一種新城疫病毒樣顆粒、制備方法及其應用與流程

本發明屬于新城疫疫苗技術領域，具體涉及一種新城疫病毒樣顆粒、制備方法及其應用的專利申請。

背景技術：

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽類為主的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，被OIE列為必報動物疫病，也是我國中長期規劃五大優先防治的動物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒學分類中屬于副黏病毒科、禽副黏病毒屬的一個種，即禽副黏病毒1型，是一種不分節段的單分子負鏈RNA病毒。

新城疫病毒基因組結構模式為3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次編碼六種結構蛋白：核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基質蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F）、血凝素-神經氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒顆粒為有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直徑約為120nm~300nm，囊膜表面覆蓋有8nm長的纖突，病毒粒子內部為一直徑17nm左右的卷曲核衣殼。基質蛋白M位于囊膜和核衣殼之間，既與膜結合又與核衣殼結合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驅動力。

病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs）是由某種病毒的一個或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的空心蛋白顆粒，不含病毒核酸，無法自主復制，不存在基因重組或重配和毒力回復的可能，安全性高，在形態上與天然病毒顆粒相似，能夠通過與病毒感染一樣的途徑，以接近真實構象的形式遞呈給免疫細胞，更容易被機體免疫系統識別，從而有效誘導機體產生免疫保護反應。

病毒樣顆粒的制備可基于大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲桿狀病毒這四種表達系統，而利用昆蟲桿狀病毒表達系統制備的病毒樣顆粒種類已占到了30%以上，其主要原因在于該系統具有不同于其他表達系統的獨特優點：（1）承載量大：桿狀病毒可容納較大的外源DNA插入(約l0kb)而不影響病毒的復制與裝配；(2)高效表達：多角體基因和p10基因有非常強大的啟動子能驅動靶基因的高水平表達，外源基因表達量往往是其他系統的幾十到幾百倍；(3)表達產物后加工較完善：昆蟲細胞對蛋白質的后加工系統與哺乳動物細胞接近，具有表達產物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信號膚和形成三級或四級高級結構的特點，所以在結構、生物活性、抗原性和免疫性等方面與天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表達載體或借幾個不同重組病毒共感染，可以同時表達兩個或多個外源蛋白，便于研究肽鏈的裝配和蛋白寡聚體的結構和功能；(5)適合表達細胞毒性蛋白：應用晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因，即使表達產物是細胞毒性蛋白，也不影響表達水平，因為在這些有毒產物表達之前，病毒已經完成復制并釋放出大量成熟的子代毒粒，不會干擾病毒的復制；(6)安全性好，桿狀病毒是昆蟲或者節肢動物病毒，對人畜無害，外源基因插入多角體蛋白基因位點引起其缺失或失活，因此重組病毒不能產生包涵體，這不僅為重組病毒提供了選擇標記，而且重組病毒無多角體蛋白形成，失去了病毒粒子的天然防護物一多角體蛋白結晶體，極易在自然環境中失活，不能像野生病毒那樣在環境中長期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)桿狀病毒表達載體通用性廣，能用于表達來自病毒、細菌、真菌、植物和動物幾乎所有蛋白，并且能表達帶有內含子的外源基因。因此，用該系統生產病毒樣顆粒容易形成產業化。

雞新城疫自1946年在我國首次報道至今已在中國存在60多年，表現出一定新的臨床及流行特點。流行病學數據充分證明基因VII型已經成為我國NDV流行的主要優勢基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散發，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趨勢。與此同時，NDV經過世界范圍內四次大流行后，其宿主范圍也不斷擴大，迄今能自然或人工感染的禽類已超過250多種。過去認為，NDV一般不對鴨、鵝等水禽有致病性，而近十幾年，在鴨群、鵝群中常見新城疫的暴發與流行。大量流行病學調查數據顯示，當前我國NDV的優勢流行株屬于基因VII型，而目前國內普遍使用的疫苗LaSota為基因II型，雖然它們同屬一個血清型，但在遺傳距離上相差較遠，對當前NDV強株的攻擊并不能提供理想的免疫保護效力。

目前常用的生產活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、Hitchner B1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗為中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力較弱。弱毒苗可通過大規模飲水、噴霧和氣霧進行免疫，進而刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以從免疫禽傳播給未免疫禽。其不足之處在于污染環境，并且有毒力返強可能，在機體抵抗力下降時，可能引起發病。生產滅活苗的毒種一般包括LaSota、Ulster等，實際生產中多用來制造二聯或多聯疫苗。滅活苗產生抗體水平較高，持續時間較長，比較容易儲存，受母源抗體影響小，免疫不良反應小；但滅活苗免疫時需要較大劑量，所以成本較高。

目前，對于新城疫疫情通常采取封鎖疫點、全群撲殺，并消毒直到最后一例病例處理完畢后14天內無新病例為止，因此疫苗免疫成為預防該病的主要手段之一。鑒于新城疫的流行對我國整個養禽業造成的巨大的經濟損失，研制新的預防疫苗仍然具有十分重要的應用意義。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種新城疫病毒樣顆粒及其制備方法，從而為新的新城疫疫苗的制備奠定基礎。

本發明所采取的技術方案詳述如下。

一種新城疫病毒樣顆粒，為由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行組裝形成的空心化結構的蛋白顆粒；其中M蛋白對應的M1基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白對應的F1基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白對應的NP1基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白對應的HN1基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

所述新城疫病毒樣顆粒作為預防禽新城疫病毒感染滅活疫苗的應用。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：

（1）人工合成并PCR擴增各結構蛋白基因序列，即分別人工擴增序列表中SEQ ID NO.1~4所示的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的堿基序列；

（2）構建表達新城疫病毒結構蛋白的重組桿狀病毒，具體為，

將步驟（1）中的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分別克隆至轉移載體pFastBac1中，獲得重組質粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1；

將重組質粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1分別轉化Escherichia coli DH10 Bac 感受態細胞，篩選獲得重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1；

利用脂質體介導轉染法，將重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1分別轉染宿主Sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

（3）新城疫病毒樣顆粒的制備和純化，具體為，

將重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1共接種感染宿主Sf9昆蟲細胞，四種結構蛋白在表達并自行組裝后，所形成的病毒樣顆粒會分泌到細胞培養上清中，在初步離心去除細胞碎片后，進行切向流濃縮，再經分子篩過濾和陰離子交換層析后得到純化的病毒樣顆粒。

需要說明的是，上述宿主Sf9昆蟲細胞，也可為昆蟲Sf21細胞株或昆蟲High Five細胞株。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，步驟（3）中，重組桿狀病毒共接種感染宿主Sf9昆蟲細胞時，含有重組桿病毒的溶液體積比為：rBV-M1：rBV-F1：rBV-NP1：rBV-HN1=3:2:1:2。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，步驟（3）中，切向流濃縮操作時，采用50kDa分子量截留的切向流濃縮管在3500r/min水平離心15分鐘。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，步驟（3）中，提純操作時，采用不連續的20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心方法，替代分子篩過濾和陰離子交換層析操作。

本發明的設計思路為：將新城疫病毒四種結構蛋白基因序列克隆、重組至昆蟲桿狀病毒基因組中，分別得到四種能夠表達新城疫病毒結構蛋白的重組桿狀病毒，將四種重組桿狀病毒經條件優化后，按一定比例共感染昆蟲Sf9細胞，重組桿狀病毒高效表達四種新城疫結構蛋白并形成完整的病毒樣顆粒，收集細胞培養上清經純化后獲得大量新城疫病毒樣顆粒。

總體而言，本發明的主要技術優勢體現在如下幾個方面：

1、病毒樣顆粒自行組裝，免疫原性與真實病毒粒子更為接近，本發明將四種新城疫病毒結構蛋白組合表達，表達后，這四種結構蛋白自行組裝形成了新城疫病毒樣顆粒，由于為自組裝形成，因而所提供的病毒樣顆粒在形態結構和免疫原性方面更加接近真實病毒粒子；

2、病毒樣顆粒的產量和純度較高，經表達和純化條件優化后，新城疫病毒樣顆粒的產量和純度均有較大提升，具有較好產業化應用前景；

3、具有較好免疫效果，利用本發明所提供的新城疫病毒樣顆粒所制備的滅活疫苗，在免疫雞后可誘導機體產生特異性免疫反應，具有較好免疫效果。

附圖說明

圖1為四種重組桿粒的特異性引物PCR鑒定圖譜；其中M：5000bp DNA Marker；1：重組桿粒rBacmid-M1采用M1上游引物/M1下游引物的PCR結果，片段大小約為1100bp；2：重組桿粒rBacmid-F1采用F1上游引物/F1下游引物的PCR結果，片段大小約為1700bp；3：重組桿粒rBacmid-NP1采用NP1上游引物/NP1下游引物的PCR結果，片段大小約為1500bp；4：重組桿粒rBacmid-HN1采用HN1上游引物/HN1下游引物的PCR結果，片段大小約為1700bp；

圖2為四種重組桿粒的通用引物M13上游引物/M13下游引物PCR鑒定圖譜；其中M：5000bp DNA Marker；1：重組桿粒rBacmid-M1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結果，片段大小約為3400bp；2：重組桿粒rBacmid-F1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結果，片段大小約為4000bp；3：重組桿粒rBacmid-NP1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結果，片段大小約為3800bp；4：重組桿粒rBacmid-HN1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結果，片段大小約為4000bp；

圖3為正常Sf9細胞與重組桿粒轉染后出現病變的Sf9細胞示意圖，其中（a）正常Sf9細胞，（b）重組桿粒轉染后出現病變的Sf9細胞；

圖4為新城疫病毒樣顆粒的透射電鏡圖；

圖5為新城疫病毒樣顆粒免疫雞群后的血凝抑制抗體效價規律圖；

圖6為新城疫病毒樣顆粒免疫雞群后的免疫保護試驗結果圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分生物材料、實驗試劑、實驗設備等情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

pFastBac1質粒、sf9昆蟲細胞、DH10Bac感受肽細胞、DH5α感受態細胞等均為Thermo公司產品；

T載體，購自大連寶生物有限公司；

實驗試劑：

Taq聚合酶，購自北京全式金公司；

脂質體轉染試劑，為Roche公司產品；

質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，購自康寧公司；

昆蟲無血清培養基SFM-II，為Thermo公司產品；

實驗設備：

實驗過程中所用超純水由超純水發生裝置（Christ Spetron Line）制備；

低溫臺式高速離心機，美國ICE公司產品；

PCR儀，Thermo Fisher Scientific公司產品；

紫外凝膠成像儀，Alpha Innotech Corporation公司產品；

切向流設備、陰離子交換設備為德國賽多利斯公司產品。

還需說明的是，文本簡要期間，下述實施例中未具體描述操作，參考現有技術及相關產品說明書進行操作即可，不再贅述。

實施例1

本發明所提供的新城疫病毒樣顆粒，為由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行組裝形成的空心化結構的蛋白顆粒；其中M蛋白對應的M1基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，F蛋白對應的F1基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白對應的NP1基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白對應的HN1基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

需要解釋的是，制備新城疫病毒樣顆粒時，由于一般采用的為基因工程的方法，即通過基因工程技術將特定基因序列整合進宿主細胞的基因組中，并進而在宿主細胞中得以表達，最后通過特定的分離、提純技術獲得純化的蛋白顆粒樣品。為使相應基因序列能夠與宿主細胞更好的結合，發明人參考新城疫病毒強毒株NA-1株的全基因組序列（GenBank登錄號：DQ659677），根據相應基因序列設計了特異性引物，并進行了PCR擴增，在保證堿基序列遺傳信息不發生根本性改變的基礎上，對相關基因序列進行了優化，最終獲得了SEQ ID NO.1~4所示的堿基序列。

實施例2

本實施例就新城疫病毒樣顆粒制備過程中關鍵的表達新城疫病毒結構蛋白的重組桿狀病毒的構建過程簡要介紹如下。

（1）擴增各結構蛋白基因序列

根據實施例1中SEQ ID NO.1~4所示的目的堿基序列，參考現有技術，通過聚合酶鏈式反應（PCR法）人工擴增獲得M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的堿基序列。

PCR擴增用引物序列具體為：

M1上游引物：5’-ATGGACTCATCTAGGACTATTGGACT-3’，

M1下游引物：5’-TTATTTACGGAAGGGGTTGTATTTAGC-3’；

F1上游引物：5’-ATGGGTTCGAAGCCATCCACCCG-3’，

F1下游引物：5’-TTAGGCTCTCGTTGTAGCCCT-3’；

NP1上游引物：5’-ATGTCCAGCGTCTTCGACG-3’，

NP1下游引物：5’-TTAGTAACCCCAGTCAGTATCGTTGT-3’；

HN1上游引物：5’-ATGGACCGCGCCGTGAA-3’，

HN1下游引物：5’-TTACACTCTATCGTCCTTCAGAATCT-3’；

PCR擴增時，反應程序為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分鐘30秒，共30個循環；最后72℃再延伸10分鐘。

對PCR擴增產物進行1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收擴增產物備用。

（2）構建穿梭質粒

按照現有技術，將步驟（1）中克隆獲得的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分別克隆至T載體（pMD19T Simple vector）中，轉化后測序驗證，獲得構建正確的重組克隆質粒pT-M1、pT-F1、pT-NP1和pT-HN1。

對上述所獲得的重組質粒分別進行酶切（SalI和NotI雙酶切），同時對pFastBac1質粒進行酶切，對酶切產物進行電泳檢測，并回收酶切產物。

酶切過程中，10μL酶切體系設計如下：

Buffer，4μL；

SalI，0.5μL；

NotI，0.5μL；

重組質粒（或pFastBac1質粒），1μL；

ddH₂O，4μL；

37℃酶切3h。

利用 T4 DNA連接酶將上述重組質粒的酶切產物與pFastBac1質粒的酶切產物進行連接，20μL連接體系設計如下：

重組質粒酶切產物，4μL；

pFastBac1載體酶切產物，1μL；

Buffer，4μL；

T4 DNA連接酶，1μL；

ddH₂O，10μL；

16℃連接過夜。

將連接產物轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞中，用含有特定抗生素的（氨芐青霉素終濃度100μg/mL，慶大霉素終濃度100μg/mL）選擇培養基篩選陽性菌落。

對所篩選的陽性菌落經擴增后提取質粒，采用酶切驗證及PCR鑒定，以檢測M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因是否正確重組至pFastBac1載體中，經鑒定正確的質粒，即可認為穿梭質粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1構建成功。

（3）構建重組桿粒

將步驟（2）中鑒定正確的重組質粒轉化至Escherichia coli DH10 Bac 感受態細胞中，使其進行同源重組，經含有三抗（卡那霉素終濃度100μg/mL、慶大霉素終濃度50μg/mL、四環素終濃度70μg/mL）的IPTG條件篩選培養基（IPTG終濃度24mg/mL，X-gal終濃度20mg/mL，該篩選培養基可通過菌落形成顏色判定是否發生同源重組，白色菌落即代表重組成功，藍色菌落則未成功）培養篩選48h，挑取白斑，獲得重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-HN1、rBacmid-NP1；

對所提取的重組桿粒進一步進行PCR鑒定，以確定重組桿粒構建正確（具體鑒定過程，按Invitrogen公司Bac-to-Bac? Baculovirus Expression System（試劑盒）操作說明書進行），PCR鑒定時，鑒定用步驟（1）中的特異性引物。

PCR鑒定時，反應程序為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分鐘30秒，共30個循環；最后72℃再延伸10分鐘。

對PCR擴增產物進行1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示。對圖1分析可以看出，M1片段大小約為1100bp，F1片段大小約為 1700bp，NP1片段大小約為1500bp， HN1片段大小約為1700bp，結果與預期相符，即M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因片段正確重組進入桿粒中，也即重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-HN1、rBacmid-NP1構建正確。

（4）構建重組桿狀病毒

利用脂質體介導轉染法（利用按Roche公司的X-tremeGENE HP DNA transfection Reagent進行轉染），將步驟（3）中構建正確的重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1，分別轉染宿主Sf9昆蟲細胞，具體過程如下：

將轉染試劑恢復室溫，吸取4μL轉染試劑與2μL重組桿粒（用無血清Grace將重組桿粒稀釋至2μg/100μL）輕輕混合，室溫孵育30min；

然后將混合物加入已準備好的sf9細胞六孔板中；

28℃培養96小時，待細胞病變（如圖3所示）后，收集細胞上清液即為第一代重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

接著繼續將第一代重組桿狀病毒接種昆蟲Sf9細胞，同樣培養條件下，收集第二代重組桿狀病毒；

以此類推，收集至第四代重組桿狀病毒。

為便于檢測分析，可將每一代重組桿狀病毒于-80℃保存備用。

培養過程中，根據情況對培養物進行PCR鑒定，以檢測含有M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因片段的重組桿狀病毒是否完整和正確，鑒定時設計一對通用性引物序列具體如下：

M13上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，

M13下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；

PCR鑒定時，反應程序為：94℃預變性5分鐘；94℃變性45秒、55℃退火40秒、72℃延伸4分鐘，共30個循環；72℃再延伸10分鐘。

對PCR擴增產物進行1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示。對圖2分析可以看出，含有M1基因片段的基因組大小約為3400bp；含有F1基因片段的基因組大小約為4000bp；含有NP1基因片段的基因組片段大小約為3800bp；含有HN1基因片段的基因組片段大小約為4000bp，結果與預期符合，及重組桿狀病毒結構完整、有效，可以進一步應用。

實施例3

本實施例就新城疫病毒樣顆粒中結構蛋白的表達、組裝及純化過程簡要介紹如下。

（1）新城疫病毒樣顆粒中結構蛋白的表達

將實施例2中所收集的含有第四代重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1的上清以體積比3:2:1:2的比例，加入懸浮培養的昆蟲Sf9細胞（總體積為300mL細胞培養液中加入3mL的rBV-M1、2mL的rBV-F1、1mL的rBV-NP1、2mL的rBV-HN1），感染時間為96小時；

感染后，將感染的細胞置于28℃、120r/min搖床培養；

在此培養過程中，結構蛋白在宿主細胞中分別表達后會自行組裝，組裝后的病毒樣顆粒會分泌到細胞培養上清中。

（2）新城疫病毒樣顆粒的純化

收集步驟（1）中的細胞培養上清，經8000r/min離心30分鐘后，可初步去除大的細胞碎片；

采用50kDa分子量截留的切向流濃縮管在3500r/min水平離心15分鐘，濃縮樣品再經過分子篩過濾和陰離子交換層析后得到純化的病毒樣顆粒樣品。

上述提純操作也可采用替代方案：采用不連續的20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心，此時濃縮樣品在20%和40%蔗糖層的中間會形成白色條帶，而桿狀病毒則沉淀于底部，其他小的雜蛋白會停留在頂層，收集白色條帶層即為純化的病毒樣顆粒樣品。

對純化后的病毒樣顆粒進行電子透射電鏡觀察，病毒樣顆粒形態如圖4所示。

同時，參照國家標準《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術》，對所制備的新城疫病毒樣顆粒進行血凝效價檢測，檢測結果顯示未純化的新城疫病毒樣顆粒血凝效價為2⁷，純化后的新城疫病毒樣顆粒血凝效價為2¹⁰，純化步驟可明顯提高樣品純度以及血凝效價濃度。

實施例4

本實施例就實施例3所制備的病毒樣顆粒作為疫苗使用時的免疫效果進行簡要評價。

（1）免疫方案

取30只SPF雞，隨機分3組，每組10羽；

實驗組：新城疫病毒樣顆粒，每羽注射100μL體積，其中包含有10μg的新城疫病毒樣顆粒（實施例3檢測結果表明，10μg新城疫病毒樣顆粒的血凝效價為2⁹）；

陽性對照組：新城疫病毒NA-1株經紫外射線滅活，每羽注射100μL體積，其中血凝效價為2⁹；

陰性對照組：生理鹽水，100μL/只；

7日齡首免（胸部肌肉注射），間隔7周加強免疫一次。

（2）血凝抑制試驗

從免疫后第一周開始，每隔一周翅下靜脈采血，分離血清，-20℃保存備用。

參照國家標準《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術》，以新城疫血凝抑制試驗陽性抗原作為檢測抗原，倍比稀釋血清樣品后，加入25μL四單位抗原等體積混合，于37℃作用30分鐘，再加入25μL的1%雞紅細胞，冰上作用40分鐘，HI效價為發生紅細胞完全凝集抑制的最高血清稀釋倍數。

結果如圖5所示，實驗組和陽性對照組的血凝抑制效價呈明顯上升趨勢，于免疫后第3周達到峰值，第7周低于臨界保護值（血凝抑制效價4log2為評價新城疫疫苗免疫效果的臨界保護值）時進行加強免疫一次，血凝抑制效價又開始上升，經歷6周后，其效價維持在臨界保護值附近。

（3）免疫保護試驗

在免疫后第16周，采用新城疫病毒NA-1株對實驗雞群進行攻毒，具體是將新城疫病毒NA-1株通過滴鼻途徑感染雞群，之后在10天期間觀察雞群的存活情況。

結果如圖6所示，實驗組和陽性對照組未出現雞死亡，即存活率為100%，而陰性對照組（X形）在第5天死亡6只和第6天死亡4只，即存活率為0%。

綜上所述，本發明專利設計和制備的新城疫病毒樣顆粒可以刺激雞體產生有效的抗體效價，并且可以保護雞群免受活病毒的攻擊，存活率達100%。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大學

<120> 一種新城疫病毒樣顆粒、制備方法及其應用

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1094

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggactcat ctaggactat tggactctac ttcgactccg ccctcccctc gtcttcgctg 60

ttggcattcc cgattgtttt gcaggatacc ggtgacggca agaaacagat cactcctcaa 120

taccgcattc agcgtctgga tagctggacc gactctaagg aagattcagt cttcatcacc 180

acttacggct tcatcttcca aattggaaac gaggaagcca ctgttggcgt gattaacgat 240

aaccctcgcc acgagctgct ctccagcgct atgctctgct tgggtagcgt gcccaacgac 300

ggcgatctgg tcgaactcgc tcgcgcctgt ctgaccatgg tggtcactcg taagaaatct 360

gctacaaaca cggagaggat cgtcttctca gttgtgcaag cacccagagt gctccagagt 420

tgcatggtcg ttgccaaccg ctactcttca gtgaacgctg tcaagcatgt taaagcccca 480

gagaagatcc cgggatcggg caccctcgaa tacaaagtga acttcgtcag tttgactgtg 540

gtcccacgcc gtgacgtgta ccgcatcccg actgctgttc tgaaagtgag cggaagttcg 600

ctctacaacc tggctctcaa cgtcacaatt gacgtcgatg ttgaccctaa gtctcccttg 660

gtgaagtcac tgagtaaatc ggattccggt tactacgcaa acttgttcct gcacatcggc 720

ctgatggcta cagttgacaa gaaaggaaag aaagtgacgt tcgataagat cgaggaaaaa 780

attaggagac tcaacttgag tgtcggactc tcggacgttt tgggtccatc agtgctggtc 840

aaggcaaggg gtgcgagaac aaaattgctg gctccgttct tctccagctc tggcacggcc 900

tgttacccta tcgcaaacgc gtccccccaa gtcgcaaaga ttttgtggtc ccagaccgcg 960

cacctgcgta gcgttaaggt gatcattcaa gctggtacac agagggctgt cgctgttacg 1020

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<213> 人工合成

<400> 2

atgggttcga agccatccac ccgcatccca gctccgctca tgttgatcac tcgtattatg 60

ctgatcctcg gatgcatccg cttgacctcc agcctggacg gtcgtcctct ggctgccgca 120

ggcatcgtgg tcactggaga taaggctgtc aacgtttaca cctcttcaca gactggctca 180

atcattgtca aactgctccc taacatgccc aaggacaaag aggcctgtgc aagggcgcca 240

ttggaagcct acaacagaac actgaccact ttgctgacgc cgctcggtga ctcaattagg 300

aagatccagg gatccgtgag cacctctggt ggccgccgtc aaaaaagatt cattggagct 360

gttatcggta gtgtggcact gggagtcgcg acagcggctc aaatcacggc cgcagcggct 420

ctgattcagg ctaaccaaaa cgccgcaaac attctccgca tcaaggaatc catcgcggct 480

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<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工合成

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atcgatagga tttacaagca agtcgcgctc gaaagcccct tggctttgct gaacacggag 300

tctatcatta tgaacgccat caccagcctg tcttaccaga ttaacggagc ggctaacaac 360

tctggttgcg gcgtccctgt tcatgacccc gattacatcg gtggcattgg caaggaattc 420

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catagtcacc agtacttggc cctgggagtt ctcaggacat ctgcaacggg tagagtgttc 660

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gattacaagt ccattacccc aactagcatg gtccatggca ggttgggatt cgacggacag 840

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