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一種新城疫病毒樣顆粒、制備方法及其應用與流程

文檔序號:12411565閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種新城疫病毒樣顆粒,其特征在于,由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行組裝形成的空心化結構的蛋白顆粒;其中M蛋白對應的M1基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示,F蛋白對應的F1基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示,NP蛋白對應的NP1基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示,HN蛋白對應的HN1基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

2.權利要求1所述新城疫病毒樣顆粒在預防禽新城疫病毒感染滅活疫苗中的應用。

3.權利要求1所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:

(1)人工合成各結構蛋白基因序列,即分別人工合成SEQ ID NO.1~4所示的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的堿基序列;

(2)構建表達新城疫病毒結構蛋白的重組桿狀病毒,具體為,

將步驟(1)中的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分別克隆至轉移載體pFastBac1中,獲得重組質粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1;

將重組質粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1分別轉化Escherichia coli DH10 Bac 感受態細胞,篩選獲得重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1;

利用脂質體介導轉染法,將重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1分別轉染宿主Sf9昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1;

(3)新城疫病毒樣顆粒的制備和純化,具體為,

將重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1共接種感染宿主Sf9昆蟲細胞,四種結構蛋白在表達并自行組裝后,所形成的病毒樣顆粒會分泌到細胞培養上清中,經離心去除細胞碎片,切向流濃縮,再經分子篩過濾和陰離子交換層析后得到純化的病毒樣顆粒。

4.如權利要求3所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,重組桿狀病毒共接種感染宿主Sf9昆蟲細胞時,含有重組桿病毒的溶液體積比為:rBV-M1:rBV-F1:rBV-NP1:rBV-HN1=3:2:1:2。

5.如權利要求3所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,切向流濃縮操作時,采用50kDa分子量截留的切向流濃縮管在3500r/min水平離心15分鐘。

6.如權利要求3所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,提純操作時,采用不連續的20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心方法,替代分子篩過濾和陰離子交換層析操作。

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