本發明涉及一種合成1-苯基乙醇的生物學方法，屬于香精香料領域。
背景技術：
：除了趨避植食性昆蟲，吸引天敵和傳粉昆蟲，植物間信號傳導之外，植物香氣還有著潛在的經濟利用價值，例如延長食品貯藏時間，提高食物的風味，鎮靜，提高記憶力等。越來越多的研究表明植物香氣對人類的健康有貢獻，同時某些植物香氣為新藥的開發提供了線索。基于以上的功能，植物香氣的合成和純化受到越來越多的關注。傳統的從植物中提取香氣物質的方法耗時長，花費大并且得率低。因此，開發新的、安全高效的植物香氣合成方法勢在必行。1-苯基乙醇是香水工業的原料，同時也是某些藥物合成的中間體。在茶樹花中，1-苯基乙醇是主要的香氣物質。目前茶樹多采取無性繁殖。和具有高附加值的茶葉相比而言，茶樹花是一種“廢棄”資源。從茶樹花中直接提取1-苯基乙醇也存在著耗時長，花費大并且產量低的劣勢。我們發現茶樹花中含有某些酶能夠高效的將苯乙酮轉化為1-苯基乙醇。利用植物來源的酶合成植物香氣具有高效、環保、合成迅速等優點。苯乙酮是一種價格非常低廉的工業原料。建立利用茶樹花酶將苯乙酮轉化為1-苯基乙醇的方法能夠實現1-苯基乙醇的經濟、高效、綠色合成。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用茶樹花的酶合成1-苯基乙醇的方法，利用該方法可以實現1-苯基乙醇的高效、安全、綠色合成。一種利用茶樹花的酶合成1-苯基乙醇的方法，包括以下步驟：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備：將聚乙烯吡咯烷酮和3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽加入茶樹花中；用pH值為7的磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿，緩沖液中同時含有1%的甘油，1mMEDTA；勻漿產物在4℃下離心15-20分鐘；離心之后的上清液通過PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油、0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫，緩沖液的濃度為10mM,pH值為7，得到1-苯基乙醇合成酶粗酶；（2）1-苯基乙醇的合成：底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇；反應所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液；反應液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。在上述方法中，作為優選的：步驟（2）的反應溫度為55℃，合成pH為4.5-5.3，反應時間為100分鐘。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：1.1-苯基乙醇合成酶為植物來源，安全環保；2.1-苯基乙醇合成酶粗酶的提取方法簡單；3.本合成方法的轉化效率高，綠色無污染；4.本合成方法實現了廢棄資源的合理利用，提高了茶樹花的產業附加值。具體實施方式：以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備將0.3克聚乙烯吡咯烷酮和20毫克3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽加入1克茶樹花中。此混合物用10毫升pH值為7的100mM磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿。緩沖液中同時含有1%的甘油，1mM乙二胺四乙酸。勻漿產物在4℃，26740離心力的條件下離心15-20分鐘。離心之后的上清液通過PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油，0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫。緩沖液的濃度為10mM,pH值為7。此方法制備的蛋白為1-苯基乙醇合成酶粗酶。（2）1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反應所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液。反應液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反應溫度為55℃，反應pH值為4.5，反應時間為100分鐘。實施例2：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備將3克聚乙烯吡咯烷酮和0.2克3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽加入10克茶樹花中。此混合物用100毫升pH值為7的100mM磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿。緩沖液中同時含有1%的甘油，1mM乙二胺四乙酸EDTA。勻漿產物在4℃，26740離心力的條件下離心15-20分鐘。離心之后的上清液通過PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油，0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫。緩沖液的濃度為10mM,pH值為7。此方法制備的蛋白為1-苯基乙醇合成酶粗酶。（2）1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反應所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液。反應液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反應溫度為55℃，反應pH值為5.0，反應時間為100分鐘。實施例3：（1）1-苯基乙醇合成酶粗酶的制備將1.5克聚乙烯吡咯烷酮PVPP和0.1克3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽加入5克茶樹花中。此混合物用50毫升pH值為7的100mM磷酸鉀緩沖液在冰上充分勻漿。緩沖液中同時含有1%的甘油，1mM乙二胺四乙酸EDTA。勻漿產物在4℃，26740離心力的條件下離心15-20分鐘。離心之后的上清液通過PD-10脫鹽柱將目的蛋白用含有0.1%甘油，0.1mMEDTA的磷酸鉀緩沖液洗脫。緩沖液的濃度為10mM,pH值為7。此方法制備的蛋白為1-苯基乙醇合成酶粗酶。（2）1-苯基乙醇的合成底物苯乙酮在1-苯基乙醇合成酶粗酶的催化下生成1-苯基乙醇。反應所使用的緩沖液為100mM磷酸鉀緩沖液。反應液中包含1.25mM的苯乙酮，3.75mM的輔酶NADPH和0.1μg/μl的酶。反應溫度為55℃，反應pH值為5.3，反應時間為100分鐘。以上三個實施例條件均能高效催化苯乙酮生成1-苯基乙醇。苯乙酮生成1-苯基乙醇的轉化率約為40%。目前1-苯基乙醇的合成多采用化學合成的方法。化學合成污染大，且有反應副產物產生。通過酶催化的反應能夠穩定，單一的形成特定的產物。而植物中含有大量可催化形成香氣物質的酶。基于以上理論，我們首次發明了利用源自茶樹花的酶高效合成1-苯基乙醇的方法。我們首先通過響應面分析初步確定了茶樹花酶提取緩沖液的最佳pH值、反應pH值、反應溫度、反應時間、NADPH濃度、苯乙酮濃度。接下來通過對不同反應溫度，不同反應pH的篩選，最終確定了最優化的利用茶樹花酶以苯乙酮為底物生成1-苯基乙醇的條件。通過對生成的1-苯基乙醇進行含量測定發現，本發明三個實施例催化苯乙酮生成1-苯基乙醇的效率均比較高。說明在本發明中利用茶樹花酶合成1-苯基乙醇的方法得到了優化，合成1-苯基乙醇的反應高效穩定。此方法對環境友好，符合可持續發展的戰略方針。表1.三個實施例的1-苯基乙醇相對產量比較1-苯基乙醇相對產量※實施例16.44實施例26.08實施例36.49※1-苯基乙醇的相對產量通過GC-MS進行測定，為1-苯基乙醇和內標葵酸乙酯的峰面積比值。當前第1頁1 2 3