一種酸性高比活木聚糖酶XYN11A及其基因和應用的制作方法

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種酸性木聚糖酶XYN11A及其基因和應用。

背景技術：

纖維素、半纖維素和木質素等是植物細胞壁的主要組成成分。半纖維素包括木聚糖，甘露聚糖，半乳聚糖等等，完全降解半纖維素舉要多種酶的協同作用，其中木聚糖酶是一種切割β-1,4-糖苷鍵的主要酶類，在食品，飼料和紙漿工業等方面有廣闊的應用前景。

在啤酒釀造過程中，麥芽中的木聚糖造成啤酒過濾困難、堵塞過濾膜，增加了啤酒的生產成本和品質，采用酸性木聚糖酶和木聚糖酶協同作用，可以解決以上問題。在飼料制粒時，熱穩定性優良的木聚糖酶可以較少的損失酶活，并在進食過程中輔助消化提高營養。而在紙漿漂白時，木聚糖酶可以替代部分有機氯化物，從而減少環境污染。

由于不同工業對木聚糖酶性質需求不同，因此，獲得新型具有優良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種能高效應用的酸性木聚糖酶。

本發明的再一目的是提供編碼上述酸性木聚糖酶的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明的另一目的是提供一種制備上述酸性木聚糖酶的基因工程方法。

本發明的另一目的提供上述酸性木聚糖酶的應用。

本發明從青霉Penicillium sp.L1中分離得到一種新的酸性木聚糖酶XYN11A。

本發明提供了一種酸性木聚糖酶XYN11A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

MSLFKSLFVVSAAILGANALPGDYHKRQTITSSETGTSNGYYYSFWTNGGGTVDYTNGDGGEYSVSWEDCGDFTSGKGWATGSDRDITFSGSFNPSGNAYLSVYGWTTSPLVEYYILENYGDYNPGSSMTYKGTVTSDGSVYEIYEHQQVDQPSVSGTATFNQYWSIRQDTRSSGTVTTANHFDAWASLGMDLGTTFNYQIVSTEGYESSGSSTITVS其中，該酶基因編碼218個氨基酸，N端19個氨基酸為其的信號肽序列“MSLFKSLFVVSAAILGANA”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的酸性木聚糖酶Xyn11A的理論分子量為21.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

LPGDYHKRQTITSSETGTSNGYYYSFWTNGGGTVDYTNGDGGEYSVSWEDCGDFTSGKGWATGSDRDITFSGSFNPSGNAYLSVYGWTTSPLVEYYILENYGDYNPGSSMTYKGTVTSDGSVYEIYEHQQVDQPSVSGTATFNQYWSIRQDTRSSGTVTTANHFDAWASLGMDLGTTFNYQIVSTEGYESSGSSTITVS

本發明的木聚糖酶Xyn11A同時具有好的pH穩定性，并且常溫下在pH2.0-5.0酸性范圍內均具有高活性，其最適pH值為3.5，在pH1.5～8.0的范圍內維持穩定；最適溫度為50℃。

本發明提供了編碼上述酸性木聚糖酶XYN11A。具體地，該基因的基因組序列如SEQ ID NO.4所示：

ATGTCCCTTTTCAAGAGCTTATTCGTGGTTTCTGCTGCCATCCTAGGGGCCAATGCGCTTCCTGGTGATTACCACAAGCGGCAAACTATCACCTCTAGCGAAACCGGGACGAGCAATGGCTACTATTATTCGTTCTGGACCAACGGGGGTGGCACAGTGGATTATACAAACGGCGATGGAGGTGAATACAGCGTCAGCTGGGAAGACTGTGGTGATTTCACATCCGGAAAAGGCTGGGCAACTGGAAGTGACCGGGATATCACCTTTTCCGGGTCTTTCAATCCTTCTGGAAACGCCTATCTTTCCGTCTACGGCTGGACTACGAGCCCACTCGTTGAGTACTATATCCTCGAGAATTATGGCGATTATAACCCTGGCAGCTCGATGACGTACAAGGGAACGGTGACCAGCGACGGATCTGTCTATGAGATCTACGAGCACCAGCAGGTTGATCAGCCCTCTGTGTCTGGCACTGCTACTTTCAACCAATACTGGTCCATTCGACAGGATACCCGCTCAAGCGGTACCGTGACCACTGCTAATCATTTCGATGCTTGGGCTTCCCTTGGAATGGATCTAGGAACCACCTTCAACTATCAGATAGTATCTACTGAGGGATATGAGAGCAGTGGATCCTCAACAATCACAGTTTCATGA

本發明通過PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因xyn11A，DNA全序列分析結果表明，木聚糖酶XYN11A結構基因xyn11A全長657bp。其中，信號肽的堿基序列為：

ATGTCCCTTTTCAAGAGCTTATTCGTGGTTTCTGCTGCCATCCTAGGGGCCAATGCG(SEQ ID NO.6)。

成熟的木聚糖酶XYN11A的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

CTTCCTGGTGATTACCACAAGCGGCAAACTATCACCTCTAGCGAAACCGGGACGAGCAATGGCTACTATTATTCGTTCTGGACCAACGGGGGTGGCACAGTGGATTATACAAACGGCGATGGAGGTGAATACAGCGTCAGCTGGGAAGACTGTGGTGATTTCACATCCGGAAAAGGCTGGGCAACTGGAAGTGACCGGGATATCACCTTTTCCGGGTCTTTCAATCCTTCTGGAAACGCCTATCTTTCCGTCTACGGCTGGACTACGAGCCCACTCGTTGAGTACTATATCCTCGAGAATTATGGCGATTATAACCCTGGCAGCTCGATGACGTACAAGGGAACGGTGACCAGCGACGGATCTGTCTATGAGATCTACGAGCACCAGCAGGTTGATCAGCCCTCTGTGTCTGGCACTGCTACTTTCAACCAATACTGGTCCATTCGACAGGATACCCGCTCAAGCGGTACCGTGACCACTGCTAATCATTTCGATGCTTGGGCTTCCCTTGGAATGGATCTAGGAACCACCTTCAACTATCAGATAGTATCTACTGAGGGATATGAGAGCAGTGGATCCTCAACAATCACAGTTTCATGA

成熟蛋白理論分子量為21.7kDa，本發明的木聚糖酶與來源于Penicillium sp.40的木聚糖酶(xylanase A)的性質有很大的差異，與Penicillium sp.40來源的的木聚糖酶xylanase A相比較，本發明的木聚糖酶XYN11A有更好的pH穩定性和熱穩定性，且其比活性是xylanase A的5倍，XYN11A更適于在飼料、食品等領域應用，且成本低廉。

本發明還提供了包含上述酸性木聚糖酶基因XYN11A的重組載體，優選為pPIC-xyn11A。將本發明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將本發明的木聚糖酶基因插入到質粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOX1啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒pPIC9-xyn11A。

本發明還提供了包含上述酸性木聚糖酶基因xyn11A的重組菌株，優選所述菌株為酵母菌，優選為重組菌株GS115/xyn11A。

本發明還提供了一種制備酸性木聚糖酶XYN11A的方法，包括以下步驟：

1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；以及

3)回收并純化所表達的木聚糖酶XYN11A。

其中，優選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(Pichia pastoris)GS115，得到重組菌株GS115/xyn11A。

本發明還提供了上述酸性木聚糖酶XYN11A的應用。

本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優良的、適合于在飼料、釀酒、食品工業中應用新的木聚糖酶。本發明的木聚糖酶最適pH為3.5，在pH2.0～5.0都有較高的酶活性；pH穩定性好；并且具有較高木聚糖酶活性。本發明的木聚糖酶可應用于飼料工業，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗營養作用。在釀酒工業中，可有效降解木聚糖，有效降低麥芽汁的粘度提高過濾效率澄清啤酒。該酶還可以在木質纖維材料降解中，輔助纖維素酶進行進一步地降解。因此，本木聚糖酶在能源工業中的應用也顯示出其巨大的潛力。

附圖說明

圖1重組木聚糖酶的最適pH。

圖2重組木聚糖酶的pH穩定性。

圖3重組木聚糖酶的最適溫度。

圖4重組木聚糖酶的熱穩定性。

具體實施方式

試驗材料和試劑

1、菌株及載體：本發明從青霉Penicillium sp.L1中分離得到一種新的酸性木聚糖酶Xyn11A。畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。

2、酶類及其它生化試劑：內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。櫸木木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。

3、培養基：

(1)青霉Penicillium sp.L1培養基為馬鈴薯汁培養基：1000mL馬鈴薯汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH5.0。

(2)大腸桿菌培養基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

(3)BMGY培養基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培養基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均與BMGY相同，pH4.0。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。

實施例1青霉Penicillium sp.L1木聚糖酶編碼基因XYN11A的克隆

提取青霉Penicillium sp.L1基因組DNA。

設計引物P1和P2進行PCR擴增，

P1:CGGAATTCCTTCCTGGTGATTACCACAAGCGG

P2:ATTTGCGGCCGCTCATGAAACTGTGATTGTTGAGGATCCAC

回收、測序獲得序列如SEQ ID NO.4所示的酸性木聚糖酶XYN11A。

實施例2重組木聚糖酶的制備

將表達載體pPIC9進行雙酶切(EcoR I+Not I)，同時將編碼木聚糖酶的基因xyn11A雙酶切(EcoR I+Not I)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體pPIC9連接，獲得含有青霉Penicillium sp.L1木聚糖酶基因xyn11A的重組質粒pPIC-xyn11A并轉化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/xyn11A。

以同樣的方法構建含有信號肽序列的木聚糖酶基因的重組表達載體，并轉化畢赤酵母菌株。

取含有重組質粒的GS115菌株，接種于300mL BMGY培養液中，30℃250rpm振蕩培養48h后，離心收集菌體。然后于150mL BMMY培養基重懸，30℃250rpm振蕩培養。誘導72h后，離心收集上清。測定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達量為809.9U/mL。SDS-PAGE結果表明，重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達。重組木聚糖的比活為4286U/mg。

實施例4重組木聚糖酶的活性分析

DNS法：具體方法如下：在pH3.5，50℃條件下，1mL的反應體系包括100μL適當的稀釋酶液，900μL底物，反應10min，加入1.5mL DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm測定OD值。1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出1μmol還原糖所需要的酶量。

1、重組木聚糖酶XYN11A的最適pH和pH穩定性的測定方法如下：

將實施例3純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中50℃下進行木聚糖酶活力測定。結果(圖1)表明，重組酶XYN11A的最適pH為3.5，在pH2.0～5.0有60％以上的相對酶活性。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中37℃處理60min，再在pH3.5緩沖液體系中50℃下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結果(圖2)表明木聚糖酶在pH 1.5-8.0之間均很穩定，在此pH范圍內處理60min后剩余酶活性在80％左右，這說明此酶在酸性和中性范圍內具有較好的pH穩定性。雖然與來源于Penicilliumsp.40的木聚糖酶(xylanase A)氨基酸序列一致性為86％，但是兩者的最適pH值不同，xylanase A為2.0，而XYN11A為3.5，XYN11A有更寬的pH作用范圍，XYN11ApH穩定性優于xylanase A。

2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下：

木聚糖酶的最適溫度的測定為在pH3.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液緩沖液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在50℃下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖3)表明其最適溫度為50℃。酶的熱穩定性性試驗表明(圖4)，XYN11A有良好的熱穩定性，在40℃下溫育1h，能保持90％以上的酶活。在熱穩定性方面，XYN11A也顯著優于xylanase A的30℃穩定。

3、木聚糖酶的K_m值測定方法如下：

用不同濃度的木聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH3.5)緩沖液體系中，50℃下測定酶活性，計算出其K_m值。經測定，以木聚糖為底物時的K_m值為3.3mg/mL，最大反應速度V_max為6000μmol/min·mg。

4、不同金屬離子化學試劑對XYN11A酶活的影響測定如下：

在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響，各種物質終濃度為5mmol/L。在50℃、pH4.0條件下測定酶活性。結果表明，部分離子和化學試劑在濃度為5mmol時重組木聚糖酶的活力沒有明顯變化。但是Fe³⁺可以抑制其將近一半活力，而Pb²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺可以抑制近20％的活性，而SDS可強烈抑制其活力僅剩余30％。而Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、EDTA、K⁺可以部分激活XYN11A酶活力。

5、重組木聚糖酶的底物特異性

該酶可高效降解櫸木木聚糖，燕麥木聚糖，樺木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖。

<110> 北京盛拓達生物技術有限公司

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tactattatt cgttctggac caacgggggt ggcacagtgg attatacaaa cggcgatgga 180

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