析的是全細胞的體積。利用兩者的相對差異即可區分活細胞與死細胞。如圖所示①在以虛線表示的光標左側(≤6.3μm)為細胞碎片峰。②在左側的標準光標和以實線表示的賦值光標(6.3μm to 9.1μm)之間出現的是死細胞峰。死細胞的細胞膜不完整，不能屏蔽電脈沖，因此圖像表現的死細胞的大小實際是細胞核的大小。③在賦值光標的右側是活細胞峰和細胞團塊峰。由圖可知，活細胞及細胞團塊峰的峰形陡峭，表明細胞大小均勻，且大部分細胞直徑在11.00μm左右；死細胞峰低，但仍存在較多的細胞碎片。本圖所示的細胞密度為3.59×10⁶cells/mL，活率為92.83％。